Az immunrendszer sejtjeinek funkcionális vizsgálata (2.)

Az elsődleges antigén-ellenanyg kapcsolódáson alapuló

immunológiai módszerek (ELISA)

MHC tipizálás

Hiperszenzitivitási reakciók

(a diasorhoz tartoznak a FIG4(T-APC).MPG (998KB) és a pro5.exe (4414KB) animációkat tartalmazó fájlok)

Az immunoesszék érzékenysége

A T- és B-limfociták funkcionális aktivitásának mérése

1. A T- és B-sejtek poliklonális aktivációja a TCR vagy a BCR nem antigén-specifikus aktivációjával

lektinek által indukált aktivációα-IgM, α-CD3 vagy α-TCR ellenanyaggal, allogén T-sejt aktiváció(korai aktiváció: intracelluláris események vizsgálata)2. Az aktivációt követő T- és B-sejt válasz jellemzése

aktivációs markerekproliferatív válasz 3H-timidin beépülés

CFSE fluoreszcencia feleződéssejtciklus vizsgálata

Ellenanyag és/vagy citokin termelés (ELISA, CBA)

3. Az aktivált T- és B-sejtek számának meghatározása az antigén hatás után

ELISPOTIntracelluláris citokin festésPentamer (vagy tetramer) technikaPentamer (vagy tetramer) technika

Témák:

A humorális immunválasz szakaszai

felismerés aktiváció, proliferáció, differenciáció

Nyugvó IgM+, IgD+ érett B-sejt

AntigénAktivált

B-sejt

Segítő T-sejt,más stimulus

Klonálisexpanzió

B-sejt

Nagy affinitásúIg-t expresszáló

B-sejt

Nagy affinitásúIgG

MemóriaB-sejt

Affinitásérés

Izotípusváltás

Antitesttermelés

IgG-t expresszáló

A T-sejt válasz szakaszai

Antigénfelismerés

Klonális expanzió

Differenciáció Effektorfunkciók

NaívCD8+

T-sejt

NaívCD4+

T-sejt

Citokinek(pl. IL-2)

Citokinek(pl. IL-2)

Nyirokszervek Perifériás szövetek

CD4+ EffektorT-sejt

CD8+ EffektorT-sejt (CTL)

CD4+ MemóriaT-sejt

Aktiváció

CD8+ MemóriaT-sejt

Makrofágok, B-sejtek,

más sejtek aktivációja

Fertőzötttarget sejtek

ölése,makrofágaktiváció

B-sejt receptor komplex általi jelátvitelMembrán Ig

keresztkötéseantigénnel

Tirozinfoszforiláció

Biokémiaiintermedierek

Aktív enzimek

Transzkripciósfaktorok

PLCaktiváció

Emelkedettic Ca2+

Ca2+ dependens enzimek

Diacilglicerol

GTP/GDP cserea Ras-on, Rac-on

T-sejt receptor komplex általi jelátvitel

Az áttekintett folyamatok többsége lépéseiben vizsgálható

TCR mediáltjelek

indítása

Biokémiaiintermedierek

Késői jelátvitelenzimei

Transzkripciósfaktorok

kalcineurin MAP kinázok

Diacilglicerol

GTP/GDP cserea Ras-on

PLC1aktiváció

Adapterfehérjék

T sejt

Emelkedett ic Ca2+

Poliklonális T-/B-sejt aktivációt kiváltó anyagokkal, és módszerekkel végezhető el a sejtek funkcionális vizsgálata.

Az immundeficienciák nagy része különböző funkcionális vizsgálatokkal mutathatók ki.

Az antigénnel való aktiválás technikailag nehezen lenne kivitelezhető, mert az antigén-specifikus T- és B-sejtek

gyakorisága kicsi.

A limfociták poliklonális aktivációja LPS, lektinek, PMA+Ionomycin jelenlétében

B-sejt (egér) T-sejt T-sejt

BCR vagy TCR-specifikus ellenanyagok is a megfelelő sejtek poliklonális aktivációját okozzák

LPS a TLR4-en keresztül aktiválja a sejteket

A lektinek (pl. Con A, PHA) szénhidrát kötő fehérjék.

A sejtfelszíni glikozilált receptorok keresztkötésével

aktiválják a sejteket.

Az Ionomycin a külső Ca2+ ionok beengedésével aktiválja

a sejteket, szinergizálva a protein kináz C-hez kötődő

PMA-val

TLR4

Poliklonális B-sejt aktivátorok és hatásaikAktivátor T-sejt függés Ig szekréció

Humán B-sejt

PWM (pokeweed mitogen) nincs van

SpA (szuperantigén, staphylococcus protein A) nincs van

EBV (transzformáló hatású is) van van

Anti-Ig van citokinek jelenlétében

Egér B-sejt

LPS nincs van

PWM van van

PPD (purified protein derivate, mikobakteriumból) nincs van

Anti-Ig nincs citokinek jelenlétében

Poliklonális T-sejt aktivátorokPhytohaemagglutinin (PHA) lektin Canavalia ensiformis

Concanavalin A (ConA) lektin Phaseolus vulgaris

anti-CD3 monoklonális ellenanyag

Receptorok ligand általi aktivációja(„keresztkötés”)

(pillanatszerű)

foszforilációs lépések(másodpercek-percek)

- Western blot- Bead array

ic Ca2+ szint emelkedés

- FACS, mikroszkópia

Génaktiváció - RT-PCR

Citokin szintézis

Citokin szekréció

- IC citometria

- ELISA, ELISPOT- Bioassay

Ez történik az antigénreceptorokkal (TCR, BCR), és sok más receptorral is (citokinreceptorok)

Sejtciklusba lépés/apoptózis - DNS tartalom- IN antigének

Sejtosztódás - 3H-timidin, CFSE, MTTA limfociták aktivációjának főbb folyamatai, és azok vizsgálata

Vizsgálatuk gyakran a specifikus antigén-ellenanyag kapcsolódáson

alapul

- FRET

A jelenlevő vagy termelt „antigének” (fehérjék, citokinek, ellenanyagok, ….)

vizsgálata

ELISA

ELISA plate (lemez)

Enzyme Linked Immune Sorbent Assay

lyuk avagy kút

Különböző lemezek – speciális felület kezelés ellenanyag, peptid kötésre

enzyme linked immune sorbent

ellenanyaghoz konjugált enzim

enzim

felülethez, vagy ellenanyagokhoz kötődő antigének/ellenanyagok

Az ELISA vizsgálatban az antigén mennyiségével arányos mértékű az enzimaktivitás

Az enzimaktivitás mértékére a katalizált színreakció mértékéből következtethetünk

Hasonló elméleti alapokon nyugszik az összes elsődleges antigén-ellenanyag kölcsönhatáson alapuló immunoassay

Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusaihasznált módszerek alaptípusai

(szempontok: hatékonyság, érzékenység, kényelem, megbízhatóság, ár)

Direkt módszer Indirekt módszer

Felület

Antigén

Primer ellenanyag

Jelzés

Jelzés

Szekunder ellenanyagok

egyszerűség több jel nagyobb érzékenység

Az ELISA, immunhisztokémia, citometria Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusaisorán használt módszerek alaptípusai

Enzim-antienzim rendszer(leginkább mikroszkópos immunhisztokémiában lehet találkozni vele)

PAP – peroxidáz / anti-peroxidázAPAAP – alkalikus foszfatáz / anti-alkalikus foszfatáz

Antigén

Primer ellenanyag

Szekunder ellenanyagok

A primer ellenanyaggal azonos (izo)típusú enzim-specifikus

ellenanyagok

Enzimek

Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusai

Biotin-avidin rendszerrel kombinált indirekt módszerekAz avidin nagy affinitással képes a biotint kötni

Egyszerű ABC

Antigén

Biotinált ellenanyag

Avidin

Avidin-enzim komplexek

Biotin-enzim komplex

Avidin Biotin enzimComplexek

(arányok!!! mint a precipitációnál)

Jel felerősítése

A különféle direkt-indirekt, biotin-avidin A különféle direkt-indirekt, biotin-avidin rendszereket összekombinálva is használják.rendszereket összekombinálva is használják.

Lásd a következő példákat. Lásd a következő példákat.

Az ELISA rendszerek nem csak a vizsgált anyag jelenlétének a kimutatására, hanem ismert

koncentrációjú sztenderdek segítségével a pontos mennyiség meghatározására is alkalmasak

Bioaktív anyagok kimutatása

hCG (human coriogonadotropin) – terhességi tesztek

doppingvizsgálatok: EPO (erithropoetin), szteroid származékok kimutatása

szendvics technikával vagy kompetíciós tesztekkel

Tumor antigének kimutatásaCitokinek, hormonok kimutatása

kombinált „szendvics” ELISA

Kis koncentrációjú antigének (pl. citokinek, hormonok) kimutatása szendvics technikával. Szérumok, nem tiszta oldatok vagy keverékek esetén is ez használható (pl. szérum, liquor, szennyvíz).

A nem kötődő anyagok kimosása

telítés: a szabad plasztikfelület beborítása

aspecifikus fehérjével

felesleges fehérjék kimosása

eltérő antigén determinánst felismerő biotinilált

ellenanyagok hozzáadása

felesleges ellenanyagok kimosása

avidinnel konjugált enzim hozzáadása

színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása

citokin specifikus ”capture” ellenanyagok

kitapasztása

citokintartalmú minta hozzáadása

felesleges konjugátum kimosása

Tumordiagnosztika

A tumor specifikus (TSA,TSTA) és tumor asszociált (TAA) antigéneket felismerő ellenanyagok felhasználhatóak a diagnosztikában

Szendvics technikával ezek az antigének kimutathatóak

Tumor antigén (pl. a beteg szérumából)

Tumor Ag specifikusdetektor/reporter

ellenanyag (a kit része)

Tumor Ag specifikuscsapda ellenanyaggal

fedett felület (a kit része)

Prosztata daganatok• prosztata-specifikus antigén (PSA): Szérum koncentrációja magas a prosztata rákos, benignus prosztata hipertrófiás és prosztatitiszes páciensekben. A PSA szérum szintje korrelál a prosztata daganat méretével és a klinikai állapotával.• Hasonlóan használható fel a prosztataspecifikus savas foszfatáz (PAP) mennyiségi kimutatása a szérumból

Hólyagrák:Az epiteliális sejtek NMP22 nukleáris mátrix proteinje egészséges emberekben csak kis mennyiségben található meg a vizeletben → megemelkedése diagnosztikus marker

Pajzsmirigy daganatok:A szérum tiroglobulin (hTG) megemelkedett szintje diagnosztikus marker

Alpha Fetoprotein (AFP) : 68kD-os protein, amit az embrionális máj és szikzacskó termel. Megjelenhet az anya szérumában is (transzplacentális transzfer). Születés utáni egy év alatt alacsony szérumszintre csökken le (<9ng/ml). Magasabb koncentrációja hepatómával, ovariális-, tesztikuláris- és preszakrális teratokarcinómákkal, de egyéb daganatokkal is összefüggésben lehet.

Carcinoembryonic Antigen (CEA) sejtadhézióban vesz részt. Normális esetben csak az embrionális fejlődés során van jelen. Colorectális és egyéb carcinomát hordozó egyénekben megemelkedik a szérumszintje. Változásának nyomon követésével következtetni lehet a terápia hatékonyságára.

Her-2/neu protein:185 kD-os transzmembrán glikoprotein, tirozin kináz receptor. Az emlődaganatok 20-30%-ban a tumorsejtek megemelkedett mértékben expresszálják. Immunterápia során a működése blokkolható specifikus ellenanyaggal (Herceptin), ezért jelenlétét immunhisztokémiával, vagy immunfluoreszcenciás eljárással mutatják ki biopsziás mintákban.

egyszerű indirekt ELISA lépéseiAntigén specifikus ellenanyag kimutatásához

az antigén kitapasztása(coating avagy fedés)

felesleges antigén kimosásatelítés: a szabad plasztikfelület

beborítása aspecifikus fehérjével

felesleges fehérjék kimosása

specifikus ellenanyagok hozzáadása

Enzimmel konjugált szekunder ellenanyagok

hozzáadása

felesleges ellenanyagok kimosása

színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása

Példa: HIV fertőzöttség diagnosztikája a páciensben megjelenő HIV specifikus ellenanyagok kimutatásával - rekombináns HIV fehérje, vagy annak megfelelő szintetikus peptid

segítségével

HIV burokfehérje, vagy nagy méretű szintetikus peptid

Fertőzések diagnosztikája

Mivel szabad vírus antigének és vírus részecskék nem minden esetben detektálhatóak kellő hatékonysággal (pl. látencia), ezért helyette inkább a szervezetben képződött vírus specifikus ellenanyagokat mutatják ki a fertőzés diagnosztizálásakor.

vírus antigénnel fedett ELISA lemezek készen kaphatóak

a fertőzött személy szérumában található vírus specifikus ellenanyagok hozzákötnek az antigénhez

emberi Ig specifikus jelölt ellenanyagok jelzik a specifikus ellenanyagok jelenlétét

ilyen elven működik:• Epstein-Barr Virus (EBV) teszt kit → EBNA-1 (EBV nukleáris antigén) segítségével mutatják ki az ellene termelt IgG-t• HIV diagnosztikai kitben → rekombináns HIV antigénnel anti-HIV antitestek kimutatása vérből, plazmából, szérumból vagy akár beszáradt vérfoltból• Toxoplazmózis (Toxoplazma gondii – egysejtű parazita) → Toxoplazma elleni IgM kimutatásA toxoplazmózis terhesség során veszélyes akkor, ha az anya elsődleges fertőzésben szenved. Ekkor IgM típusú ellenanyagok termelődnek a fertőzés hatására, melyek transzplacentálisan nem szállítódnak és ezzel nem nyújtanak védelmet a magzat számára.

AutoimmunitásA különféle autoimmun folyamatokban megjelenő autoantitesteket is hasonló módszerekkel detektálják

Pl.SLE (szisztémás lupus erythematosus): Immunkomplex betegség, melyben

számos autoantigén ellen kimutathatóak autoantitestek. A leggyakoribb anitest a kettős szálú DNS elleni antitest (az SLE-ben szenvedő betegek 60%-ában kimutatható).

I típusú (autoimmun) diabetesz diagnosztikája a sziget sejt antigének elleni autoantitestek kimutatásával ELISA vizsgálat segítségével:

• glutaminsav dekarboxiláz (GAD65): a prediabetikus személyek 70-90% -ban és a diabetikus betegekben specifikus ellenanyagot találni ellene

• IA-2 (tirosine foszfatáz-szerű protein): az I típusú diabeteszes betegek 50-75% -ban és közvetlenül a betegség megjelenése előtti állapotban specifikus ellenanyagot találni. Ilyen ellenanyagok megtalálhatóak egyes GAD ellenanyag negatív személyekben is, ezért független diabetesz markernek tekinthető.

• inzulin: a legfőképp de nem kizárólagosan autoimmun diabeteszes fiatal gyermekekben (<5 éves) találni ellenanyagot, (megemlítendő, hogy ezek az ellenanyagok nem megkülönböztethetőek azoktól, melyek az inzulin terápia során a szervezetben termelődnek)

Szérum ellenanyag izotípusok meghatározása

A szervezetben jelenlevő antigén specifikus ellenanyagok utalnak az antigén jelenlétére (lásd pl. vírusfertőzések diagnosztikájánál).Az így kimutatott ellenanyagok izotípusa utalhat arra, hogy friss, perzisztáló fetőzésről (IgM ellenanyag dominancia), vagy korábbi fertőzést követő memória válasz eredményéről van-e szó (IgG ellenanyag dominancia).Anti-izotípus specifikus ellenanyagokkal ez eldönthető.

Antigén

IgM IgG

anti-IgM anti-IgG

Memória válasz

Megemelkedett szérum IgE szintet tapasztalni atópia esetén, bizonyos autoimmun betegségekben, és egyes parazita fertőzések esetében

Egyes immundeficienciákban az ellenanyag alosztályok koncentrációja eltér a normálistól (hiper IgM szindróma)

ellenanyag capture-ellenanyag

a szérum ellenanyaga

izotípus specifikus ellenanyag

kompetitív ELISAÉrzékenysége miatt szolubilis fázisban levő kis mennyiségű antigén kimutatásához használják. A mintában jelenlevő ismeretlen mennyiségű oldott antigén hozzáköt az ellenanyagokhoz, és így gátolja azok hozzákötődését a rendelkezésre álló, korábban a szilárd fázishoz tapasztott tisztított antigénhez.

- A tisztított antigén kitapasztása a szilárd fázishoz és blokkolás

- Az ismeretlen mennyiségű, szolubilis antigént tartalmazó vagy nem tartalmazó minta hozzáadása

-Jelölt ellenanyag hozzáadása, kötődés

- Mosás

- Kromogén anyagok hozzáadása

Gyakran használják kis méretű antigének, vagy haptének esetében. Ha kevés az antigénen a hozzáférhető epitop, a szendvics ELIZÁban lefoglalja ezeket az első „capture” ellenanyag.

A színreakció itt fordított: több oldott antigén = halványabb szín

ELISA alaptípusok (összefoglalás)

egyszerű capture/szendvics

antigén

Ag specifikusellenanyag

detektor/reporterellenanyag

kompetitív

pl. antigén specifikus ellenanyagok kimutatásához

antigén

Ag specifikuscapture ellenanyag

Ag specifikusdetektor/reporter

ellenanyag

antigének kimutatásához

az oldatban jelen van a kimutatandó Ag

Ag specifikusellenanyag

kis mennyiségű, kis méretű antigén kimutatásához (elég ha ha csak egyféle specifikus ellenanyaggal rendelkezünk)

antigén

nincs jelen oldott Ag

Aspecifikus kitapadásból eredő hiba

A fehérjék aspecifikus kitapadása csökkenthető:

•telítéssel/blokkolással•detergens alkalmazásával

ELISA hibák

Az antigén mellett a plasztik felületrekitapadhatnak maguk az ellenanyagok is

- akár közvetlenül

- akár indirekten

a színreakció ugyan az

hook effect! – nagy koncentráció vagy kevés mosás miatt

Elkészült ELISA lemezekElkészült ELISA lemezek

pl. Human Chorio-Gonadotropin kimutatása szérumból vagy vizeletből

(terhességi teszt)

Ezek az eszközök is az ELISA esetében már megismert elsődleges antigén-ellenanyag specifikus kapcsolódását

kihasználó technikán alapulnak!

Diagnosztikai gyorstesztek:

hCG kimutatása immunkromatográfiás tesztcsíkkal

nitrocellulóz membrán

jelölt ellenanyagokkal átitatott üvegfilter(A jelzés szabad szemmel is látható!)

elölnézet oldalnézet

hCG csapda ellenanyag sáv

kontroll ellenanyag sáv

abszorbciós rész (cellulóz, papír)

abszorbciós lap, mintafelviteli rész

vizeletminta

hCG csapda ellenanyag sáv

kontroll ellenanyag sáv

jelölt ellenanyagok

hCG

kontroll sáv

teszt sáv

van hCG nincs hCG

a jelölt ellenanyagra specifikus

ellenanyagok

Elvben a szendvics ELISÁra hasonlít

hCG sáv( kikötött hCG)

kontroll ellenanyag sáv

a jelölt ellenanyagra specifikus ellenanyagok

kontroll sáv

teszt sáv

van hCG nincs hCG

Ugyanez kompetitív rendszerben

A kompetitív ELISA elve hasonló

Az ellenanyagon található jelzés szabad szemmel is megfigyelhető, így nincs szükség enzimes folyamatokra, és egyéb reagensekre:•kolloidális arany („surface plasmon” rezonancia színek)

•festékkel töltött latex gyöngyök

Pl.: kompetitív immunkromatográfiás tesztcsíkok aflatoxin detektálására

Az eljárás szemikvantitatívá tehető

Immunkromatográfiás tesztcsík egyéb felhasználási lehetőségei:

élelmiszervizsgálat során toxinok kimutatása

ELISPOTEnzyme Linked Immuno-Spot

• Elve hasonlít az ELISA-hoz• Eredetileg az ellenanyagot szekretáló B-sejtek számának

meghatározására szolgált.• Ma alkalmas egyéb szolubilis effektor molekulák, pl. citokinek,

kemokinek, granzim termelő sejtek számának meghatározására is.

• Egyaránt alkalmas poliklonális aktivátorok vagy antigén indukálta aktivációt követően az aktivált effektor sejtek számának meghatározására.

• Érzékenység: kb. 1 per 300 000 sejt• Az első lépéseit sejtkultúrában aszeptikus körülmények között

végzik.

ELISPOT- a capture ellenanyagok kitapasztása

- blokkolás

- a sejtek hozzáadása

- biotinnal konjugált másodlagos ellenanyag hozzáadása (például)

- avidin-enzim konjugátum

- oldhatatlan kromogén szubsztrát hozzáadása (AEC 3-amino-9-etilkarbazol)

(aktiválás, inkubáció)

- mosás

A citokin termlő sejt helyét mutató folt

Az ELISPOT lemez egy lukának felülnézete a képződött foltokkal

A mérés menete

Leolvasása mikroszkóppal (lassú, manuális munka) vagy “ELISPOT plate reader” segítségével (gyors + standardizálható spot szám és méret meghatározás)

A spotok száma az ellenanyag vagy citokin termelő sejtek számát mutatja

A spotok mérete arányos az ellenanyag vagy citokin termelő képességgel

A spotok által elfoglalt összterület mindkét paramétert egyesíti, a számítógépes szoftver mindkettőt figyelembe veszi

Western blotWestern blot

Fehérjekeverékek egyes (pl. sejt lizátumok) komponenseinek ellenanyag segítségével történő

specifikus kimutatására alkalmas.Azok tulajdonságai (pl. foszforilációs állapota) is

vizsgálható vele.

• Az aktiválás utáni különböző időpontokban „befagyasztható” a Az aktiválás utáni különböző időpontokban „befagyasztható” a sejtek állapota (lízis puffer, és enzim-inhibítorok hozzáadása), így sejtek állapota (lízis puffer, és enzim-inhibítorok hozzáadása), így vizsgálhatóak pl. a sejtaktiváció foszforilációs eseményeivizsgálhatóak pl. a sejtaktiváció foszforilációs eseményei

sok, legalább 106 sejt szükséges a vizsgálathoz

A fehérjék SDS-PAGE-enelektroforetikus mobilitásuk alapján „méret” szerint szétválaszthatók (dot-blot vagy slot-blot esetén nincs szétválasztás)A hozzávatőleges méretet ismert méretű standard fehérje keverék egyidejű futtatásával meghatározhatjuk.

Specifikus ellenanyaggal mutatható ki a keresett fehérje sávja a többi sáv között, (vagy anti-foszfotirozin elleanyaggal a foszforilált fehérjék sávja)

A kezelhetőség érdekében a szétválasztott fehérje sávokat membránra viszik át(PVDF, nirocellulóz)

Membránhoz való hibridizálást követően a vizsgált fehérje kimutatása specifikus ellenanyaggal történik:

• enzimmel konjugált ellenanyag• indirekt módszer (primer és szekunder ellenanyagok)

StandardProtein minta

SDS-PAGE Membrán Western blot

Fehérje detektálás specifikus ellenanyag-epitóp kölcsönhatás alapján

Western Blot

pl. aktivált T sejtek foszfotirozin és Zap-70 blotjapl. aktivált T sejtek foszfotirozin és Zap-70 blotja

aktiválatlan ConA PHA

A membrán az anti P-Y ellenanyagok elúciója után anti ZAP-70 ellenanyagokkal is megjelölhető, így azonosítható a ZAP-70 foszforilációs állapota a sejtekben

Y P-Y P-Y

P-Y blot

A pozitív HIV tesztet megerősítő WB vizsgálati módszerek:

Western-blot:HIV-1 fertőzött CEM sejtvonal (T-sejt vonal) antigénjeinek Western-blotja.Az antigéneket tartalmazó blot-membránt a vizsgálandó szérummal inkubálják.A fertőzött személy szérumában található anti-HIV ellenanyag specifikus sávot (sávokat) eredményez a bloton. Legalább két burokfehérjét, vagy egy burokfehérjét és a p24 antigént kimutató sáv jelenléte esetén tekintik pozitívnak.

Fab

Fc

Epitóp a protein felszínén

Primer ellenanyag

Szekunder ellenanyag

Torma- peroxidáz

Immobilizált proteinek

Membrán

H2O2

H2O

luminol

enhancer

h

Detektálás

Megnövelt kemilumineszcencia/Enhanced chemiluminescence (ECL)/

• H2O2 jelenlétében a torma-peroxidáz (HRP) oxidálja a diacilhidrazidokat (pl luminol)• Az oxidáció hatására a luminol gerjesztett állapotba kerül és egy fotont bocsát ki, hogy visszatérjen az alapállapotba• A kibocsátott foton fényérzékeny filmmel, vagy kamerával detektálható• A fénykibocsátás fenol vázzal rendelkező molekulák (pl 6-hidroxi-benzothiazol) jelenlétében körülbelül 1000-szeresére növelhető (enhancer)

luminol

„Nagy szélességű” v. „nagy áteresztőképességű” (brute-force v. high throughput) citokin vizsgálatok

(1. )

(proteomika?)

Cytokine arrayCytokine array

A Western-blot blotolási lépését követő részére hasonlít

( - )

IFN

( + ) IL-2 IL-4 …

…

MIP3β …

különféle kikötött specifikus ellenanyagok

Vizsgálandó citokin tartalmú oldat

Jelzett ellenanyagok keveréke

Sokféle citokin gyors meghatározására alkalmas

Hátrány – a blot memrán nagy felülete miatt viszonylag nagy térfogatú/hígított mintára van szükség

CD40L ésCD40L+SLAM kombinációvalaktivált moDC citokin termelése

Réthi és mtsi. 2006

Immunhisztokémia / Immunfluoreszcencia• Szöveti vagy sejthez kötött komponenseket mutathatunk ki specifikus AG- EA reakció alapján. (a fixált szövetmetszet szilárd fázisnak felel meg.)• Fixálás: A minta átjárható legyen és az Ag determinánsok ne károsodjanak paraformaldehid, glutáraldehid – kémiai keresztkötésekalkoholok – vízelvonó szer (szövettípustól és az antigéntől függően)• Jelzéssel ellátott, antigén-specifikus ellenanyag mutatja meg az antigént a szövettani metszetben, vagy a sejtszuszpenzióban

• Immunfluoreszcencia• fluoreszcensen jelzett ellenanyag – fluoreszcens mikroszkóp

FITC – fluoreszcein izotiocianátPE – fikoeritrin, stb.

• Immunoenzim módszer• enzimmel konjugált ellenanyag

P – peroxidázPA – alkalikus foszfatáz(a szubsztátból oldhatatlan, színes

csapadékot képeznek)

Fluoreszcens immunhisztokémia (TRITC)Aktin mikrofilamentek kimutatása

Szövetminta

FIXÁLÁS

Festés előtti metszetFAGYASZTÁS

METSZÉS

IMMUNHISZTOKÉMIA

„FESTÉS” - rácseppentett reagensekkel

ImmunhisztokémiaABC Technika (lásd a korábbi diát is)

Secunder antitest

Avidin

Szövetmetszet

Sejtek (sejttenyészetek)

Tárgylemez

Primer antitest

Biotin

Enzim

X

normál hisztokémia (nem immun)

Acute bronchopneumonia (hematoxilin- eozin festés)

Immunhisztokémia(CD68+ makrofágok és limfociták által képzett granulóma)

Fluoreszcens immunhisztokémia (TRITC)Aktin mikrofilamentek kimutatása

Fixált és permeabilizált bőr fibroblaszt. A mitokondriumok kimutatásához egér IgG-t (anti–OxPhos Komplex V) és Alexa Fluor 555 festékkel konjugált kecske anti-egér IgG-t használtak. Az F-actin jelölése Alexa Fluor 488 festékkel konjugáltphalloidinnel (gombatoxin) történt, a sejtmagot TO-PRO-3 jodiddal festették meg.

A pozitív HIV tesztet megerősítő vizsgálati módszerek:

Western-blot (lásd a korábbi dián)HIV-1 fertőzött CEM sejtvonal (T-sejt vonal) antigénjeinek Western-blotja.Az antigéneket tartalmazó blot-membránt a vizsgálandó szérummal inkubálják.A fertőzött személy szérumában található anti-HIV ellenanyag specifikus sávot (sávokat) eredményez a bloton. Legalább két burokfehérjét, vagy egy burokfehérjét és a p24 antigént kimutató sáv jelenléte esetén tekintik pozitívnak.

Immunfluoreszcens vizsgálat:A teszt immortalizált, HIV-1 antigéneket expresszáló T sejt vonalat használ. A sejteket tárgylemezre fixálják, és a vizsgálandó szérummal inkubálják, majd humán Ig specifikus fluoreszcensen jelölt másodlagos ellenanyagokkal jelölik. Negatív kontrollként nem fertőzött sejtvonalat használnak. A festődés mértékét és mintázatát összevetve a kontrollal erősítik meg a fertőzöttséget.

Antinukleáris (ANA) ellenanyagok kimutatása SLE-s személy szérumából, sejtkultúrában, immunofluoreszcencia segítségével (indirekt jelölés)

Autoimmunitás immunfluoreszcens diagnosztikája

A különféle autoimmun folyamatokban megjelenő autoantitesteket is ki lehet mutatni

A termelődött citokinek intracelluláris kimutatásaimmunfluorimetriával

jelzéssel ellátott citokin-specifikus ellenanyag

- a sejtmembránt detergenssel átjárhatóvá kell tenni

- de előtte a sejteket fixálni kell, hogy ne essenek szét a detergenstől (pl. aldehides fixáció)

citokinek

- előzőleg a sejtek valamilyen, a sejttípusra jellemző antigént

felismerő ellenanyaggal is megjelölhetők

(„sejttípus marker” pl. CD4)

Eredmény:

Megtudható az is belőle, hogy milyen sejttípusok termelték a citokineket!

Érzékenysége elérheti a Western blot-ét(pl. hűtött CCD kamerás mikroszkóppal– akár egyetlen sejt is elegendő lehet a vizsgálathoz)

Citokinekre érzékeny (citokin szenzitív), vagy csak citokinek jelenlétében túlélni/osztódni képes (citokin dependens) sejtvonalak segítségével a

jelenlevő citokinek nagy érzékenységgel kimutathatók.

BioassayBioassay

pl. Wehi 164 sejtek

pl. CTLL2 sejtek

van IL-2 nincs IL-2

van TNF nincs TNF

Bizonytalanná teheti a kapott eredményt, hogy a sejtek nem biztos, hogy csak az adott citokinre reagálnak. Pl. a CTLL2 sejtvonalra az IL4 hasonló hatást fejt ki, mint az IL2.

A sejtek túlélését kolorimetriás eljárással (pl. MTT assay) vagy az osztódásuk kimutatásával (lásd később) mérhetjük meg.

citokinkoncentráció

IL-2

TNF

CTLL2CTLL2

Wehi 164Wehi 164

MTT assay:

„Nagy szélességű” v. „nagy áteresztőképességű” (brute-force v. high throughput) citokin vizsgálatok

(2.) (áramlási citométerrel)

(proteomika?)

Az eljárás kis térfogatokkal (5-20l) is működik, de műszerigényes.

CytometricCytometric/multiplex/multiplex bead array (CBA) bead array (CBA)A cyitokine array-hez hasonló alapelvű áramlási citometriás módszer.A citokineket itt nem a pozíciójuk, hanem különböző színintenzitású

gyöngyök azonosítják

CBA cytokine array

IL-2

IL-4

IL-8

…

…

IL-12 IL-23 IL-17 … …

A CBA elve és összehasonlítása a hagyományos ELISAvalA CBA elve és összehasonlítása a hagyományos ELISAval

Szendvics ELISA CBA

Cytometric/multiplex bead array (CBA)Cytometric/multiplex bead array (CBA)

IL-2capture ellenanyagok

IL-2

IL-4 IFN

IL-2 „reporter” ellenanyag

IL-8IL-1β

IL-6IL-12 IL-10

TNFα

Citokin mennyiség

Citokin standard hígítási sorozat

500pg/ml 250pg/ml 125pg/ml 62pg/ml 31pg/ml 16pg/ml 8pg/ml 0

A citokinek mennyiségére az eltérő színnel jelölt „reporter” ellenanyag fényintenzitásából következtethetünk

Az intracelluláris (citoplazmatikus) Ca2+ szint meghatározása

A citoplazmatikus Ca2+ koncentráció növekedése pl.

fluoreszcens indikátor festékekkel vizsgálható.

/Fluo-3 vagy az Indo-1/

példa – intracelluláris Ca2+ jel egy sejtben kimutatva:

antigén prezentáló B sejt T sejtet aktivál(klikk a képre)

B sejt

T sejt

(klikk a képre)

módszer: RT-PCR, QRT-PCR

A génaktiváció vizsgálataA génaktiváció vizsgálata

A sejtaktiváció az aktiválódó génekről átíródó mRNS segítségével is kimutatható

pl. citokin gének aktivációja

sejtek RNS izolálás

RNS (reverz transzkriptáz) cDNS

cDNS (PCR) hossz és mennyiség meghatározás

RT-PCR: agaróz gél (pl. denzitometria)QRT-PCR: fluoreszcens módszer(TaqMan probe (FRET) v. interkaláló fluorokróm SYBR green)

Sejtciklus

DNS mennyiség meghatározása(fluoreszcens DNS interkalátorok, 3H-timidin)

- transzkripció kimutatása (RT-PCR)

- fehérjék kimutatása (Immunoassay)

sejtszám változás meghatározása(CFSE)

a sejtciklusba lépő sejtek mérete megnövekszik = blasztos transzformáció

GG22

MMGG00

GG11

ss

0 200 400 600 800 1000

GG00GG11

ss GG22 MM

DNDNS analízis S analízis (pl.aneuploidia diagnosztikájához)(pl.aneuploidia diagnosztikájához)

DNS mennyiség

sejtszám

2N2N 4N4N

A sejtciklus vizsgálható a DNS mennyiség alapján, pl.

a DNS-be sztöhiometrikus módoninterkalálódó fluoreszcens festékekkel(propidium jodid, PI)

Egy sejtpopuláció sejtjeinek eloszlása DNS mennyiség alapján (áramlási citometriás ábra)

A B-/T-sejt proliferáció mérésére alkalmas módszerek

3H-jelölt timidin-beépülés a totál DNS-beépülést méri.Nem méri, hogy hány sejt hányszor osztódott(β-bomlás mérése).

A timidin-analóg bromodeoxyuridin (BrdU) alkalmazható kísérleti állatokban és sejtkultúrákban is. Az osztódó sejtek BrdU-specifikus ellenanyag felhasználásával kimutathatók(mikroszkópia, FACS).

Újabban a karboxifluoreszcein diacetát szukcinimidil észter, CFSE használata terjedt el.

A sejtosztódás meghatározásaA sejtosztódás meghatározásaA „Cell tracer” festékek bediffundálnak a sejtbe, és sokáig megőrződnek. Az apoláros CFSE kovalensen kötődik az intracelluláris fehérjékhez. Amikor az intracelluláris festéka két utódsejtbe szétosztódik, a fluoreszcencia intenzitás felére csökken.

sejtosztódások:7 6 5 4 3 2 1 0

T-sejtek funkcionális vizsgálataT-sejtek funkcionális vizsgálataAntigén specifikus T-sejtek azonosítása

immunizálás

Hasznos lehet pl. immunizálás eredményességének vizsgálatakor

antigén antigén specifikusspecifikus

T-sejtT-sejt

Ha a T-sejt receptorok specificitása meghatározható, akkor a Ha a T-sejt receptorok specificitása meghatározható, akkor a felszaporodott antigén specifikus T-sejtek kimutathatóak.felszaporodott antigén specifikus T-sejtek kimutathatóak.

T-sejt klónok ugyanolyan T-sejt receptorral

De az MHC kötődése a T-sejt receptorhoz kis affinitású

egy MHC molekula és egy MHC molekula és T-sejt receptor T-sejt receptor

kölcsönhatása nem kölcsönhatása nem elég erőselég erős

Megjelölt MHC-peptid komplex felhasználható a rá specifikus T-sejt receptor kimutatására

MHC

T-sejt receptorok

T-sejtT-sejt

Pentamer (vagy tetramer) technikaPentamer (vagy tetramer) technika

a létrejövő a létrejövő pentamerpentamer

self assembling coiled-coil-domain

MHC

peptid

fluoreszcens jelzés

a pentamer egyik alegysége

Multimerizált MHC-peptid komplex aviditása már kellően erős lehet.

peptid-specifikus

T-sejt

MHC pentamer

Az MHC pentamer kötődése a T-sejthez

Az MHC-peptid oligomer reakciója a specifikus T-sejt receptorokkal

nagy aviditású.

T-sejt receptorok

Ide kattints az animációhoz

MHC multimerek segítségével meghatározható az antigén-specifikus

T-sejtek száma, értékelhető pl. a vakcinák, vagy egy adott terápiás

eljárás hatékonysága.

MHC DextramerekMHC Dextramerek

CMV-specifikus T-sejtek normál HLA-A2 donorban

EBV BZLF-1 (RAKFKQLL/ HLA-B*0801)-specifikus T-sejtek

(a normál populáció 90-95%-a hordozó)

Influenza epitóp (GILGFVFTL/HLA-A0201)-specifikus T-sejtek

egészséges donorban

MHC multimer jelöléses példák

A perzisztáló (pl. herpeszvírusok) vagy visszatérő fertőzések miatt a specifikus T-sejtek száma viszonylag magas lehet

allél szekvencia Tumor (asszociált) epitop peptid eredeteA*0201 GVLVGVALI Carcinogenic Embryonic Antigen (CEA) 694-702

A*0201 LLGRNSFEV p53 261-269

A*0201 LLLLTVLTV MUC-1 12-20

A*0201 RLLQETELV HER-2/neu 689-697

A*0201 RMFPNAPYL Wilm's Tumour (WT1) 126-134

A*0201 SLLMWITQV NY-ESO-1 157-165

A*0201 STAPPVHNV MUC-1 950-958

A*0201 VISNDVCAQV Prostate Specific Antigen-1 (PSA-1) 154-163

A*0201 VLQELNVTV Leukocyte Proteinase-3 (Wegener's autoantigen) 169-177

A*0201 VLYRYGSFSV gp100 (pmel17) 476-485

A*0201 YLEPGPVTA gp100 (pmel17) 280-288

A*0201 YLSGANLNL Carcinogenic Embryonic Antigen (CEA) 571-579

A*0201 KVLEYVIKV MAGEA1 278-286

A*0201 KVAELVHFL MAGEA3 112-120

A*0201 KTWGQYWQV gp100 (pmel17) 154-162

A*0201 HLSTAFARV G250 (renal cell carcinoma) 217-225

A*0201 ILAKFLHWL Telomerase 540-548

A*0201 ILHNGAYSL HER-2/neu 435-443

A*0201 IMDQVPFSV gp100 (pmel17) 209-217

A*0201 KIFGSLAFL HER-2/neu 348-356

A*0201 LMLGEFLKL Survivin 96-104

A*0201 ALQPGTALL Prostate Stem Cell Antigen (PSCA) 14-22

A*0201 CMTWNQMNL Wilm's Tumour (WT1) 235-243

A*0201 ELAGIGILTV MelanA / MART 26-35

A*0201 FLTPKKLQCV Prostate Specific Antigen-1 (PSA-1) 141-150

A*0201 GLYDGMEHL MAGEA-10 254-262

A*0301 KQSSKALQR bcr-abl 210 kD fusion protein 21-29

A*0301 ATGFKQSSK bcr-abl 210 kD fusion protein 259-269

A*0301 ALLAVGATK gp100 (pmel17) 17-25

A*2402 VYGFVRACL Telomerase reverse transcriptase (hTRT) 461-469

A*2402 TYLPTNASL HER-2/neu 63-71

A*2402 TYACFVSNL Carcinogenic Embryonic Antigen (CEA) 652-660

A*2402 TFPDLESEF MAGEA3 97-105

A*2402 EYLQLVFGI MAGEA2 156-164

A*2402 CMTWNQMNL Wilm's Tumour (WT1) 235-243

A*2402 AFLPWHRLF Tyrosinase 188-196

B*0801 GFKQSSKAL bcr-abl 210 kD fusion protein 19-27

allél szekvencia EBV epitopA*0201 CLGGLLTMV EBV LMP-2 426-434

A*0201 GLCTLVAML EBV BMLF-1 259-267

A*1101 IVTDFSVIK EBV EBNA-4 416-424

A*2402 TYGPVFMCL EBV LMP-2 419-427

B*0702 RPPIFIRRL EBV EBNA-3A 247-255

B*0801 FLRGRAYGL EBV EBNA-3A 193-201

B*0801 RAKFKQLL EBV BZLF-1 190-197

B*3501 HPVGEADYFEY EBV EBNA-1 407-417

allél szekvencia Influenza A epitopA*0101 CTELKLSDY Influenza A (PR8) NP 44-52

A*0201 GILGFVFTL Influenza A MP 58-66

A*0301 ILRGSVAHK Influenza A (PR8) NP 265-274

allél szekvencia HIV epitopA*0201 ILKEPVHGV HIV-1 RT 476-484

A*0201 KLTPLCVTL HIV-1 env gp120 90-98

A*0201 SLYNTVATL HIV-1 gag p17 76-84

A*0201 TLNAWVKVV HIV-1 gag p24 19-27

A*0301 QVPLRPMTYK HIV-1 nef 73-82

A*0301 RLRPGGKKK HIV-1 gag p17 19-27

A*2402 RYLKDQQLL HIV-1 gag gp41 67-75

B*0702 IPRRIRQGL HIV-1 env gp120 848-856

B*0702 TPGPGVRYPL HIV-1 nef 128-137

B*0801 FLKEKGGL HIV-1 nef 90-97

B*0801 GEIYKRWII HIV-1 gag p24 261-269

B*2705 KRWIILGLNK HIV-1 gag p24 265-274

H-2Kd AMQMLKETI HIV-1 gag p24 199-207

Antigén specifikus T sejtek Antigén specifikus T sejtek kimutatására alkalmas MHC-peptid kimutatására alkalmas MHC-peptid

pentamer példákpentamer példákA vizsgált személy szövettípusának A vizsgált személy szövettípusának

megfelelő MHC multimer szükséges hozzámegfelelő MHC multimer szükséges hozzá

A TRANSZPLANTÁCIÓS IMMUNOLÓGIA GYAKORLATI VONATKOZÁSAI

MHC TIPIZÁLÁS

ember – HLA tipizálás

laboratóriumi egér – H2 tipizálás (miért nincs szükség rá?)

HLA tipizálásHLA tipizálás

- szövet/szerv transzplantációkhoz általában a HLA-B és a HLA-DR a legfontosabb a HLA-C kevéssé immunogén, gyakran alig befolyásolja a transzplantáció eredményét

- diagnosztikai értéke van HLA és a különféle betegségek között összefüggés lehet (HIV-rezisztenciás esetek egy része is adott spec HLA-B allélhez köthető)

MHC I: HLA-A, HLA-B, HLA-CMHC II: HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR

Fogalmak:autológ - saját eredetű (MHC azonos)allogén - idegen eredetű (MHC különbségek)xenogén - idegen faból származó (MHC és akár „vércsoport” antigén különbségek is)

• Hiperakut rejekció

Okok: alloantigénekkel szembeni előzetes immunizácó, preformált anti-HLA ellenanyagok, ABO-vércsoport inkompatibilitás, xenotranszplantáció

antitestek kötődnek a szerv endotél sejtjeihez

komplementrendszer aktiválódásatrombózis

vascularis necrosis

terápia rezisztens

Transzplantációs reakciók(allorektivitás)

• HLA-A, B, C, DR, DQ, DP, és minor hisztokompatibilitási antigének jelentősége

• idegen MHC-antigének T sejtek általi felismerése

Direkt: saját T sejtek - donor APC-k (CD8+ T sejt válasz)

Indirekt: saját APC bemutatja a donor MHC-molekula katabolizmusából származó fragmenteket (CD4+ T sejtek)

citokin felszabadulás

GYULLADÁS

forrás: Klinikai immunológia (II. klinikum) (OHVI 1990 szerk.: Szegedi, Gergely, Sipka, Szemere) Stenszky Valéria: Autoimmun betegségek genetikai vonatkozásai

Betegségek(autoimmun)

HLA

gyakoriság

beteg kontroll

SLEDR3 55 20

B8 50 20

Hidralazin(?) indukált lupus erythematosus

DR4 73 32

Basedow-kórDR3 56 25

B8 43 20

Krónikus aktív hepatitis DR3 55 21

Sclerosis multiplexDR2 60 30

B7 37 24

Myasthenia gravis B8 44 20

Autoimmun IgA glomerulonephritis

DR4 53 19

I. típ. diabetes

DR3 72 24

DR3 49 22

B8 40 21

Addison-kór (idiotópiás, autoimmun)

DR3 70 20

B8 46 23

Sjörgen-szindrómaDR3 70 20

B8 50 22

Coeliaka

DR3 79 22

DR7 60 15

B8 68 22

Goodpasture-szindróma DR2 88 29

IgA hiány DR3 81 20

Dermatitis herpetiformisDR3 82 20

B8 75 22

De Qervain-thyreoiditis B35 70 15

Reiter-szindróma B27 79 9

Felty-szindróma DR4 95 20

Betegségek HLA

gyakoriság

betegkontrol

lNarcolepsia DR2 100 22

Bechterew-kór B27 89 9

Adrenogenitális szindróma

Sóvesztő forma

Késői forma

Virilizáló forma

Bw47 36 1

B14 57 4

B5 48 10

Psoriasis vulgaris

Cw6 56 15

B13 24 8

B17 27 8

DR7 48 23

Idiopátiás haemochromatosis A3 76 28

Bechet-kór B51 50 11

Arany indukált thrombocytopenia DR3 50 13

Arany indukált leukopénia DR3 47 13

HLA allotípusok és betegségek közötti kapcsolatok

A régi klasszikus módszer:

Szerotipizálás A tipizálandó vérsejtek és a tipizáló szérum közötti szerológiai reakción alapul.Az MHC I és/vagy MHC II molekula változatokat felismerő ellenanyagokat tartalmazó szérumok segítségével véghez vitt komplement mediált lízis/sejtkárosítás.

Ha a tipizáló szérum nem reagál a sejtekkel, nincs lízis(az elpusztult/károsodott sejteket festék hozzáadásával teszik láthatóvá)

A tipizáló szérumokat régen immunizálódott személyektől gyűjtötték (pl. többször szült nők, vérátömlesztést kapott személyek - többféle MHC allél ellen immunizálódtak), ezt később monoklonális ellenanyagokkal váltották ki.

HLA tipizálási módszerek:

A szérumok/ellenanyagok specifitásának jellemzése és az új HLA allélek azonosítása nemzetközi workshopok keretében történik.

A rendelkezésre álló, jól karakterizált szérumok mennyisége mindig limitált – ezért mikrotiter tálcákon végzik a vizsgálatokat (mikrocitotoxicitási vizsgálat, Terasaki plate)

Az MHC II (HLA-DP, DQ, DR) allotípusokat B sejteken vizsgáljákperifériás vér, Ficoll gradiens PBMCPBMC, olcsó nylonvatta szlop dúsított B sejtek

Szerotipizálás

Az MHC antigének kompatibilitását kevert limfocita reakcióval (MLR) is vizsgálhatják.- Kétirányú MLR – mindkét donor T limfocitái válaszolnak- Egyirányú MLR – az egyik személy limfocitáinak osztódását gátolják (γ besugárzás,

sejtosztódás gátló Mitomycin C kezelés)

AZ ALLOREAKTÍV AKTIVÁLÓDÓ LIMFOCITÁK ARÁNYA EGY ADOTT EGYEDBEN NAGYON MAGAS LEHET (1-10%)

(alloreaktivitás és MHC restrikció látszólagos paradoxonának szemléletes feloldása:az allogén MHC a saját T sejt számára úgy „látszik”, mintha saját MHC lenne idegen peptiddel)

A szerotipizálásnak vannak korlátai: – gyakori keresztreakciók (HLA-B27 – HLA-B7, nem csak a poliklonális szérumok miatt)– HLA-C ellen (alacsony immunogenitású), kevés specifikus szérum– egyes variációkat, kis eltéréseket nem képes detektálni

Szerológiai módszerekkel a változatok töredékét lehet csak kimutatni!

Genetikai vizsgálatokGenetikai vizsgálatok- PCR-SSP (Sequence Specific Primer) ha ismert a szekvenciaKülönféle egyedi HLA szekvenciákra specifikus primerekkel elvégzett sokmintás PCR vizsgálat. Az allél specifikus primerpárok segítségével, a PCR reakcióban megsokszorozott génszakaszok kimutathatók az agaróz gélben

HLA-A 0201 0202 0203 …

-PCR-SSOP (Szekvencia Specifikus Oligonokleotid Próba)

Jelzéssel ellátott, allél specifikus oligonukleotidok hibridizációja a vizsgált személy DNS-éhez.

A vizsgálandó személy HLA génszakaszait PCR–rel sokszorosítják (nem allél specifikus primerekkel). A terméket nitrocellulóz membránon vagy mikrotiter tálcákon immobilizálják és különféle allél specifikus jelölt oligonukleotidokkal hibridizálják.A jelölés lehet radioaktív, enzim vagy fluoreszcens. – példát lásd a következő diákon (ELPHA )

-SBT (Sequence Based Typing)

DNS szekvenálással állapítják meg az allotípust(egészen kis eltérések, és új változatok is kimutathatóak vele)

Genetikai vizsgálatok

- Vérből szeparált PBMC-ből genom DNS izolálás- Az MHC II gének 2. exonjának és az MHC I gének 2. és 3. exonjának amplifikálása PCR-reakcióval. A primerek nem allél specifikusak, de biotinnal jelöltek.

ELPHA (Enzyme Linked Probe Hybridization Assay)(1. lépés)

DP DQ DR B C A

Egy gyakorlati példa PCR-SSOP-re:

A PCR amplifikátumot mikroteszt („ELISA”) lemez lukjaiba osztják szét.A lukak alja sztreptavidinnel fedett, és az egyes lukak liofilizált formában tartalmazzák a különféle allélszakaszokkal komplementer szekvencia specifikus oligonukleotidokat (SSOP).

Sztreptavidin

A biotinált amplifikátum kikötődik a sztreptavidinre, és egyidejűleg visszaoldja az oligonukleotidokat.

biotinált PCR amplifikátum

A komplementer szekvenciák hibridizálnak, és a mosás után csak az adott allélekre specifikus oligonukleotidok maradnak a lemezen.

Az oligonukleotidokon levő jelzést pl. enzim konjugált ellenanyag ismeri fel. Az enzim megfelelő szubsztráttal színreakciót katalizál.

ELPHA (Enzyme Linked Probe Hybridization Assay)(2. lépés)

(Jelen esetben az oligonukleotidon levő jelzés nem lehet biotin, mert az „foglalt”. Lehet pl. digoxigenin, vagy FITC. A FITC ebben az esetben nem fluoreszcens jel, hanem ún. „tag”)

pl. HLA-A tipizáló lemez (3.lépés)

HLA-A0276

HLA-A2434

HLA-A A*01010101A*0214 A*0263 A*0309 A*2301 A*2428 A*2603 A*300102 A*3306 A*6824A*01010102NA*0215N A*0264 A*0310 A*2302 A*2429 A*2604 A*300201 A*3307 A*6825A*010102 A*0216 A*0265 A*0311N A*2303 A*2430 A*2605 A*300202 A*3308 A*6826A*010103 A*021701 A*0266 A*0312 A*2304 A*2431 A*2606 A*300203 A*3401 A*6827A*010104 A*021702 A*0267 A*0313 A*2305 A*2432 A*260701 A*3003 A*3402 A*6828A*0102 A*0218 A*0268 A*0314 A*2306 A*2433 A*260702 A*3004 A*3403 A*6829A*0103 A*0219 A*0269 A*0315 A*2307N A*2434 A*2608 A*3006 A*3404 A*6830A*0104N A*022001 A*0270 A*0316 A*2308N A*2435 A*2609 A*3007 A*3405 A*6831A*0106 A*022002 A*0271 A*0317 A*2309 A*2436N A*2610 A*3008 A*3406 A*6832A*0107 A*0221 A*0272 A*0318 A*2310 A*2437 A*2611N A*3009 A*3407 A*6833A*0108 A*0222 A*0273 A*0319 A*2311N A*2438 A*2612 A*3010 A*3408 A*6834A*0109 A*0224 A*027401 A*0320 A*2312 A*2439 A*2613 A*3011 A*3601 A*6835A*0110 A*0225 A*027402 A*0321N A*2313 A*2440N A*2614 A*3012 A*3602 A*6901A*0111N A*0226 A*0275 A*0322 A*2314 A*2441 A*2615 A*3013 A*3603 A*7401A*0112 A*0227 A*0276 A*0323 A*24020101A*2442 A*2616 A*3014L A*3604 A*7402A*0113 A*0228 A*0277 A*0324 A*24020102LA*2443 A*2617 A*3015 A*4301 A*7403A*0114 A*0229 A*0278 A*0325 A*240202 A*2444 A*2618 A*3016 A*6601 A*7404A*0115N A*0230 A*0279 A*110101 A*240203 A*2445N A*2619 A*3017 A*6602 A*7405A*0116N A*0231 A*0280 A*110102 A*240204 A*2446 A*2620 A*3018 A*6603 A*7406A*0117 A*0232N A*0281 A*110103 A*240205 A*2447 A*2621 A*310102 A*6604 A*7407A*0118N A*0233 A*0282N A*110104 A*240206 A*2448N A*2622 A*3102 A*6605 A*7408A*0119 A*0234 A*0283N A*110105 A*240207 A*2449 A*2623 A*3103 A*6606 A*7409A*0120 A*023501 A*0284 A*110201 A*240208 A*2450 A*2624 A*3104 A*680101 A*7410A*02010101A*023502 A*0285 A*110202 A*240209 A*2451 A*2625N A*3105 A*680102 A*7411A*02010102LA*0236 A*0286 A*1103 A*240210 A*2452 A*2626 A*3106 A*680103 A*7412NA*020102 A*0237 A*0287 A*1104 A*240211 A*2453 A*2627 A*3107 A*680104 A*8001A*020103 A*0238 A*0288N A*1105 A*240212 A*2454 A*2628 A*3108 A*680105 A*9201A*020104 A*0239 A*0289 A*1106 A*240301 A*2455 A*2629 A*3109 A*68020101A*9202A*020105 A*0240 A*0290 A*1107 A*240302 A*2456 A*2630 A*3110 A*68020102A*9203A*020106 A*0241 A*0291 A*1108 A*2404 A*2457 A*2631 A*3111 A*680301 A*9204A*020107 A*0242 A*0292 A*1109 A*2405 A*2458 A*2632 A*3112 A*680302A*020108 A*0243N A*0293 A*1110 A*2406 A*2459 A*2633 A*3113 A*6804A*020109 A*0244 A*0294N A*1111 A*2407 A*2460N A*29010101A*3114N A*6805A*020110 A*0245 A*0295 A*1112 A*2408 A*2461 A*29010102NA*3201 A*6806A*020111 A*0246 A*0296 A*1113 A*2409N A*2462 A*290201 A*3202 A*6807A*020112 A*0247 A*0297 A*1114 A*2410 A*2463 A*290202 A*3203 A*6808A*0202 A*0248 A*0299 A*1115 A*2411N A*2464 A*290203 A*3204 A*6809A*020301 A*0249 A*03010101A*1116 A*2413 A*2465 A*2903 A*3205 A*6810A*020302 A*0250 A*03010102NA*1117 A*2414 A*2466 A*2904 A*3206 A*6811NA*0204 A*0251 A*03010103A*1118 A*2415 A*250101 A*2905 A*3207 A*6812A*0205 A*0252 A*030102 A*1119 A*2417 A*250102 A*2906 A*3208 A*6813A*020601 A*0253N A*030103 A*1120 A*2418 A*2502 A*2907 A*3209 A*6814A*020602 A*0254 A*030104 A*1121N A*2419 A*2503 A*2908N A*3210 A*6815A*020603 A*0255 A*030105 A*1122 A*2420 A*2504 A*2909 A*3211Q A*6816A*0207 A*0256 A*0302 A*1123 A*2421 A*2505 A*2910 A*3212 A*6817A*0208 A*0257 A*0303N A*1124 A*2422 A*2506 A*2911 A*3213 A*6818NA*0209 A*0258 A*0304 A*1125 A*2423 A*260101 A*2912 A*3301 A*6819A*0210 A*0259 A*0305 A*1126 A*2424 A*260102 A*2913 A*330301 A*6820A*0211 A*0260 A*0306 A*1127 A*2425 A*260103 A*2914 A*330302 A*6821A*0212 A*0261 A*0307 A*1128 A*2426 A*260104 A*2915 A*3304 A*6822

szekvencia alapon 2006 októberéig leírt

HLA-A allélek (480)egy régebbi nomenklatúra

szerint(http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/allele.html)

és a szerológiai alapon jellemzett

HLA-A allélek (28):

A1 A2 A203 A210 A3 A9 A10 A11 A19 A23(9) A24(9) A2403 A25(10) A26(10) A28 A29(19) A30(19) A31(19) A32(19) A33(19) A34(10) A36 A43 A66(10) A68(28) A69(28) A74(19) A80

2012:1757 HLA-A allél1290 HLA-A fehérje87 null allél

2012-es HLA nomenklatúra

A szekvenálás térhódításával rengeteg új allélt/változatot mutatnak ki, ezért a nomenklatura rendszeres frissítésre szorul

http://hla.alleles.org/

2012 januárjáig 7196 különböző HLA allélt (A,B,C, DP, DQ, DR,…) írtak le

Nomenclature IndicatesHLA the HLA region and prefix for an HLA geneHLA-DRB1 a particular HLA locus i.e. DRB1HLA-DRB1*13 a group of alleles which encode the DR13 antigen or sequence homology to other DRB1*13 allelesHLA-DRB1*13:01 a specific HLA alleleHLA-DRB1*13:01:02 an allele that differs by a synonymous mutation from DRB1*13:01:01HLA-DRB1*13:01:01:02 an allele which contains a mutation outside the coding region from DRB1*13:01:01:01HLA-A*24:09N a 'Null' allele, an allele which is not expressedHLA-A*30:14L an allele encoding a protein with significantly reduced or 'Low' cell surface expressionHLA-A*24:02:01:02L an allele encoding a protein with significantly reduced or 'Low' cell surface expression, where the mutation

is found outside the coding regionHLA-B*44:02:01:02S an allele encoding a protein which is expressed as a 'Secreted' molecule onlyHLA-A*32:11Q an allele which has a mutation that has previously been shown to have a significant effect on cell surface

expression, but where this has not been confirmed and its expression remains 'Questionable'

MHC-I

MHC-II

HLA nomenklatúra részletei

TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓK

Ártalmatlan anyagok bejutása egyes emberekben túlérzékenységi reakciókat

válthat ki

Nemkívánatos gyulladáshoz, sejtek és szövetek károsodásához vezet

Az immunrendszer az idegen anyagra nem megfelelően reagál

Többnyire ártalmatlan anyagok hatására alakul ki, másodszori (esetleg többszöri) találkozás eredményeként

TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓK ÁTTEKINTÉSE

I. típusú„azonnali”

II. típusú III. típusú IV. típusú„késői”

Ellenanyag mediált T sejt mediált

- az elején szenzitizációval indulnak- gyakran autoimmun megbetegedésekkel kapcsolatban- a típusok effektor mechanizmusai átfedhetnek – tünetek egy része hasonló lehet- sok olyan eset lehetséges amikor nem tisztán az egyik vagy a másik típus jelenik meg (pl. I – IV)

AZ ELLENANYAG MEDIÁLT TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓK TÍPUSAI

Ellenanyagizotípus

Antigén

Effektor mechanizmus

Példa

Szolubilis antigén

Hízósejt aktiváció

Allergiás rhinitis, asthma bronchiale,

anaphylaxia

Szolubilis antigén

Komplement, fagociták

Sejtfelszíni receptor

Sejtfelszíni vagy mátrix-

kötött antigén

Az ellenanyag megváltoztatja

a jelátvitelt

Komplement, FcR+ sejtek (fagociták, NK-sejtek)

Egyes gyógyszer-allergiák

(pl. penicillin)

Krónikus urtikária

(ellenanyag az FcRIα ellen)

Szérumbetegség, Arthus-reakció

II. típus III. típusI. típus

• I. TÍPUSÚ TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓ

• „azonnali” hiperszenzitivitási reakció

• „klasszikus” ALLERGIA

A szenzitizáció folyamata

Első találkozás a pollennel

Az antigén bejutása, felvétele

Antigén-specifikus

T-sejtek aktivációja

IgE termelés és azok kötődése a

hízósejtek felszínéhez

(Az antigénprezentáció a naív T sejtek számára és a naív B sejtek aktivációja természetesen a nyirokcsomóban történik)

IgE

Fc RIea

bg

foszfatidil-kolin

PGD2

PGD2

PAF

LTC4

PIP2

IP3

DAG

Ca2+Ca2+

Ca2+foszfolipid

PKC

LTC4

LTD4LTE4

LYSO-PC arachidonsav

szekretorosgranulum

mediátorokcitokinekIL-3, IL-4,IL-5, IL-6

TNFa

endoplazmásretikulum

PI-PLCg

Ca2+

Ca2+

szekréció

MAP-kináz

proteinek(miozin-

könnyűlánc)foszforilációja

PLA2

ciklooxigenáz

5-lipoxigenáz

ITAM

ITAM

ITAM

ITA

M

ITA

M

ITA

M

citokin génektranszkripciója

SykLyn

NFATAP-1 NF- Bk

AZ ALLERGÉN HATÁSÁRA A HÍZÓSEJTBEN KIVÁLTOTT

REAKCIÓK

KORAI MEDIÁTOROK(raktározott)

Biogén aminok – hisztamin

Enzimek – triptáz, kináz, karboxipeptidáz

KÉSŐI MEDIÁTOROK

citokin

kemokin

lipid-mediátor

enzim

toxikus mediátor

Termék típusa Termék Biológiai hatások

kötőszöveti ‘remodelling’

toxikus a parazitákranöveli az erek permeabilitásátsimaizom összehúzódáshoz vezet

gyulladáskeltő, különböző sejttípusok citokintermelését serkenti, aktiválja az endotéliumot

TNFα (egy része granulumokban raktározva)

simaizom összehúzódáshoz vezet növeli az erek permeabilitását serkenti a nyáktermelést

serkentik és erősítik a Th2-választ

granulocita termelés és aktiválás

monocita, makrofág és granulocita toborzás

leukociták toborzása, lipidmediátorok felszabadulásának serkentése, neutrofilok, eozinofilok és trombociták aktiválása

A TNF tároltan is megtalálható, és késői mediátor is

korai (tárolt) mediátorok

A hízósejt degranuláció hatása függ a szöveti környezettől

Hányás, hasmenés,

hasi görcsök

Köhögés, mellkasi

szorítóérzés, sípoló légzés

Ödéma, gyulladás és megnövekedett antigénszállítás a nyirokcsomókba

Hízósejt aktiváció és degranuláció

Emésztőrendszer Légutak Vérerek

Megnövekedett emésztőnedv szekréció és

perisztaltika

Csökkent átmérő és megnövekedett nyáktermelés

Megnövekedett vérátáramlás és

permeabilitás

AZ IgE ÁLTAL KÖZVETÍTETT HIPERSZENZITIVITÁS TÍPUSAI

SZINDRÓMA GYAKORI ALLERGÉNEK

A BELÉPÉS HELYE VÁLASZ

szisztémásanafilaxis

gyógyszerekállati mérgekföldi mogyoró

intravénás(közvetlen vagy

szájon át történő felszívódás

ödémaér áteresztő képesség

növekedésetracheális okkluzió

keringés összomlásahalál

akut urtikária rovar csípésallergia teszt

szubkután a véráram lokális fokozódásaéráteresztő képesség növekedése

Allergiás rinitisz

szénanátha

pollenházi atka ürülék

belégzés orr nyálkahártya ödéma orr nyálkahártya irritáció

asztma állatszőrpollen

házi atka ürülék

belégzés légutak szűkületefokozott nyálka képződés

légutak gyulladása

étel allergia csonthéjasokföldimogyoróhalak, kagyló

tej, tojás

szájon át hányáshasmenés

pruritusz (viszketés)urtikária (csalánkiütés)

anafilaxis (ritka)

Hízósejtek működésének vagy antigén specifikus IgE jelenlétének vizsgálatakísérleti állatmodellben:

Passzív kután anafilaxis

A bőrbe szenzitizált élőlény szérumát, vagy antigén specifikus IgE ellenanyagokat juttatnak lokálisan („lokális passzív immunizálás”).

Egy két nap elteltével intravénásan juttatnak az állatba antigént, és jelzőfestéket (Evans-blue – albuminhoz kötődik a keringésben)

A kisméretű antigén a korábbi oltás helyén kiváltja az IgE hordozó hízósejtek aktivációját.

A hisztamin hatására megnő a helyi kapillárisok permeabilitása, a kék festék kijut a szövetbe – kék elszíneződés az oltás helyén

Parlagfű (Ambrosia artemisiifolia)

Parlagfű (Ambrosia artemisiifolia) Fekete üröm (Artemisia vulgaris)

levélfonák zöld levélfonák fehéresen molyhos

Fekete üröm (Artemisia vulgaris) – ?

Fehér üröm (Artemisia absinthium) – Abszint