View
11
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
Załącznik nr 2
do wniosku o przeprowadzenie postępowania habilitacyjnego
Autoreferat
dr Paulina Jackowiak
Zakład Biologii Molekularnej i Systemowej
Instytut Chemii Bioorganicznej
Polskiej Akademii Nauk
Poznań, listopad, 2018
dr Paulina Jackowiak Załącznik nr 2
2
1. Imię i Nazwisko.
Paulina Jackowiak
2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe – z podaniem nazwy, miejsca i roku ich
uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej.
stopień doktora nauk chemicznych w zakresie biochemii (z wyróżnieniem),
Instytut Chemii Biooorganicznej Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu (ICHB
PAN), 2010. Tytuł rozprawy doktorskiej: Identyfikacja czynników kształtujących
strukturę populacji wirusowej w przebiegu przewlekłego zapalenia wątroby typu
C, promotor: prof. dr hab. Marek Figlerowicz;
tytuł magistra biologii, specjalność biologia molekularna, Wydział Biologii
Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza w Poznaniu, 2004. Tytuł pracy
magisterskiej: Badanie wpływu struktury RNA na zdolność odwrotnej
transkryptazy wirusa HIV do wykonywania niehomologicznych przeskoków
rekombinacyjnych, promotor pracy: doc. dr hab. Marek Figlerowicz (praca
wykonana w Zespole Wirusologii Molekularnej ICHB PAN);
tytuł licencjata biologii, specjalność biologia molekularna, Wydział Biologii
Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza w Poznaniu, 2002. Tytuł pracy
licencjackiej: Potranskrypcyjne wyciszanie ekspresji genów, promotor: dr hab.
Artur Jarmołowski, prof. UAM.
3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych.
01.01.2011–obecnie: adiunkt w Zakładzie Biologii Molekularnej i Systemowej,
ICHB PAN;
01.10.2014–30.09.2016: adiunkt w Zakładzie Chemii Organicznej, Instytut
Technologii i Inżynierii Chemicznej, Wydział Technologii Chemicznej
Politechniki Poznańskiej;
01.01.2010–31.12.2010: asystent w Zespole Wirusologii Molekularnej,
Pracowni Biologii Molekularnej Roślin, ICHB PAN.
dr Paulina Jackowiak Załącznik nr 2
3
4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca
2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w
zakresie sztuki (Dz. U. 2016 r. poz. 882 ze zm. w Dz. U. z 2016 r. poz. 1311.):
a) tytuł osiągnięcia naukowego
Identyfikacja fragmentów RNA w wybranych układach eukariotycznych oraz
charakterystyka zidentyfikowanych cząsteczek w kontekście ich biogenezy i potencjału
funkcjonalnego
b) publikacje wchodzące w skład osiągnięcia naukowego (autor/autorzy, rok
wydania, tytuł/tytuły publikacji, nazwa wydawnictwa, recenzenci wydawniczy)
1. P. Jackowiak#, M. Nowacka#, P. M. Strozycki, M. Figlerowicz*, 2011, RNA
degradome - its biogenesis and functions, Nucleic Acids Research 39(17), 7361-7370;
IF 8.026; kwartyl 1 (biochemistry & molecular biology); MNiSW 40; cytowania:
26/22 bez autocytowań;
praca nagrodzona Nagrodą Naukową ICHB PAN w 2012 roku
2. M. Nowacka, P. M. Strozycki, P. Jackowiak, A. Hojka-Osinska, M. Szymanski, M.
Figlerowicz*, 2013, Identification of stable, high copy number, medium-sized RNA
degradation intermediates that accumulate in plants under non-stress conditions, Plant
Molecular Biology 83(3), 191-204;
IF 4.072; kwartyl 1 (plant sciences); MNiSW 40; cytowania: 19/16 bez
autocytowań
3. P. Jackowiak, A. Hojka-Osinska, A. Philips, A. Zmienko, L. Budzko, P. Maillard, A.
Budkowska, M. Figlerowicz*, 2017, Small RNA fragments derived from multiple RNA
classes – the missing element of multi-omics characteristics of the hepatitis C virus cell
culture model, BMC Genomics, 18, 502;
IF 3.730; kwartyl 1 (biotechnology & applied microbiology); MNiSW 40;
cytowania: 1/0 bez autocytowań
dr Paulina Jackowiak Załącznik nr 2
4
4. A. Hojka-Osinska, L. Budzko, A. Zmienko, A. Rybarczyk, P. Maillard, A.
Budkowska, M. Figlerowicz, P. Jackowiak*, 2016, RNA-Seq-based analysis of
differential gene expression associated with hepatitis C virus infection in a cell culture,
Acta Biochimica Polonica, 63(4), 789-798;
IF 1.159; kwartyl 4 (biochemistry & molecular biology); MNiSW 15; cytowania:
2/1 bez autocytowań
5. P. Jackowiak*, A. Lis, M. Luczak, I. Stolarek, M. Figlerowicz*, 2018, Functional
characterization of RNA fragments using high-throughput interactome screening,
Journal of Proteomics, https://doi.org/10.1016/j.jprot.2018.10.007;
IF2017 3.722; kwartyl 1 (biochemical research methods); MNiSW 35; cytowania: 0
6. P. Jackowiak*, A. Hojka-Osinska, K. Gasiorek, M. Stelmaszczuk, D. Gudanis, Z.
Gdaniec, M. Figlerowicz*, 2017, Effects of G-quadruplex topology on translational
inhibition by tRNA fragments in mammalian and plant systems in vitro, The
International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 92, 148-154;
IF 3.247; kwartyl 2 (biochemistry & molecular biology); MNiSW 35; cytowania: 0
*autor korespondencyjny
#autorzy równorzędni
łączny IF = 23.956; MNiSW = 205 ; liczba cytowań: 48/39 bez autocytowań
Oświadczenia habilitantki oraz współautorów dotyczące ich wkładu w powstanie
poszczególnych publikacji znajdują się w Załączniku nr 5, natomiast kopie publikacji
stanowiących osiągnięcie naukowe znajdują się w Załączniku nr 6.
dr Paulina Jackowiak Załącznik nr 2
5
c) omówienie celu naukowego ww. pracy/prac i osiągniętych wyników wraz z
omówieniem ich ewentualnego wykorzystania
I. Wprowadzenie
Niekodujący RNA (ang. non-coding RNA, ncRNA) pełni pierwszoplanowe
funkcje we wszystkich typach komórek żywych, zarówno jako ich konstytutywny
element, jak i czynnik regulujący zachodzące w nich procesy [1]. Co więcej, istnieje
wiele przesłanek świadczących o tym, że cząsteczki ncRNA odegrały istotną rolę w
sukcesie ewolucyjnym organizmów eukariotycznych. Stwierdzono między innymi, że
występujący u bakterii system regulacji ekspresji genów jest efektywny tylko w
przypadku niewielkich genomów, gdyż wymaga zaangażowania wielu specyficznych
czynników białkowych. W rezultacie każdemu nowo powstającemu genowi
towarzyszyć muszą aż cztery kolejne, kodujące białka regulujące jego ekspresję [2, 3].
Zaproponowano, że ta zależność jest podstawowym elementem ograniczającym
złożoność genetyczną bakterii. Dopiero zasadnicza zmiana strategii regulacyjnej, która
dokonała się u eukariontów i polegała na wykorzystaniu RNA, otworzyła organizmom
żywym drogę do dalszego dynamicznego rozwoju [1-3].
Pod koniec pierwszej dekady XXI wieku spektrum znanych ncRNA
powiększyło się znacząco wraz z odkryciem, że w komórkach tworzone są i
akumulowane stabilne fragmenty, powstające z cząsteczek reprezentujących różne klasy
RNA (m.in. rRNA, tRNA, snoRNA, mRNA). Odkrycie to nieprzypadkowo zbiegło się
w czasie z powstaniem i upowszechnieniem technik sekwencjonowania nowej generacji
(ang. next generation sequencing, NGS), które umożliwiły identyfikację elementów
transkryptomu na niespotykaną dotąd skalę.
Zagadnienia związane z rolą RNA w procesach biologicznych znalazły się w
centrum moich zainteresowań badawczych już w momencie realizacji pracy
licencjackiej dotyczącej zjawiska potranskrypcyjnego wyciszania ekspresji genów.
Dalsze badania, prowadzone w ramach realizacji pracy magisterskiej i doktorskiej,
skupiłam wokół wirusów RNA. W okresie tym zajmowałam się przede wszystkim
poznawaniem mechanizmów warunkujących polimorfizm genetyczny wirusów oraz
analizą jego wpływu na przebieg przewlekłych infekcji i wyniki terapii. Rozpoczynając
w 2010 roku nowy etap kariery zawodowej po uzyskaniu stopnia doktora, swoje
zainteresowania naukowe skoncentrowałam wokół zagadnień dotyczących fragmentów
dr Paulina Jackowiak Załącznik nr 2
6
RNA, będących słabo poznaną grupą cząsteczek o potencjalnie dużym znaczeniu dla
przebiegu procesów biologicznych.
II. Krytyczna analiza stanu wiedzy na temat fragmentów RNA
Pierwszym zadaniem jakiego należało się podjąć było usystematyzowanie stanu
wiedzy na temat fragmentów RNA. Poddaliśmy zatem krytycznej analizie dane
literaturowe dotyczące tej tematyki, a wynikające z niej wnioski przedstawiliśmy w
formie publikacji przeglądowej RNA DEGRADOME - ITS BIOGENESIS AND FUNCTIONS
(NUCLEIC ACIDS RESEARCH, 2011; publikacja nr 1), stanowiącej część osiągnięcia
habilitacyjnego. Została ona uznana za najlepszą pracę przeglądową opublikowaną w
roku 2011 w ICHB PAN. Streszczenie jej głównych wątków przedstawiłam poniżej.
W momencie powstania tego artykułu było już wiadomo, że fragmenty RNA
występują zarówno u przedstawicieli Prokaryota jak i Eukaryota, co wskazywało na
zachowawczość ewolucyjną mechanizmów prowadzących do powstawania i akumulacji
tych cząsteczek oraz sugerowało ich zaangażowanie w przebieg istotnych procesów
komórkowych. Powstawanie fragmentów RNA wiązano w głównej mierze z
warunkami stresowymi. Mimo że zidentyfikowano klasę cząsteczek obejmujących
końce 3’ pre-tRNA, zdecydowana większość poznanych fragmentów nie zawierała
odcinków występujących jedynie w transkryptach pierwotnych. Można było zatem
stwierdzić, że fragmenty powstają przede wszystkim z dojrzałych cząsteczek RNA. Co
więcej, zgromadzone dane wskazywały, iż fragmentacji ulegają cząsteczki funkcjonalne
a nie tylko te, które usuwane są w procesie kontroli jakości. Tylko w nielicznych
przypadkach zidentyfikowano nukleazy zaangażowane w biogenezę fragmentów RNA.
Były to między innymi: kolicyny, angiogenina, Rny1, RNASET2 czy Dicer. Sposób
powstawania większości fragmentów RNA pozostawał jednak nieznany.
Przedstawiliśmy zatem koncepcję, zgodnie z którą fragmenty RNA mogą być
stabilnymi produktami przejściowymi degradacji dojrzałych funkcjonalnych RNA.
Podkreślaliśmy przy tym, że należy wyraźnie odróżnić degradację RNA – ściśle
regulowany i niezwykle efektywny proces zachodzący powszechnie w komórkach
wszystkich organizmów – od przypadkowego rozpadu RNA. Jednocześnie
zaproponowaliśmy odejście od nadawania odrębnych nazw poszczególnym grupom
fragmentów (np. sdRNA, tRFs, tsRNA) na rzecz nazwania ich zbioru degradomem
RNA. Z perspektywy kilku lat można powiedzieć, że kwestia nazewnictwa czy
dr Paulina Jackowiak Załącznik nr 2
7
klasyfikacji fragmentów RNA pozostaje nadal otwarta. W miejscu tym warto zaznaczyć
jednak, iż zaproponowana przez nas nomenklatura jest dotąd najbardziej uniwersalna.
Równie szczątkowa jak w przypadku biogenezy fragmentów RNA była wiedza
na temat ich funkcji. Dane literaturowe nie pozostawiały wątpliwości, że pula tych
cząsteczek zawiera ncRNA zaangażowane w regulację szeroko rozumianego procesu
ekspresji genów. Zidentyfikowano między innymi fragmenty RNA stanowiące
cząsteczki przewodnie dla tRNAzy Z, pełniące funkcję miRNA, uczestniczące w
tworzeniu granul stresowych, czy w procesach sygnalizacji u roślin. Z drugiej strony
było jasne, że role przypisane tylko niektórym fragmentom stanowią dopiero wstęp do
poznania rzeczywistego znaczenia tych cząsteczek [publikacja nr 1].
Krytyczna analiza stanu wiedzy na temat fragmentów RNA doprowadziła mnie
do kilku istotnych spostrzeżeń. Po pierwsze, fragmenty RNA powstają w sposób
wtórny, z dojrzałych cząsteczek RNA, które pełnią zdefiniowane role w komórce. Ta
cecha odróżnia je od znanych wcześniej krótkich ncRNA, które generowane są w
wyniku przetwarzania pierwotnych transkryptów. Wskazuje to na istnienie zjawiska
„podwójnego wykorzystania” komórkowych RNA. Po drugie, istnieją przesłanki
świadczące o tym, że biogeneza fragmentów RNA przebiega kilkoma odrębnymi
ścieżkami. Po trzecie, akumulacja tych cząsteczek jest ściśle kontrolowana – tylko
niektóre fragmenty macierzystego RNA są gromadzone, natomiast inne ulegają
całkowitej degradacji. Po czwarte, fragmenty RNA wykazują zróżnicowany potencjał
funkcjonalny. Prawdopodobnie tylko część z nich odgrywa istotną rolę biologiczną,
jednak można sądzić, że spektrum ich funkcji jest stosunkowo szerokie. W kontekście
powyższych spostrzeżeń zrodziło się wiele intrygujących pytań i stało się oczywistym,
że dalsze poszerzanie wiedzy dotyczącej fragmentów RNA jest niezwykle ciekawym,
ale też długofalowym i trudnym zadaniem. Planując moje badania postanowiłam zatem
skupić się w pierwszej kolejności na kilku szczególnie istotnych problemach, które
przedstawiłam poniżej.
Informacje o fragmentach RNA były dotąd zdobywane w głównej mierze
podczas badań poświęconych innym grupom RNA (m.in. miRNA). Rozwiązania
metodyczne z powodzeniem stosowane w tych badaniach były jednak niewystarczające
w przypadku tak szczególnej i heterogennej puli cząsteczek, jaką stanowią fragmenty
RNA. Przykładowo, źródła literaturowe nie zawierały danych dotyczących parametrów
określających jakość prób, w których identyfikowano fragmenty RNA. W przypadku
dr Paulina Jackowiak Załącznik nr 2
8
niektórych technik badawczych (qRT-PCR czy mikromacierze) wyznaczono ścisłe
kryteria integralności RNA, które muszą być spełnione, aby uzyskiwane wyniki można
było uznać za wiarygodne. Kryteria te nie odnosiły się jednak do badań fragmentów
RNA. Tymczasem ze względu na nietrwałość RNA, wynikającą zarówno z jego
podatności na nieenzymatyczną hydrolizę jak i cięcie przez nukleazy pozakomórkowe,
jakość badanego materiału ma pierwszorzędne znaczenie. Kolejny problem związany
był z brakiem właściwych podejść analitycznych. Standardowe procedury
sekwencjonowania nowej generacji i analizy uzyskanych wyników w bardzo
ograniczonym stopniu pozwalały na identyfikację indywidualnych fragmentów RNA,
umożliwiając jedynie globalną charakterystykę tej puli cząsteczek i zachodzących w
niej zmian. Koniecznym stało się zatem stworzenie kompleksowych rozwiązań
metodycznych ukierunkowanych na systematyczną analizę fragmentów RNA,
począwszy od przygotowania prób, a skończywszy na bioinformatycznej analizie
wyników sekwencjonowania nowej generacji.
Jak wcześniej wspomniałam, początkowo fragmenty RNA identyfikowano
przede wszystkim w warunkach stresowych, takich jak niedobór substancji
odżywczych, stres oksydacyjny czy zmiany nowotworowe. Gdy rozpoczynałam
niniejsze badania, w literaturze światowej nie istniały żadne doniesienia dotyczące
akumulacji fragmentów RNA podczas stresu, jakim jest infekcja wirusowa.
Zagadnienie to wydało się szczególnie interesujące w kontekście moich wcześniejszych
prac poświęconych wirusom RNA i zdobytej wiedzy na temat oddziaływań między
wirusem a gospodarzem. Było już bowiem wiadomo, że istnieje wyraźny związek
między szlakami degradacji RNA i potranskrypcyjnego wyciszania genów a
przebiegiem niektórych infekcji wirusowych. Stwierdzono nawet, że zaburzenie tych
szlaków przez patogen jest nieodzownym warunkiem rozwoju niektórych infekcji [4].
Zjawisko to dotyczy m.in. modelowego ludzkiego wirusa (+)RNA, jakim jest wirus
zapalenia wątroby typu C (ang. hepatitis C virus, HCV). Podczas infekcji HCV zmienia
się lokalizacja subkomórkowa białek współtworzących tzw. ciałka P i granule stresowe,
struktury rybonukleoproteinowe związane z inhibicją translacji i apoptozą [5]. Ponadto,
komórkowe rybonukleazy, np. RNAza L [6] czy XRN1 [7] hamują rozwój infekcji
katalizując cięcie wirusowych RNA. W szerszej perspektywie, po zakażeniu komórka
staje się obszarem złożonych oddziaływań obejmujących cząsteczki RNA, zarówno
pochodzenia komórkowego jak i wirusowego. Poznanie pełnego spektrum tych
dr Paulina Jackowiak Załącznik nr 2
9
cząsteczek uznałam za nieodzowny warunek zrozumienia procesów związanych z
rozwojem i przebiegiem infekcji wirusowych. Jako system badawczy wybrałam układ
modelowy hodowli komórkowej HCV. Stanowi go linia ludzkich komórek raka
wątrobowokomórkowego Huh-7.5, zakażonych cząstkami wirusowymi
reprezentującymi izolat JFH-1 HCV.
W kontekście przedstawionych powyżej rozważań dotyczących warunków
stresowych, rodziło się również pytanie, czy fragmenty RNA są generowane w sposób
powtarzalny także w warunkach fizjologicznych i czy ulegają wówczas znaczącej
akumulacji. Badania dotyczące tego ostatniego zagadnienia były już prowadzone w
Pracowni Biologii Molekularnej Roślin ICHB PAN (obecnie Zakład Biologii
Molekularnej i Systemowej) w momencie, gdy zostałam w niej zatrudniona po
uzyskaniu stopnia doktora. Naszym obiektem badawczym była między innymi roślina
modelowa, Arabidopsis thaliana. Dostępność tego modelu obok wybranego wcześniej,
otwierała możliwość identyfikacji i scharakteryzowania fragmentów RNA w dwóch
zdecydowanie różnych układach eukariotycznych oraz udzielenia odpowiedzi na
pytanie, na ile uniwersalne są mechanizmy powstawania i funkcjonowania tych
cząsteczek.
Za jedno z największych wyzwań dotyczących fragmentów RNA uznałam
określenie ich znaczenia biologicznego. Można było bowiem przypuszczać, że
spektrum ich potencjalnych funkcji jest szerokie i nie ogranicza się tylko do działania w
sposób typowy dla krótkich regulatorowych RNA. Potwierdzały to wspomniane już
doniesienia literaturowe, wskazujące m.in. na udział fragmentów RNA w regulacji
translacji czy sekwestracji białek Ago [8, 9]. Powstało zatem pytanie, w jaki sposób
ocenić potencjał funkcjonalny fragmentów RNA. O ile istniały już metody
wysokoprzepustowej identyfikacji fragmentów RNA, o tyle możliwości równie szeroko
zakrojonej analizy mechanizmów ich działania do tej pory pozostają niedostępne.
Punktem wyjścia do podjęcia prób odpowiedzi na pytanie o potencjał funkcjonalny
fragmentów RNA było przyjęte założenie, że zdolności regulacyjne danej cząsteczki
RNA ujawniają się w większości przypadków dopiero wówczas, gdy wchodzi ona w
skład kompleksu rybonukleoproteinowego, często zawierającego białka o
właściwościach katalitycznych. W momencie rozpoczęcia niniejszych badań,
zidentyfikowanych było tylko kilka białek wiążących fragmenty RNA, takich jak m.in.:
tRNaza Z, Piwi, Ago, eIF4G. Poznanie szerszego spektrum białkowych partnerów
dr Paulina Jackowiak Załącznik nr 2
10
fragmentów RNA było zatem koniecznym warunkiem lepszego scharakteryzowania
potencjału funkcjonalnego tej grupy cząsteczek. Z drugiej strony, w kontekście
istniejących doniesień dotyczących wpływu fragmentów RNA na potranskrypcyjną
regulację ekspresji genów i na translację, istotne wydawało się także lepsze poznanie
cech strukturalnych, warunkujących zdolności regulatorowe tych cząsteczek.
III. Cel
Podstawowym celem podjętych prac było stworzenie kompleksowej strategii
badania fragmentów RNA, a następnie zastosowanie jej do identyfikacji tych cząsteczek
w wybranych eukariotycznych układach modelowych oraz poznania uwarunkowań ich
biogenezy i potencjału funkcjonalnego.
Zgodnie z zarysowanymi powyżej kierunkami badawczymi, osiągnięcie tak
postawionego celu wymagało w szczególności:
a) opracowania szeregu rozwiązań metodycznych ukierunkowanych na wszechstronną
analizę fragmentów RNA;
b) identyfikacji fragmentów RNA powstających w Arabidopsis thaliana oraz w
układzie modelowym hodowli komórkowej HCV;
c) identyfikacji czynników mogących warunkować biogenezę fragmentów RNA;
d) identyfikacji białek wiążących wybrane fragmenty RNA;
e) określenia zdolności fragmentów RNA do regulacji wybranego procesu;
f) identyfikacji cech strukturalnych fragmentów RNA, warunkujących ich potencjał
regulatorowy.
IV. Omówienie wyników i ich wykorzystania
Rozpoczynając badania dotyczące fragmentów RNA, włączyłam się w prace
realizowane w naszym zespole już od kilku lat, które koncentrowały się na identyfikacji
i charakterystyce fragmentów RNA powstających w roślinie modelowej Arabidopsis
thaliana. Ich rezultaty przedstawiliśmy w publikacji IDENTIFICATION OF STABLE, HIGH
COPY NUMBER, MEDIUM-SIZED RNA DEGRADATION INTERMEDIATES THAT
ACCUMULATE IN PLANTS UNDER NON-STRESS CONDITIONS (PLANT MOLECULAR
BIOLOGY, 2013; publikacja nr 2). Wykorzystując opracowaną wcześniej metodę
dr Paulina Jackowiak Załącznik nr 2
11
elektroforezy dwukierunkowej RNA (opisaną przez nas w pracy niewłączonej do
osiągnięcia naukowego), określiliśmy wzory akumulacji fragmentów RNA w
korzeniach, liściach i kwiatostanach A. thaliana. Wykazaliśmy, że cząsteczki te
występują w roślinie także w warunkach fizjologicznych, w ilościach zbliżonych do
miRNA, a wzory ich akumulacji są wysoce powtarzalne i specyficzne dla
poszczególnych organów. Wskazywało to jednoznacznie, że procesy warunkujące
biogenezę i akumulację fragmentów RNA są ściśle regulowane. Następnie
zidentyfikowaliśmy fragmenty za pomocą klonowania i standardowego
sekwencjonowania metodą Sangera. Stwierdziliśmy, że większość z nich pochodziła z
tRNA i rRNA. W pierwszej grupie dominowały fragmenty obejmujące region 3’ tRNA,
ale były obecne również m.in. połówki 5’. Aby ustalić, czy rybonukleazy typu Dicer są
zaangażowane w powstawanie fragmentów RNA, określiliśmy wzory akumulacji tych
cząsteczek w czterech mutantach A. thaliana, z których każdy pozbawiony był jednego
białka typu Dicer (DCL1, DCL2, DCL3 lub DCL4). Okazało się, że nieobecność
poszczególnych rybonukleaz DCL nie wpływa znacząco na wzór akumulacji
fragmentów RNA, co sugerowało, że powstawanie tych ostatnich jest niezależne od
ścieżki biogenezy krótkich regulatorowych RNA. W kolejnym etapie naszą uwagę
skoncentrowaliśmy na potencjale regulatorowym zidentyfikowanych fragmentów RNA.
Istniały już wówczas pierwsze doniesienia na temat zdolności fragmentów RNA do
hamowania translacji in vitro, zarówno w przypadku fragmentów obecnych w soku
floemowym Cucurbita maxima [8], jak i zidentyfikowanych w komórkach ludzkich
[10]. W tym ostatnim przypadku pokazano in vitro, że w systemie ssaczym (lizat z
retikulocytów królika, ang. rabbit reticulocyte lysate, RRL) efektywnymi inhibitorami
translacji były połówki 5’ tRNA, które: (i) posiadają motyw oligoG na końcu 5’ i
równocześnie (ii) przyjmują strukturę drugorzędową, składającą się z jednoniciowego
motywu oligoG na końcu 5’, poniżej którego występuje spinka, zakończona
jednoniciowym odcinkiem na końcu 3’ [10]. Spośród zidentyfikowanych u A. thaliana
fragmentów tRNA wybraliśmy zatem trzy, które możliwie jak najlepiej spełniały
powyższe warunki, i sprawdziliśmy ich wpływ na przebieg translacji in vitro w
systemie roślinnym (ekstrakt z kiełków pszenicy, ang. wheat germ extract, WGE).
Wszystkie trzy fragmenty obniżały wydajność translacji reporterowego mRNA, przy
czym najwyższą wydajność inhibicji wykazywał fragment At-112A. Nie stwierdziliśmy
istnienia korelacji między liczbą reszt guanozynowych na końcu 5’ fragmentu RNA a
dr Paulina Jackowiak Załącznik nr 2
12
jego potencjałem inhibitorowym, co odróżniało układ roślinny od układu ssaczego [10].
Co ciekawe, zastosowany jako cząsteczka kontrolna fragment ludzkiego tRNAAla, który
wydajnie hamował translację w systemie ssaczym [10], nie miał wpływu na przebieg
translacji w systemie roślinnym. Poczynione obserwacje wskazywały z jednej strony na
istnienie pewnych ogólnych podobieństw między procesami hamowania translacji przez
fragmenty tRNA w dwóch układach eukariotycznych. Z drugiej jednak strony
sugerowały, że uwarunkowania strukturalne, które determinują właściwości
regulatorowe fragmentów RNA, są odmienne u roślin i zwierząt.
Dalsze badania poświęcone fragmentom RNA były prowadzone w ramach
kierowanych przeze mnie dwóch projektów badawczych (SONATA, NCN oraz
IUVENTUS PLUS, MNiSW). W pierwszej kolejności staraliśmy się odpowiedzieć na
pytanie, jakie fragmenty RNA powstają w ludzkich komórkach wątrobowych i czy
skład tej puli cząsteczek zmienia się pod wpływem stresu wywołanego infekcją
wirusową. Aby scharakteryzować fragmenty RNA w wybranym układzie modelowym
hodowli komórkowej HCV, nawiązaliśmy współpracę z dr Agatą Budkowską z
Instytutu Pasteura w Paryżu. Dzięki temu uzyskaliśmy możliwość wykorzystania w
naszych badaniach najlepszego dostępnego na świecie systemu hodowli komórkowej
HCV, w którym zachodzą wszystkie etapy infekcji, począwszy od wnikania cząstek
wirusowych do komórek, aż do uwalniania zakaźnych wirionów potomnych. Fragmenty
RNA zidentyfikowaliśmy za pomocą NGS, a wyniki przeprowadzonych badań
przedstawiliśmy w pracy SMALL RNA FRAGMENTS DERIVED FROM MULTIPLE RNA
CLASSES – THE MISSING ELEMENT OF MULTI-OMICS CHARACTERISTICS OF THE
HEPATITIS C VIRUS CELL CULTURE MODEL (BMC GENOMICS, 2017; publikacja nr 3).
Bardzo istotny w tej publikacji jest aspekt metodyczny, opisaliśmy w niej bowiem
opracowane przez nas podejścia ukierunkowane na analizę fragmentów RNA. Po
pierwsze, izolacja RNA obejmowała dwa etapy, w których najpierw otrzymywany był
całkowity RNA, a dopiero później rozdzielany na frakcję wzbogaconą w RNA o
długości poniżej 200 nukleotydów (<200 nt) i frakcję długich RNA (>200 nt). Do
identyfikacji fragmentów RNA wykorzystywane były tylko takie frakcje <200 nt, dla
których współczynnik integralności RNA RIN (ang. RNA integrity number) w
odpowiednich próbkach całkowitego RNA i RNA >200 nt wyniósł co najmniej 9 (gdzie
wartość 10 oznacza maksymalną integralność RNA). Zastosowane kryterium było więc
bardziej rygorystyczne niż proponowane wcześniej w literaturze dla technik
dr Paulina Jackowiak Załącznik nr 2
13
mikromacierzowych (RIN ≥8). Po drugie, jakość prób została dodatkowo potwierdzona
za pomocą elektroforezy dwukierunkowej, w której uzyskano wysoce powtarzalne
wzory akumulacji fragmentów RNA. Po trzecie, biblioteki do sekwencjonowania
rozdzielono w żelu poliakryloamidowym, następnie izolowano z niego frakcje
obejmujące cząsteczki krótsze aniżeli większość dojrzałych tRNA i poddano je
sekwencjonowaniu w 100 cyklach. W rezultacie uzyskane odczyty obejmowały pełne
sekwencje analizowanych cząsteczek. Co więcej, odczyty, dla których współczynnik
jakości Phred w przypadku choćby jednego nukleotydu był niższy niż 30 (co oznacza
dokładność przypisania zasady równą 99,9%), nie były brane pod uwagę. Zastosowane
podejście pozwoliło zatem maksymalnie zwiększyć prawdopodobieństwo, że analiza
obejmie jedynie cząsteczki powstałe w komórkach oraz że sekwencje fragmentów RNA
będą odczytane w sposób ciągły, a nie, jak to zwykle ma miejsce, odtworzone
metodami bioinformatycznymi z krótszych odczytów. Ponadto opracowane rozwiązanie
obejmowało: (i) iteracyjne mapowanie odczytów najpierw do sekwencji pochodzących
z baz danych RNA a dopiero później do genomu HCV czy ludzkiego; (ii) analizę
poszczególnych fragmentów w celu ustalenia wzorów cięcia ich cząsteczek
macierzystych; (iii) grupowanie podobnych fragmentów pochodzących z tej samej
cząsteczki macierzystej i wyodrębnienie fragmentów reprezentatywnych dla każdej
grupy (klastra) w celu określenia ich poziomów akumulacji oraz identyfikacji
cząsteczek różnicujących komórki zakażone i niezakażone.
Przeprowadzone analizy pokazały, że najliczniejsze były fragmenty pochodzące
z rRNA, tRNA (wśród nich połówki 5’) i snoRNA, przy czym rozkład długości tych
pierwszych odbiegał od pozostałych i sugerował, że reprezentują one produkty cięcia
rRNA przez procesywne egzonukleazy. Uzyskane dane wskazywały jednoznacznie, że
podobnie jak w przypadku układu roślinnego, także w komórkach ludzkich fragmenty
RNA generowane są w sposób uporządkowany i wysoce powtarzalny. W wyniku
przeprowadzonych analiz szczegółowo scharakteryzowaliśmy fragmenty pochodzące z
konstytutywnych niekodujących RNA: tRNA, snoRNA, Y RNA i snRNA. Analizując
wzory cięcia cząsteczek macierzystych stwierdziliśmy, że nie istnieje uniwersalna
ścieżka biogenezy fragmentów RNA, nawet w obrębie jednej klasy RNA. Ponadto
nasze dane dostarczyły przesłanek wskazujących, że powstawanie przynajmniej
niektórych fragmentów tRNA, Y RNA i snRNA jest procesem dynamicznym,
związanym z rearanżacjami strukturalnymi. Fragmentacja dojrzałych RNA jest zatem
dr Paulina Jackowiak Załącznik nr 2
14
mechanizmem generowania cząsteczek o zmienionej strukturze. W ten sposób
zwiększony zostaje repertuar cząsteczek istniejących w komórce. Wykazaliśmy także,
że w wybranym modelu poziomy akumulacji fragmentów RNA i miRNA są zbliżone.
Poziom akumulacji najliczniej występujących fragmentów RNA był podobny w
komórkach zakażonych HCV i niezakażonych (nie wykazywał istotnych statystycznie
zmian), co wskazywało, iż ta grupa cząsteczek jest bardzo znaczącym elementem
transkryptomu układu hodowli komórkowej HCV. Podczas infekcji HCV wzrastał
natomiast poziom akumulacji fragmentów, które w komórkach niezakażonych
występowały w stosunkowo niewielkich ilościach. Nie stwierdziliśmy jednak
powstawania znaczących ilości fragmentów pochodzenia wirusowego. Wykazaliśmy
zatem, że infekcja HCV jest czynnikiem modulującym skład puli fragmentów RNA,
jednak nie powoduje daleko idących globalnych zmian. Szczegółowa charakterystyka
fragmentów snoRNA, snRNA i Y RNA wykazała, że większość z nich zawierała
miejsca wiążące białka. Obserwacja ta miała dwojakie znaczenie. Po pierwsze
pozwoliła sformułować hipotezę, w myśl której białka wiążące RNA (ang. RNA-binding
proteins, RBPs) są ważnymi czynnikami zaangażowanymi w powstawanie i akumulację
fragmentów RNA (białka chronią wiązane regiony cząsteczek macierzystych przed
degradacją do pojedynczych nukleotydów – poszukując czynników uczestniczących w
biogenezie fragmentów RNA należy zatem zwrócić uwagę nie tylko na rybonukleazy,
ale również na białka wiążące macierzyste RNA). Po drugie zaproponowaliśmy, że
fragmenty mogą współzawodniczyć ze swoimi cząsteczkami macierzystymi o wiązanie
z białkami i w ten sposób wywierać wpływ na przebieg procesów komórkowych. Na
podstawie zarówno uzyskanych wyników jak i danych literaturowych wytypowaliśmy
szereg fragmentów RNA jako kandydatów do przyszłych badań funkcjonalnych
(przykładowe zostały opisane w dyskusji, publikacja nr 3). Obejmowały one
potencjalne: biomarkery, niekanoniczne miRNA, cząsteczki przewodnie dla tRNazy Z
czy też regulatory translacji.
Kolejnym zadaniem było określenie potencjału funkcjonalnego
zidentyfikowanych fragmentów RNA. Na tym etapie badań projektowanie testów do
analiz funkcjonalnych pojedynczych fragmentów byłoby jednak naszym zdaniem
przedwczesne i nieefektywne. Oznaczałoby bowiem podążanie wytyczonymi wcześniej
ścieżkami i mogłoby doprowadzić co najwyżej do identyfikacji np. kolejnego
pojedynczego niekanonicznego miRNA bądź cząsteczki przewodniej dla tRNazy Z.
dr Paulina Jackowiak Załącznik nr 2
15
Uznaliśmy, że znaczenie takich odkryć jest ograniczone i o wiele bardziej korzystne
będzie opracowanie strategii, która pozwoli analizować znane funkcje fragmentów
RNA w większej skali oraz poszerzy zakres poszukiwań o nowe obszary. Biorąc pod
uwagę powyższe założenie przyjęliśmy, że taka strategia powinna obejmować dwa
zasadnicze elementy: (i) analizę poziomu akumulacji mRNA jako potencjalnych
cząsteczek docelowych dla fragmentów RNA oraz (ii) identyfikację białek
oddziałujących z wybranymi fragmentami RNA.
Pierwszym etapem była zatem charakterystyka profilu ekspresji genów w
układzie modelowym hodowli komórkowej HCV. Dla jej przeprowadzenia
wykorzystane zostały frakcje >200 nt z tych samych izolatów RNA, które wcześniej
posłużyły do identyfikacji fragmentów RNA we frakcjach <200 nt. Wyniki tych badań
przedstawiliśmy w pracy RNA-SEQ-BASED ANALYSIS OF DIFFERENTIAL GENE
EXPRESSION ASSOCIATED WITH HEPATITIS C VIRUS INFECTION IN A CELL CULTURE
(ACTA BIOCHIMICA POLONICA, 2016; publikacja nr 4). Określiliśmy poziom
ekspresji genów kodujących białka, a także zidentyfikowaliśmy te z nich, które ulegają
zmienionej ekspresji po 72 i 96 godzinach od inokulacji. Wykazaliśmy, że infekcja
HCV powoduje wzrost poziomu ekspresji genów zaangażowanych w: (i) sygnalizację
zależną od kinaz aktywowanych mitogenami, (ii) sygnalizację, w której uczestniczą
adipocytokiny, (iii) cykl komórkowy, oraz (iv) metabolizm azotu. Wśród procesów
zmienionych pod wpływem infekcji były m.in.: regulacja cyklu komórkowego,
odpowiedź na stres retikulum endoplazmatycznego, odpowiedź na reaktywne formy
tlenu oraz metabolizm lipidów i aminokwasów. Wyniki zaprezentowane w
publikacjach nr 3 i nr 4 stanowią pierwszy kompleksowy opis transkryptomu układu
modelowego hodowli komórkowej HCV, obejmujący zarówno krótkie RNA (miRNA,
fragmenty RNA), jak i mRNA. Może on zostać wykorzystany przez innych naukowców
w dalszych badaniach procesów zachodzących podczas infekcji HCV w tym
oddziaływań między wirusem a gospodarzem. W naszym zespole wyniki te staną się
podstawą do stworzenia narzędzia bioinformatycznego umożliwiającego wykonanie
szeroko zakrojonych analiz potencjału funkcjonalnego fragmentów RNA in silico. Do
tej pory przeanalizowaliśmy m.in. sekwencje kilkuset fragmentów RNA pod kątem
występowania w nich cech, które mogą predysponować je do pełnienia funkcji miRNA.
Ponadto, za pomocą programów miRanda i PACCMIT przewidziane zostały
transkrypty docelowe dla wybranych fragmentów RNA. Następnie wyznaczyliśmy
dr Paulina Jackowiak Załącznik nr 2
16
współczynniki korelacji poziomów akumulacji fragmentów RNA i ich potencjalnych
docelowych mRNA. W najbliższym czasie planujemy stworzyć algorytm
umożliwiający wybranie spośród fragmentów RNA potencjalnych cząsteczek
przewodnich dla tRNAzy Z i wytypowanie mRNA, z którymi mogą one oddziaływać.
Całość zostanie zintegrowana w jedno narzędzie bioinformatyczne, które pozwoli na
bardzo wydajną, jednoczesną analizę tysięcy fragmentów RNA oraz mRNA. Sądzimy,
że zaproponowane podejście doskonale uzupełni opracowaną przez nas strategię
wszechstronnej charakterystyki fragmentów RNA.
Drugim etapem prac zmierzających do określenia potencjału funkcjonalnego
fragmentów RNA była identyfikacja oddziałujących z nimi białek. Ostatnie odkrycia
dokonane za pomocą nowych technik badawczych, takich jak fotozszywanie i
immunoprecypitacja (ang. cross-linking and immunoprecipitation, CLIP) czy
wychwytywanie interaktomu (ang. interactome capture) zmuszają nas do znaczącej
modyfikacji dotychczasowych poglądów na temat sposobów oddziaływania RNA z
białkami oraz roli tych oddziaływań. Po pierwsze ustalono, że w komórkach istnieją
tzw. sieci REM (ang. RNA-enzyme-metabolite), w których aktywność enzymów
metabolicznych jest regulowana przez cząsteczki RNA [11]. Zaobserwowano także
powszechne występowanie białek niekonwencjonalnie oddziałujących z RNA. Białka te
pozbawione są jakichkolwiek znanych domen wiążących RNA, stąd określono je
mianem „enigmRBP” [12]. Stwierdzono, że takie oddziaływania są możliwe dzięki
regionom inherentnie nieuporządkowanym, które występują w o wiele większej puli
białek, aniżeli wcześniej sądzono. Ponadto, tak zwane niespecyficzne oddziaływania
RNA-białko, które kiedyś były uznawane za przypadkowe i małoistotne, zaczęto
uważać za ważny czynnik umożliwiający organizowanie się kompleksów
funkcjonalnych oraz wspomagający tzw. typowe oddziaływania. Zaproponowano
ponadto, że w komórkach mogą powstawać „endogenne aptamery” – cząsteczki, które
dzięki określonej strukturze przestrzennej oddziałują z białkami pozbawionymi
typowych domen wiążących RNA [13, 14]. Postawiliśmy zatem hipotezę, że fragmenty
RNA są ważnymi składnikami komórkowych sieci oddziaływań RNA-białko i
doskonałymi kandydatami do pełnienia wymienionych powyżej ról. Zaproponowaliśmy
nową strategię analizy potencjału funkcjonalnego fragmentów RNA, polegającą na
identyfikacji białek, które bezpośrednio lub pośrednio z nimi oddziałują. Następnie
wybraliśmy siedem fragmentów powstających w hodowli komórkowej HCV
dr Paulina Jackowiak Załącznik nr 2
17
(pochodzących z tRNA, snoRNA i snRNA) i zidentyfikowaliśmy oddziałujące z nimi
białka obecne w lizatach komórkowych Huh-7.5, posługując się metodami RNA pull-
down oraz spektrometrii mas. Uzyskane wyniki zaprezentowaliśmy w pracy
FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF RNA FRAGMENTS USING HIGH-THROUGHPUT
INTERACTOME SCREENING (JOURNAL OF PROTEOMICS, 2018; publikacja nr 5).
Dogłębna analiza danych proteomicznych była możliwa dzięki uwzględnieniu
informacji pochodzących z wcześniej opublikowanych źródeł, w tym także danych
stanowiących podstawę do publikacji nr 4. Wykazaliśmy, że fragmenty oddziaływały
zarówno z typowymi RBP, jak i białkami nie posiadającymi znanych domen wiążących
RNA. Co więcej, były to z reguły inne białka aniżeli oddziałujące z cząsteczkami
macierzystymi fragmentów. Oznacza to, że postawiona wcześniej hipoteza dotycząca
udziału fragmentów RNA w regulacji procesów komórkowych poprzez
współzawodnictwo z cząsteczkami z których pochodzą wydaje się obecnie mało
prawdopodobna. Ujawniliśmy istnienie białek preferencyjnie wychwytywanych przez
badane fragmenty. Ponadto dla pięciu fragmentów określiliśmy główne funkcje jakie
pełnią białka tworzące z nimi kompleksy. Wśród tych funkcji było zarówno składanie
mRNA i obróbka tRNA, jak i rekombinacja/replikacja DNA czy metabolizm kwasów
karboksylowych. W dwóch ostatnich przypadkach zidentyfikowane białka nie należały
do typowych RBP. Przeprowadzona analiza pozwoliła zatem wskazać nieznane dotąd
obszary potencjalnego zaangażowania funkcjonalnego badanych fragmentów RNA i
otworzyła pole do dalszych badań. W przyszłości zamierzamy potwierdzić
występowanie odkrytych oddziaływań w układzie komórkowym, a także ustalić, czy
fragmenty RNA bezpośrednio wiążą zidentyfikowane białka, czy też tworzą
rusztowania, na których budowane są bardziej złożone kompleksy
rybonukleoproteinowe. Ponieważ jednak istniejące obecnie „RNA-centryczne” metody
wychwytywania interaktomu umożliwiają jedynie identyfikację białek związanych z
poliadenylowanymi RNA, konieczne będzie zastosowanie technik typu CLIP. W
odróżnieniu od tych pierwszych, podejścia CLIP koncentrują się na poznaniu spektrum
cząsteczek RNA, z którymi wiąże się znane białko. Wyniki naszych badań stanowią
zatem doskonałą podstawę do wytypowania kilku najbardziej interesujących białek,
których oddziaływania z RNA w komórkach zostaną w przyszłości szczegółowo
scharakteryzowane. Wykorzystanie technik typu CLIP wiąże się z koniecznością
optymalizacji istniejącej obecnie metodyki, która obejmuje trawienie preparatów
dr Paulina Jackowiak Załącznik nr 2
18
rybonukleazami. Utrudnia to dokonanie oceny, czy dane białko wiąże cząsteczkę
macierzystą, czy powstały z niej fragment RNA. Wyniki wykonanych przez nas analiz
30 zestawów danych uzyskanych przy zastosowaniu technik CLIP wskazują jednak, iż
te ostatnie mogą być z powodzeniem zastosowane do walidacji oddziaływań białek z
fragmentami RNA [publikacja nr 5].
Do tej pory scharakteryzowaliśmy ludzkie białka wiążące fragmenty RNA.
Można jednak postawić hipotezę, że fragmenty RNA oddziałują również z białkami
wirusowymi. Aby ją zweryfikować, planujemy przeprowadzić analogiczne
doświadczenia, korzystając z lizatów komórek zakażonych HCV. W tym celu
nawiązaliśmy współpracę z dr Annette Martin z Instytutu Pasteura w Paryżu. Podczas
stażu naukowo-badawczego w jej laboratorium miałam okazję poznać niezbędne
techniki wirusologiczne, a także przeprowadzić badania będące podstawą do przyszłych
testów funkcjonalnych fragmentów RNA. Z drugiej strony, zamierzamy
scharakteryzować roślinne białka oddziałujące z fragmentami RNA zidentyfikowanymi
u A. thaliana [publikacja nr 1]. Pozwoli to lepiej poznać sieci oddziaływań RNA-
białko u roślin oraz umożliwi ocenę zachowawczości mechanizmów angażujących
fragmenty RNA.
Wśród fragmentów RNA zidentyfikowanych w hodowli komórkowej HCV
[publikacja nr 3] były także fragmenty tRNA posiadające na końcu 5’ motyw oligoG.
Biorąc pod uwagę wyniki naszych badań dotyczących wpływu fragmentów RNA na
translację w układzie roślinnym [publikacja nr 2], postanowiliśmy szczegółowo
scharakteryzować cechy strukturalne tych cząsteczek, warunkujące ich zdolności
regulatorowe. Rezultaty tych prac opisaliśmy w publikacji EFFECTS OF G-
QUADRUPLEX TOPOLOGY ON TRANSLATIONAL INHIBITION BY tRNA FRAGMENTS IN
MAMMALIAN AND PLANT SYSTEMS IN VITRO (THE INTERNATIONAL JOURNAL OF
BIOCHEMISTRY & CELL BIOLOGY, 2017; publikacja nr 6). O ile w przypadku
fragmentów zidentyfikowanych wcześniej u A. thaliana motywy oligoG znajdowały się
w odcinkach jednoniciowych przewidywanej struktury drugorzędowej cząsteczek, o
tyle w przypadku fragmentów powstających w komórkach ludzkich były one
zaangażowane w tworzenie par zasad. Co więcej, jeden z fragmentów nazwany Hs-96K
przyjmował strukturę długiej spinki z trzema pętlami. Przewidywane struktury nie
spełniały zatem kryteriów, które jak wynikało z wcześniejszych badań Ivanova i wsp.
[10], warunkują wydajną inhibicję translacji. Niespodziewanie okazało się jednak, że
dr Paulina Jackowiak Załącznik nr 2
19
badane cząsteczki bardzo wydajnie hamowały biosyntezę lucyferazy w systemie
ssaczym. Ta obserwacja doprowadziła nas do wniosku, że uwarunkowania strukturalne
determinujące zdolność fragmentu RNA do inhibicji translacji in vitro są inne niż
wcześniej postulowano. Postawiliśmy hipotezę, że najważniejszym elementem jest
przyjmowanie przez fragmenty RNA struktur kwadrupleksowych. Podczas gdy nasze
badania były w toku, hipoteza ta została wsparta przez wyniki Ivanova i wsp. [15],
którzy zaproponowali, że fragmenty tRNAAla tworzą kwadrupleksy i stanowi to czynnik
determinujący ich potencjał inhibitorowy w RRL i komórkach ssaczych. Do badania
struktury RNA zastosowali oni metodę pomiaru fluorescencji N-metylomezoporfiryny
IX (ang. N-methyl mesoporphyrin IX, NMM) w roztworze oligomeru. NMM jest
barwnikiem specyficznie wiążącym kwadrupleksy. Uznaliśmy jednak, że konieczna jest
dalsza weryfikacja naszej hipotezy, w szczególności potwierdzenie zdolności
fragmentów RNA do przyjmowania struktury kwadrupleksów za pomocą metod, które
dostarczają jednoznacznych dowodów na obecność kwadrupleksu oraz pozwalają
ocenić, czy badane cząsteczki przyjmują jedną, czy też więcej konformacji. W tym celu
posłużyliśmy się spektroskopią magnetycznego rezonansu jądrowego (ang. nuclear
magnetic resonance, NMR) oraz elektroforezą w żelach poliakryloamidowych, z
zastosowaniem różnicowego barwienia. Ponadto, aby sprawdzić, czy uwarunkowania
strukturalne inhibicji translacji są uniwersalne, przetestowaliśmy wpływ fragmentów
zidentyfikowanych w A. thaliana i w komórkach ludzkich na przebieg translacji w
układzie ssaczym i roślinnym. Pięć spośród sześciu badanych fragmentów bardzo
efektywnie obniżało wydajność produkcji lucyferazy w systemie RRL. Wykazaliśmy,
że wydajne inhibitory posiadały zdolność do przyjmowania struktury kwadrupleksu a
zaburzenie tej struktury (inkubacja w roztworze chlorku litu) w dużym stopniu znosiło
ich działanie hamujące. W systemie WGE wydajność inhibicji była zdecydowanie
niższa i nie korelowała ze zdolnością fragmentu RNA do przyjmowania struktury
kwadrupleksu. Biorąc pod uwagę fakt, iż kwadrupleksy RNA wykazują zróżnicowanie
topologiczne, przetestowaliśmy w jaki sposób na translację w obu systemach wpływają
modelowe krótkie RNA przyjmujące dobrze poznane struktury kwadrupleksów o
różnych topologiach. Stwierdziliśmy, że wpływ modelowych RNA na wydajność
translacji w systemie RRL był uzależniony od topologii tworzonego przez nie
kwadrupleksu. Uzyskane wyniki stały się podstawą do postawienia hipotezy, że koniec
5’ RNA, zaangażowany w tworzenie tetrady guanozynowej, oddziałuje z elementami
dr Paulina Jackowiak Załącznik nr 2
20
maszynerii translacyjnej a jego dostępność jest kluczowa dla wywołania efektu
inhibicji. Jednocześnie stwierdziliśmy, że w systemie WGE modelowe kwadrupleksy
nie wpływały na wydajność translacji lub obniżały ją tylko w niewielkim stopniu. Te
obserwacje dowiodły, że uwarunkowania strukturalne hamowania translacji przez
fragmenty RNA w układzie ssaczym i roślinnym są odmienne.
V. Podsumowanie i perspektywy
W ramach przedłożonego osiągnięcia naukowego, opracowana została
kompleksowa strategia badania fragmentów RNA (Rys. 1).
Rys. 1. Strategia badania fragmentów RNA. Opis w tekście.
Jej pierwszym etapem jest identyfikacja indywidualnych fragmentów RNA przy użyciu
sekwencjonowania nowej generacji. Zastosowanie szeregu niestandardowych
rozwiązań, ukierunkowanych na analizę fragmentów RNA (od sposobu przygotowania
prób po analizę bioinformatyczną), umożliwia dokładną charakterystykę tej grupy
cząsteczek. Uwzględnia ona m.in. precyzyjne wyznaczenie miejsc cięcia cząsteczek
dających początek fragmentom, co daje wgląd w biogenezę tych ostatnich. W celu
ustalenia potencjału funkcjonalnego fragmentów RNA stosowane są dwa podejścia:
określenie poziomu akumulacji ich potencjalnych cząsteczek docelowych (mRNA) oraz
identyfikacja ich białkowych partnerów. Kolejnym elementem opracowanej strategii są
wstępne testy funkcjonalne wybranych fragmentów RNA, a także określenie cech
strukturalnych warunkujących zdolności regulatorowe badanych cząsteczek.
Wyniki przedstawione w publikacjach składających się na przedłożone
osiągnięcie naukowe stanowią podstawę do zaproponowania następującego nowego
modelu biogenezy i funkcjonowania fragmentów RNA (Rys. 2).
dr Paulina Jackowiak Załącznik nr 2
21
Rys. 2. Model biogenezy i funkcjonowania fragmentów RNA. Opis w tekście.
Dojrzały funkcjonalny RNA wchodzi w skład kompleksu rybonukleoproteinowego, w
którym niektóre jego regiony są związane z białkami, natomiast inne wyeksponowane
na zewnątrz kompleksu. Te ostatnie są cięte przez nukleazy, wśród których mogą być
zarówno specyficzne enzymy, takie jak angiogenina, jak również białka zaangażowane
w degradację RNA i obieg nukleotydów (ang. RNA turnover). RNA może także
podlegać hydrolizie nieenzymatycznej. Region RNA związany z białkiem jest
chroniony przed cięciem, co sprawia, że ten fragment jest stabilny i ulega akumulacji,
podczas gdy pozostałe odcinki RNA są całkowicie degradowane. Oddziaływania RNA-
białko są więc jednym z czynników wpływających na skład puli komórkowych
fragmentów RNA, określają bowiem, dlaczego te a nie inne fragmenty danej cząsteczki
ulegają akumulacji. Następnie może dojść do: (i) uwolnienia fragmentu RNA z
kompleksu rybonukleoproteinowego, rearanżacji jego struktury i związania z innym
białkiem lub kompleksem, bądź (ii) rearanżacji struktury fragmentu RNA wewnątrz
kompleksu rybonukleoproteinowego i powstania zmienionego lub nowego kompleksu.
W rezultacie fragment RNA wiąże się z innymi białkami niż jego cząsteczka
macierzysta i staje się funkcjonalny. Funkcja ta może być spełniana bezpośrednio na
drodze regulacji aktywności białek (tak jak np. podczas regulacji translacji lub
aktywności enzymów metabolicznych), bądź też pośrednio, gdy fragment RNA stanowi
rusztowanie, współuczestnicząc w budowaniu bardziej złożonych kompleksów.
dr Paulina Jackowiak Załącznik nr 2
22
Zgodnie z tym modelem, cięcie dojrzałych funkcjonalnych RNA byłoby mechanizmem
indukującym zmiany struktury, a przez to i funkcji RNA, pozwalającym zwiększyć
spektrum cząsteczek regulatorowych. Innymi słowy, w wyniku cięcia istniejący w
obrębie cząsteczki macierzystej odcinek RNA, uwalniany jest z dotychczasowego
kontekstu strukturalno-funkcjonalnego, przez co z cząsteczki pełniącej określoną rolę w
komórce wyzwalany jest fragment o odmiennej strukturze/funkcji. Rearanżacje
strukturalne mogą być daleko idące i obejmować tworzenie oddziaływań między takimi
samymi lub różnymi cząsteczkami RNA, w tym przyjmowanie struktury
kwadrupleksów.
W dalszych badaniach fragmentów RNA planuję zweryfikować przedstawiony
powyżej model oraz zidentyfikować mechanizmy regulujące powstawanie i akumulację
tych cząsteczek. Jednym z wyzwań z tym związanych, a niewymienionych w
poprzednim podrozdziale, będzie ustalenie lokalizacji subkomórkowej fragmentów
RNA. Na obecnym etapie naszych badań, jak również w kontekście aktualnego stanu
wiedzy, nie sposób stwierdzić, jak duża frakcja cząsteczek powstałych podczas
fragmentacji RNA jest funkcjonalna. Do uzyskania odpowiedzi na to pytanie mogłaby
przyczynić się m.in. analiza zachowawczości filogenetycznej poszczególnych
fragmentów. Przeprowadzenie takich badań może wkrótce stać się możliwe dzięki stale
zwiększającej się dostępności danych charakteryzujących fragmenty RNA w różnych
układach badawczych. Jeżeli nawet przyjąć negatywny scenariusz zakładający, że
cząsteczki posiadające ściśle określoną, specyficzną funkcję stanowią jedynie niewielki
procent puli fragmentów RNA, należy uznać, że ze względu na wysoki poziom
akumulacji tych cząsteczek ich obecność nie może być obojętna dla środowiska
wewnątrzkomórkowego. Rodzi to pytanie o mechanizmy, które zapobiegają
przypadkowemu włączaniu fragmentów RNA do szlaków regulacji ekspresji genów i
gwarantują utrzymanie homeostazy komórkowej.
VI. Najważniejsze osiągnięcia
1. Opracowanie kompleksowej strategii identyfikacji fragmentów RNA oraz
określania ich potencjału funkcjonalnego.
2. Scharakteryzowanie fragmentów RNA powstających w układzie modelowym
hodowli komórkowej HCV. Jest to pierwszy opis fragmentów RNA dla tego
układu i jednocześnie jeden z nielicznych dostępnych obecnie w literaturze
dr Paulina Jackowiak Załącznik nr 2
23
opisów podejmujących zagadnienie powstawania tych cząsteczek podczas
infekcji wirusowych.
3. Wykazanie, że fragmenty RNA powstają i ulegają akumulacji nie tylko w
warunkach stresowych, ale także w warunkach fizjologicznych (w roślinie
modelowej) oraz pod nieobecność infekcji wirusowej (w ludzkiej linii
komórkowej). Co więcej, fragmenty RNA występują w ilościach podobnych do
miRNA, mogą zatem stanowić ważny element transkryptomu.
4. Wykazanie, że biogeneza fragmentów RNA w roślinie modelowej i ludzkiej linii
komórkowej jest procesem uporządkowanym, podlegającym regulacji w
odpowiedzi na bodźce endogenne (w różnych organach A. thaliana) lub
egzogenne (zakażenie komórek HCV).
5. Identyfikacja ludzkich białek bezpośrednio lub pośrednio oddziałujących z
fragmentami wywodzącymi się z różnych klas RNA (tRNA, snoRNA i snRNA)
i wskazanie nowych potencjalnych obszarów zaangażowania funkcjonalnego
fragmentów RNA: (i) rekombinacji/replikacji DNA w przypadku fragmentu
snoRNA oraz (ii) metabolizmu kwasów karboksylowych w przypadku
fragmentu tRNA.
6. Wykazanie, że fragmenty RNA wchodzą w skład innych kompleksów
rybonukleoproteinowych aniżeli ich cząsteczki macierzyste.
7. Wykazanie, że zarówno w komórkach roślinnych jak i ludzkich powstają
fragmenty RNA zdolne do inhibicji translacji.
8. Wykazanie, że zdolność fragmentów RNA do przyjmowania struktury
kwadrupleksu determinuje ich zdolność do hamowania translacji w układzie
ssaczym.
9. Wykazanie, że uwarunkowania strukturalne inhibicji translacji przez fragmenty
RNA są odmienne w układzie ssaczym i roślinnym.
10. Wykazanie, że topologia kwadrupleksu tworzonego przez modelowe krótkie
RNA wpływa na ich zdolność do hamowania translacji w systemie ssaczym.
VII. Literatura uzupełniająca
[1] Mattick JS, Makunin IV. Non-coding RNA. Hum Mol Genet. 2006;15 Spec No
1:R17-29.
[2] Gagen MJ, Mattick JS. Inherent size constraints on prokaryote gene networks due to
"accelerating" growth. Theory Biosci. 2005;123:381-411.
dr Paulina Jackowiak Załącznik nr 2
24
[3] Mattick JS, Gagen MJ. Mathematics/computation. Accelerating networks. Science.
2005;307:856-8.
[4] Dickson AM, Wilusz J. Strategies for viral RNA stability: live long and prosper.
Trends Genet. 2011;27:286-93.
[5] Ariumi Y, Kuroki M, Kushima Y, Osugi K, Hijikata M, Maki M, et al. Hepatitis C
virus hijacks P-body and stress granule components around lipid droplets. J Virol.
2011;85:6882-92.
[6] Liang SL, Quirk D, Zhou A. RNase L: its biological roles and regulation. IUBMB
Life. 2006;58:508-14.
[7] Jones DM, Domingues P, Targett-Adams P, McLauchlan J. Comparison of U2OS
and Huh-7 cells for identifying host factors that affect hepatitis C virus RNA
replication. J Gen Virol. 2010;91:2238-48.
[8] Zhang S, Sun L, Kragler F. The phloem-delivered RNA pool contains small
noncoding RNAs and interferes with translation. Plant Physiol. 2009;150:378-87.
[9] Haussecker D, Huang Y, Lau A, Parameswaran P, Fire AZ, Kay MA. Human
tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing. RNA.
2010;16:673-95.
[10] Ivanov P, Emara MM, Villen J, Gygi SP, Anderson P. Angiogenin-induced tRNA
fragments inhibit translation initiation. Mol Cell. 2011;43:613-23.
[11] Hentze MW, Preiss T. The REM phase of gene regulation. Trends Biochem Sci.
2010;35:423-6.
[12] Beckmann BM, Horos R, Fischer B, Castello A, Eichelbaum K, Alleaume AM, et
al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nat
Commun. 2015;6:10127.
[13] Castello A, Fischer B, Eichelbaum K, Horos R, Beckmann BM, Strein C, et al.
Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell.
2012;149:1393-406.
[14] Beckmann BM, Castello A, Medenbach J. The expanding universe of
ribonucleoproteins: of novel RNA-binding proteins and unconventional interactions.
Pflugers Arch. 2016;468:1029-40.
[15] Ivanov P, O'Day E, Emara MM, Wagner G, Lieberman J, Anderson P. G-
quadruplex structures contribute to the neuroprotective effects of angiogenin-induced
tRNA fragments. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111:18201-6.
5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych.
W skład mojego pozostałego dorobku naukowego wchodzi 13 publikacji w
czasopismach z listy JCR oraz 9 prac w czasopismach spoza tej listy, a także jeden
patent krajowy i jeden patent europejski. Szczegółowy wykaz tych prac wraz z opisem
mojego wkładu w ich powstanie został umieszczony w Załączniku nr 4.
Badania prowadzone przeze mnie w ramach tematyki związanej z analizą
fragmentów RNA obejmowały także dodatkowe aspekty, które nie zostały włączone do
przedstawionego powyżej osiągnięcia naukowego. Pierwszym z nich było opracowanie
metody analizy porównawczej frakcji cząsteczek RNA o długości 10-90 nukleotydów.
Prace nad tą metodą rozpoczęły się w Pracowni Biologii Molekularnej Roślin (obecnie
dr Paulina Jackowiak Załącznik nr 2
25
Zakład Biologii Molekularnej i Systemowej) zanim jeszcze szeroko dostępne stały się
metody sekwencjonowania nowej generacji. Rezultaty przeprowadzonych badań
opublikowaliśmy w pracy 2D-PAGE AS AN EFFECTIVE METHOD OF RNA DEGRADOME
ANALYSIS, MOLECULAR BIOLOGY REPORTS, 2012. Wykazaliśmy, że dwukierunkowa
elektroforeza w żelach poliakryloamidowych w warunkach częściowo denaturujących
umożliwia szybką i efektywną analizę porównawczą tzw. wysokokopijnych RNA.
Zastosowanie tej metody pozwoliło udowodnić, że wzór akumulacji fragmentów RNA
jest specyficzny dla poszczególnych ludzkich linii komórkowych czy organów
roślinnych oraz że podlega zmianom w odpowiedzi na infekcję bakterii
symbiotycznych. Rozwój metod sekwencjonowania nowej generacji umożliwił dalsze
poszerzenie warsztatu służącego badaniom cząsteczek RNA. Aspekty techniczne oraz
możliwe zastosowania masowego sekwencjonowania transkryptomów opisaliśmy w
pracy TRANSCRIPTOME SEQUENCING: NEXT GENERATION APPROACH TO RNA
FUNCTIONAL ANALYSIS, BIOTECHNOLOGIA, 2011. Kolejny aspekt badań fragmentów
RNA dotyczył zastosowania metod bioinformatycznych do modelowania
nieenzymatycznego rozpadu cząsteczek RNA. Efektem prac prowadzonych we
współpracy z zespołem prof. dr hab. Jacka Błażewicza z Politechniki Poznańskiej było
stworzenie algorytmu umożliwiającego przewidywanie miejsc spontanicznej hydrolizy
cząsteczek RNA – miejsc, które w kontekście struktury pierwszo- i drugorzędowej
RNA oraz jego dynamizmu konformacyjnego są najbardziej wrażliwe na
nieenzymatyczną hydrolizę. Uzyskane wyniki przedstawiliśmy w pracy
COMPUTATIONAL PREDICTION OF NONENZYMATIC RNA DEGRADATION PATTERNS, ACTA
BIOCHIMICA POLONICA, 2016.
Pozostałe prace naukowo-badawcze, w które byłam zaangażowana zarówno
przed, jak i po uzyskaniu stopnia doktora, koncentrowały się wokół dwóch głównych
nurtów, scharakteryzowanych poniżej.
I. Polimorfizm genetyczny jako czynnik warunkujący przebieg infekcji
wirusowych
Podstawową przyczyną niepowodzeń w profilaktyce i terapii zakażeń
wywoływanych przez wirusy RNA jest ogromna zmienność genetyczna tych
patogenów. Dzięki niej w szybkim tempie powstają warianty wirusowe oporne na
działanie układu immunologicznego i stosowane leki. U podłoża tej zmienności leży
dr Paulina Jackowiak Załącznik nr 2
26
wysoce wydajne, ale nieprecyzyjne kopiowanie genomu wirusowego przez enzymy
pozbawione aktywności korekcyjnej: odwrotne transkryptazy bądź polimerazy RNA
zależne od RNA. Badania nad tym zagadnieniem rozpoczęłam w ramach realizacji
pracy magisterskiej, której tematyka koncentrowała się wokół uwarunkowań
strukturalnych rekombinacji niehomologicznej ludzkiego wirusa upośledzenia
odporności (ang. human immunodeficiency virus, HIV-1). Ich wyniki
zaprezentowaliśmy w pracy CONSTRUCTION OF A UNIVERSAL SYSTEM FOR IN VITRO
STUDIES OF HIV-1 REVERSE TRANSCRIPTASE-MEDIATED RNA RECOMBINATION, ANNALS
OF THE POLISH CHEMICAL SOCIETY, 2003. Dodatkowo przegląd literatury dotyczącej tej
tematyki przedstawiliśmy w opracowaniu HIV – POCHODZENIE, CYKL REPLIKACYJNY,
LECZENIE, NA POGRANICZU CHEMII I BIOLOGII, 2004. Szczególnym przejawem
zmienności wirusów RNA jest ich występowanie w organizmie pacjenta w formie
zbioru spokrewnionych, lecz zróżnicowanych genetycznie wariantów, tworzących
populację nazwaną quasi-gatunkiem. Moje dalsze badania, prowadzone w ramach
realizacji pracy doktorskiej, koncentrowały się właśnie wokół zagadnienia wpływu
struktury populacji wirusowej na wynik terapii. Były one wykonywane we współpracy
z prof. dr hab. Magdaleną Figlerowicz i prof. dr hab. Arletą Kowalą-Piaskowską z
Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu oraz z zespołem prof. dr hab. Jacka Błażewicza
z Politechniki Poznańskiej. Przed 2010 rokiem leczenie przewlekłego zapalenia
wątroby typu C, wywoływanego przez HCV, polegało na podawaniu interferonu alfa
(lub jego modyfikowanej pochodnej) oraz rybawiryny. Trwałą eliminację wirusa
obserwowano zaledwie u ok. 40% pacjentów zakażonych HCV należącym do
najbardziej rozpowszechnionego w Europie genotypu 1. Nie stwierdzono jednak, by
istniała jednoznaczna korelacja między cechami charakteryzującymi pacjenta a
rezultatem terapii przeciwwirusowej – nie było też wiadomo, dlaczego chorzy
charakteryzujący się podobnymi parametrami reagują w różny sposób na zastosowane
leczenie. Postawiliśmy zatem hipotezę, że to specyficzne cechy wirusa mogą
decydować o wynikach leczenia. Aby sprawdzić jej słuszność, postanowiliśmy określić
strukturę populacji HCV u dzieci przed rozpoczęciem terapii interferonem i rybawiryną
oraz po dwóch tygodniach jej trwania. Powyższa problematyka została opisana w
opracowaniu ZNACZENIE KLINICZNE ZMIAN W POPULACJI HCV W PIERWSZYCH
TYGODNIACH LECZENIA PRZEWLEKŁEGO ZAPALENIA WĄTROBY TYPU C INTERFERONEM I
RYBAWIRYNĄ, PRZEGLĄD EPIDEMIOLOGICZNY, 2005. Pierwszy etap podjętych działań
dr Paulina Jackowiak Załącznik nr 2
27
obejmował opracowanie bioinformatycznych metod analizy polimorfizmu
genetycznego quasi-gatunków HCV. Rezultaty przeprowadzonych badań zostały
opublikowane w pracy COMPUTATIONAL METHODS IN DIAGNOSTICS OF CHRONIC
HEPATITIS C, BULLETIN OF THE POLISH ACADEMY OF SCIENCES: TECHNICAL SCIENCES,
2005. Zastosowanie opracowanej metody pozwoliło na przeprowadzenie analiz
populacji HCV u dzieci. Wyniki badań zostały przedstawione w trzech pracach: (i)
ANALIZA ZMIENNOŚCI WIRUSOWEGO BIAŁKA NS5A U DZIECI Z PRZEWLEKŁYM
ZAPALENIEM WĄTROBY TYPU C – POSZUKIWANIE KORELACJI POMIĘDZY POLIMORFIZMEM
GENETYCZNYM WIRUSA A ODPOWIEDZIĄ NA LECZENIE. BADANIA WSTĘPNE, PEDIATRIA
POLSKA, 2008; (ii) HEPATITIS C VIRUS QUASISPECIES IN CHRONICALLY INFECTED
CHILDREN SUBJECTED TO INTERFERON-RIBAVIRIN THERAPY, ARCHIVES OF VIROLOGY,
2010 oraz (iii) EVOLUTION OF HEPATITIS C VIRUS HYPERVARIABLE REGION 1 IN
CHRONICALLY INFECTED CHILDREN, VIRUS RESEARCH, 2012. Zaprezentowane wyniki
były pierwszym opisem struktury quasi-gatunków HCV-1a u ponad 20 dzieci
poddanych terapii skojarzonej interferonem i rybawiryną, bądź pegylowanym
interferonem i rybawiryną. Analizując strukturę populacji przed leczeniem,
stwierdziliśmy istnienie dwóch typów quasi-gatunku HCV. Pierwszy z nich
charakteryzował się występowaniem wyraźnego dominanta, otoczonego ograniczoną
liczbą wariantów towarzyszących. Poziom zróżnicowania takiej populacji był niewielki,
a warianty łączyły ścisłe relacje filogenetyczne. Ten typ quasi-gatunku zdecydowanie
przeważał u pacjentów, którzy nie odpowiedzieli na leczenie. Drugi typ populacji HCV
charakteryzował się obecnością większej liczby zróżnicowanych wariantów o
odleglejszych związkach filogenetycznych. Występował on głównie u dzieci z
pozytywną odpowiedzią na terapię. Otrzymane wyniki wskazywały, że istnieje związek
między strukturą quasi-gatunku HCV u dzieci a rezultatem terapii. Ponadto
stwierdziliśmy, że bardzo podobne lub identyczne (na poziomie sekwencji
aminokwasowych, lecz nie nukleotydowych) warianty tzw. rejonu HVR1 glikoproteiny
wirusowej mogą występować w kilku niezależnych epidemiologicznie quasi-gatunkach
HCV, obecnych u pacjentów, którzy nie odpowiedzieli na leczenie. Świadczyło to, że
istnieją zachowawcze warianty HVR1 zapewniające wysoki poziom przystosowania,
które nie ulegają zmianom w czasie i umożliwiają przetrwanie wirusa u różnych
gospodarzy. Dodatkowym aspektem badań realizowanych w ramach powyższego nurtu
było zastosowanie metod obliczeniowych do przewidywania wyników leczenia oraz do
dr Paulina Jackowiak Załącznik nr 2
28
modelowania przebiegu infekcji HCV (TOWARDS PREDICTION OF HCV THERAPY
EFFICIENCY, COMPUTATIONAL AND MATHEMATICAL METHODS IN MEDICINE, 2010 oraz
MULTI-AGENT MODEL OF HEPATITIS C VIRUS INFECTION, ARTIFICIAL INTELLIGENCE IN
MEDICINE, 2014). Prowadzone przez nas prace zaowocowały także powstaniem trzech
publikacji przeglądowych, napisanych na zaproszenie wydawców: (i) HUMAN- AND
VIRUS-ENCODED MICRORNAS AS POTENTIAL TARGETS OF ANTIVIRAL THERAPY, MINI-
REVIEWS IN MEDICINAL CHEMISTRY, 2009; (ii) MECHANISMS INVOLVED IN THE
DEVELOPMENT OF CHRONIC HEPATITIS C AS POTENTIAL TARGETS OF ANTIVIRAL THERAPY,
CURRENT PHARMACEUTICAL BIOTECHNOLOGY, 2011 oraz (iii) PHYLOGENY AND
MOLECULAR EVOLUTION OF THE HEPATITIS C VIRUS, INFECTION, GENETICS AND
EVOLUTION, 2014.
Przełom w terapii przewlekłego zapalenia wątroby typu C przyniosło
opracowanie leków o bezpośrednim działaniu przeciwwirusowym, które stały się
dostępne w 2010 roku (początkowo jedynie w Stanach Zjednoczonych). Ich stosowanie
prowadziło do całkowitego wyeliminowania HCV u ponad 80% pacjentów. Krótko
przedtem opisano także obecność w ludzkim genomie polimorfizmu pojedynczego
nukleotydu (ang. single nucleotide polymorphism, SNP) w pobliżu genu IL28B, i
zidentyfikowano warianty polimorficzne, które są skorelowane z lepszą odpowiedzią na
leczenie interferonem i rybawiryną. W kontekście tych doniesień, postanowiliśmy
przeanalizować polimorfizm ludzkich genów kodujących białka zaangażowane w
oddziaływania z białkami lub RNA HCV. Naszą uwagę skupiliśmy na polimorfizmie
obejmującym zmiany liczby kopii odcinków genomu o długości powyżej tysiąca par
zasad (ang. copy number variation, CNV). W wyniku przeprowadzonych analiz 106
prób DNA od osób reprezentujących populację europejską, azjatycką i afrykańską
zidentyfikowaliśmy 4 geny (IGLL1, MLLT4, PDPK1, PPP1R13L), dla których
polimorfizm liczby kopii wynosił od 1 do 6. Są one obiecującymi kandydatami do
dalszych szerzej zakrojonych badań wpływu polimorfizmu genetycznego gospodarza na
przebieg zapalenia wątroby typu C. Wyniki tych badań zostały opisane w pracy COPY
NUMBER VARIATION OF GENES INVOLVED IN THE HEPATITIS C VIRUS-HUMAN
INTERACTOME, SCIENTIFIC REPORTS, 2016.
Wśród wirusów RNA występują także patogeny roślin mających duże znaczenie
gospodarcze. Należy do nich m.in. wirus mozaiki pepino (ang. pepino mosaic virus,
PepMV), jeden z najgroźniejszych wirusów infekujących pomidora. W ramach
dr Paulina Jackowiak Załącznik nr 2
29
współpracy z zespołem prof. dr hab. Henryka Pospiesznego z Instytutu Ochrony Roślin
– Państwowego Instytutu Badawczego uczestniczyłam w badaniach mających na celu
ocenę wybranych polskich izolatów PepMV. Aby to osiągnąć, zastosowaliśmy
opracowane w naszym zespole metody analizy populacji wirusowych. Najważniejszymi
efektami tych prac było wykazanie, że PepMV (izolat CH2) występuje jako quasi-
gatunek a także zidentyfikowanie pojedynczej mutacji powodującej zmianę łagodnego
patotypu PepMV w patotyp nekrotyczny. Uzyskane wyniki opisaliśmy w trzech
publikacjach: (i) PEPINO MOSAIC VIRUS – A PATHOGEN OF TOMATO CROPS IN POLAND:
BIOLOGY, EVOLUTION AND DIAGNOSTICS, JOURNAL OF PLANT PROTECTION RESEARCH,
2010; (ii) QUASISPECIES NATURE OF PEPINO MOSAIC VIRUS AND ITS EVOLUTIONARY
DYNAMICS, VIRUS GENES, 2010 oraz (iii) SINGLE MUTATION CONVERTS MILD PATHOTYPE
OF THE PEPINO MOSAIC VIRUS INTO NECROTIC ONE, VIRUS RESEARCH, 2011.
II. Mechanizmy molekularne leżące u podłoża aktywności ludzkiej deaminazy
cytydyny indukowanej aktywacją limfocytów B (ang. activation-induced cytidine
deaminase, AID)
Deaminaza cytydyny indukowana aktywacją limfocytów B (ang. activation-
induced cytidine deaminase, AID) warunkuje różnicowanie przeciwciał, deaminując
deoksycytydynę (C) w genach immunoglobulin. Enzym ten znalazł się w obszarze
moich zainteresowań badawczych, ponieważ zaburzenia ekspresji genu AID wywołane
infekcją HCV były wskazywane jako jeden z patomechanizmów przewlekłego
zapalenia wątroby typu C. Co ciekawe, biorąc pod uwagę zdolność AID do deaminacji
5-metylodeoksycytydyny (5mC), sugerowano też udział tego enzymu w aktywnej
demetylacji DNA. Informacje na ten temat zebraliśmy w pracy przeglądowej
ACTIVATION-INDUCED CYTIDINE DEAMINASE (AID): SINGLE ACTIVITY – PLEIOTROPIC
EFFECT, BIOTECHNOLOGIA, 2013. W momencie gdy rozpoczynaliśmy realizację tego
nurtu badawczego, w literaturze istniało wiele niespójnych doniesień na temat
funkcjonowania AID, co było powodem powstania licznych kontrowersji dotyczących
fizjologicznej roli tego enzymu. W szczególności, uwarunkowania strukturalne
aktywności AID wobec różnych substratów nie zostały w pełni poznane. Ich określenie
stało się zatem celem naszych badań.
Pierwszym problemem, który należało rozwiązać, było opracowanie metody
otrzymywania aktywnej ludzkiej AID (hAID), ponieważ enzym ten nie był dostępny
dr Paulina Jackowiak Załącznik nr 2
30
handlowo. Wybraliśmy do tego celu układ bakteryjny jako najbardziej wydajny z
dostępnych systemów ekspresyjnych. Podejmowane wcześniej przez inne zespoły
badaczy próby otrzymywania AID w układzie prokariotycznym kończyły się
niepowodzeniem, gdyż uzyskane białko nie posiadało aktywności enzymatycznej, bądź
preparaty były zanieczyszczone bakteryjną deaminazą cytydyny. Opracowana przez nas
metoda okazała się bardzo efektywna i pozwoliła na otrzymanie aktywnej hAID, która z
powodzeniem mogła zostać wykorzystana do dalszych badań biochemicznych. Prace te
zaowocowały przyznaniem patentu krajowego nr 225333 (2017) oraz europejskiego
EP2870241 (2018) (publikacja PRODUCTION OF AN ACTIVE HUMAN AID ENZYME IN A
BACTERIAL SYSTEM, BIOTECHNOLOGIA, 2016). Przeprowadzenie procedury patentowej
było możliwe m.in. dzięki pozyskaniu przez nas finansowania w ramach poddziałania
1.3.2 Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka na lata 2007-2013. Preparat
hAID uzyskany przy zastosowaniu zaproponowanej przez nas procedury został
wdrożony do sprzedaży, stając się pierwszym dostępnym komercyjnie w skali
światowej. Osiągnięcie to zostało wyróżnione w 2015 nominacją do Nagrody Marszałka
Województwa Wielkopolskiego „i-Wielkopolska - Innowacyjni dla Wielkopolski” dla
Genesius Sp. z o. o. wraz z ICHB PAN.
Dalsze działania realizowane w ramach tego nurtu badawczego skupiły się na
określeniu wpływu wybranych mutacji w hAID na jej zdolność do deaminacji C, 5mC i
5-hydroksymetylodeoksycytydyny (5hmC) w obrębie jednoniciowego DNA (ssDNA) in
vitro. Otrzymaliśmy hAID typu dzikiego (wt hAID) oraz trzy zmutowane formy tego
enzymu (R50A, N51A i R190X). Zbadaliśmy ich aktywność wobec substratów
zawierających pojedynczy docelowy motyw sekwencyjny (AGCT, AG5mCT lub
AG5hmCT). Następnie przetestowaliśmy aktywność wt hAID oraz N51A wobec
ssDNA zawierających wszystkie możliwe motywy NNCN. Wykorzystując
modelowanie homologiczne i symulacje dynamiki molekularnej, scharakteryzowaliśmy
oddziaływanie wt hAID oraz N51A z metylowanym i niemetylowanym substratem.
Wykazaliśmy, że żaden z testowanych wariantów hAID nie deaminował 5hmC.
Ponadto stwierdziliśmy, że aktywność deaminazowa wariantów hAID wobec C nie
korelowała z ich aktywnością wobec 5mC. Szczególnie interesujący był przypadek
mutanta N51A, który był pozbawiony aktywności wobec C i jednocześnie zdolny do
deaminacji 5mC. Zidentyfikowaliśmy następujące trzy kluczowe elementy warunkujące
deaminację C lub 5mC: (i) sieć oddziaływań między kieszenią katalityczną enzymu a
Recommended