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Aggiornamento sugli Aspetti Clinici della Procreazione
Medicalmente Assistita Prof. Marco FILICORI
GynePro Riproduzione Centri Medici GynePro
Bologna
www.gynepro.it
Aggiornamenti sulla PMA
aspetti legali e legislativi procedure diagnostiche
AMH/AFC ERA PGD/S
la stimolazione ovarica ciclo spontaneo prevenzione OHSS (GEC)
supporto fase luteale
Aspetti legali e legislativi
Legge 40/2004 Sentenza del Corte Costituzionale Linee guida Ministero della Salute Sentenze di Tribunali Ordinari Sentenza della Corte Europea dei Diritti dell’Uomo
Legge 40, 19 Febbraio 2004 e Sentenza della Corte Costituzionale del 31 Marzo 2009
Articolo 14 Comma 2. Non devono creare un numero di embrioni superiore a quello
strettamente necessario ad un unico e contemporaneo impianto, comunque non superiore a tre.
Comma 3. Qualora il trasferimento nell'utero degli embrioni non risulti possibile per grave e documentata causa di forza maggiore relativa allo stato di salute della donna non prevedibile al momento della fecondazione è consentita la crioconservazione degli embrioni stessi fino alla data del trasferimento, da realizzare non appena possibile. Illegittimità costituzionale nella parte in cui non prevede che il trasferimento degli embrioni, da realizzare non appena possibile, come stabilisce tale norma, debba essere effettuato senza pregiudizio della salute della donna per estensione rispetto alla legge 194/1978, sia la salute fisica che
mentale della donna
Revisione del Ministero della Salute delle linee guida sulla procreazione medicalmente assistita, 30 Aprile 2008
versione 21 Luglio 2004 revisione 30 Aprile 2008
Sentenze tribunali ordinari e regionali Procreazione Medicalmente Assistita
ordinanza Tribunale di Firenze, 26 Agosto 2008 solleva questione di legittimità costituzionale dell'art. 14
sentenza Tribunale di Cagliari, 22 settembre 2007 “deve essere dunque affermata la liceità della diagnosi preimpianto… “
sentenza TAR del Lazio, 31 ottobre 2007 annulla le Linee Guida laddove si statuisce che ogni indagine relativa allo stato di salute degli embrioni
creati in vitro, ai sensi dell'articolo 13, comma 5, dovrà essere di tipo osservazionale.
sentenza Tribunale di Bologna, 29 Giugno 2009 sentenzia che: il Centro esegua l’applicazione delle metodiche di PMA previa diagnosi preimpianto di un
numero minimo di 6 embrioni, provvedendo alla crioconservazione per un futuro impianto degli embrioni risultati idonei che non sia possibile trasferire immediatamente …..
sentenza Tribunale di Salerno, 9 Gennaio 2010 pazienti non ammessi al programma di PMA per mancanza della condizione di sterilità richiesta dall’art.
4 della Legge 40/2004 definisce “la diagnosi preimpianto, al pari della altre diagnosi prenatali, una normale forma di
monitoraggio con finalità conoscitiva della salute dell’embrione…. “ e sentenzia che: “Deve pertanto affermarsi, ….., il diritto dei ricorrenti coniugi a …. diagnosi preimpianto degli embrioni da prodursi e di trasferimento nell’utero di embrioni che non evidenzino la mutazione del gene dell’Atrofia Muscolare Spinale (SMA1)…. “
Corte Europea dei Diritti dell’Uomo Diagnosi pre-impianto
Sentenza del 28 Agosto 2012 Coppia di portatori sani di fibrosi cistica, con figlia affetta nata nel 2006
e IVG eseguita nel 2010 in gravidanza con feto affetto a cui non era stato permesso l’accesso a procedure di PMA in quanto non sterili
Condanna il Governo Italiano per violazione dell’art. 8 della Convenzione per la Salvaguardia dei Diritti dell’Uomo e delle libertà fondamentali
Novembre 2012 Il Governo Italiano presenta ricorso contro la sentenza
Febbraio 2013 la Corte Europea boccia il ricorso
Aggiornamenti sulla PMA
novità legislative procedure diagnostiche
AMH/AFC ERA PGD/S
la stimolazione ovarica ciclo spontaneo prevenzione OHSS (GEC)
supporto fase luteale
Selezione dei pazienti
valutazione della riserva ovarica approcci tradizionali
età livelli sierici di FSH
nuovi parametri bioumorali antral follicle count (AFC) livelli sierici di Anti-Müllerian Hormone (AMH)
Standardizzazione della antral follicle count (AFC)
strumentazione ecografo bi- o tridimensionale sonda transvaginale bi- o tridimensionale di almeno 7 MHz
e risoluzione ≥ 2 mm
più accurato in donne con cicli mestruali regolari
eseguire preferibilmente il 2°- 4° giorno di un ciclo mestruale spontaneo
contare i follicoli di 2-10 mm in entrambe le ovaie
Broekmans et al, Fertil Steril 94:1044, 2010
r = 0.71, p < 0.001
AMH level (μg/L) 0 2 4 6
10
20
30
0
Folli
cle
num
ber
Correlazione dei livelli di AMH con il conteggio dei follicoli antrali (AFC)
de Vet et al, Fertil Steril 77:357, 2002
Livelli sierici di AMH nel corso della vita e del ciclo mestruale
principali cause di calo dell’AMH età patologia ovarica (POF) interventi chirurgici sull’ovaio
La Marca et al, Hum Reprod 21:3103, 2006
Overbeek et al, RBM Online 24:664, 2012
Lee et al, Reprod Biol Endocrinol 7:100, 2009
Misurazioni di AMH ed AFC
forniscono un’indicazione sulla potenziale riserva ovarica (risposta follicologenetica alla stimolazione ormonale) e la possibilità di recupero ovocitario all’OPU
non permettono di prevedere la qualità ovocitaria ed embrionale (aneuploidie)
pertanto sono solo debolmente predittivi del possibile successo delle tecniche di PMA (gravidanza clinica)
Aggiornamenti sulla PMA
novità legislative procedure diagnostiche
AMH/AFC endometrio (ERA, P) PGD/S
la stimolazione ovarica ciclo spontaneo prevenzione OHSS (GEC)
supporto fase luteale
Key Factors Determining Clinical Outcome in IVF
Identification of the viable embryo
60%-90% of transferred embryos do not implant or die.
15% of cycles end in implantation failure of endometrial origin.
Identification/Modification of receptive endometrium
Window of Implantation
Preovulatory endometrial biopsy features in spontaneous and stimulated menstrual cycles
DAY OF OVULATION SPONTANEOUS CYCLE
no secretory features
DAY OF OOCYTE RETRIEVAL GnRH AGONIST AND GONADOTROPIN
STIMULATION CYCLE
evident secretory features
Pellicer, 2012
Correlations between progesterone levels (area under the curve) and gonadotropin activity administered
Filicori et al, Hum Reprod 17:2009, 2002
FSH activity administered (IU)1000 2000 3000 4000 5000
P A
UC
(ng/
mL.
day)
0
5
10
15
20
LH activity administered (IU)0 500 1000 1500 2000 2500
0
5
10
15
20r=0.447P<0.0005
r=0.010P NS
THECA CELLS
cholesterol
pregnenolone
progesterone
androgens
estrogens
P450scc
3b-HSD
P45017a
P450arom X
LH/CG
blood
X
cholesterol
pregnenolone
progesterone
androgens
estrogens
P450scc
3b-HSD
P45017a
P450arom
GRANULOSA CELLS
X
LH/CG in LFP FSH
X
BM blood
Serum progesterone on hCG day and ongoing pregnancy rates in IVF
* p < 0.001 * MH test for trend
n=3,972
Serum P on day of hCG (ng/mL)
pre
gnancy r
ate
s (
%)
Bosch et al, Hum Reprod 25:2092, 2010
Duration of pre-hCG progesterone elevation (>1 ng/ml) and clinical pregnancy rates in IVF
Huang et al, Hum Reprod 27:2036, 2012
Aggiornamenti sulla PMA
novità legislative procedure diagnostiche
AMH/AFC endometrio (ERA, P) Antonio PGD/S
la stimolazione ovarica ciclo spontaneo prevenzione OHSS (GEC)
supporto fase luteale
E2 valerate 6 mg/day
P 800 mg/day
NATURAL CYCLE The endometrial biopsy must be taken on the 7th day after the LH surge (LH+7) (urine or serum preferible).
HORMONE REPLACEMENT THERAPY CYCLE The endometrial biopsy must be taken on day P+5, after proper E priming ( at least 10 days).
Endometrial Receptivity Array (ERA) - Timing of the biopsy
Pellicer, 2012
Gene name Natural cycle COH IUD
Glutathione peroxidase 3 +25.87 -11.81 -13,4 Placental protein 14 +81.61 -9.83 -10.18 FXYD domain containing ion transport regulator 2 +4.07 -4.53 -9,43 Dipeptidylpeptidase 4 +31.37 -37.14 -8.47 Leukemia inhibitory factor +36.62 -23.02 -4.57 Insulin-like growth factor binding protein 3 +4.00 -4.26 -3.76 Growth arrest and DNA-damage-inducible, alpha +8.03 -3.03 -3.52 Hyaluronan binding protein 2 +5.90 -6.41 -3,42 Endothelin receptor type B +8.21 -3.20 -3.41 Leiomodin 1 +29.73 -4.08 -3.10 Calponin 1, basic, smooth muscle +10.31 -9.26 -2.86 Clusterin +28.78 -7.13 -2.79 Transgelin +8.38 -3.72 -2.73 Cytochrome P450, family 2, subfamily C, polypeptide 9 +2.48 -4.66 -2,49 Inositol -1 -monophosphatase 2 +5.23 -5.88 -2.23 Calpain 6 -4.58 +10.32 +11.20 Tissue factor pathway inhibitor 2 -3.52 +5.42 +7.32 Mitogen-activated protein kinase kinase 6 -4.87 +8.65 +6.57 Catenin , alpha 2 -8.44 +7.32 +6.40 Sorbitol dehydrogenase -2.42 +11.56 +5,87 Major histocompatibility complex, class II, DO beta -16.48 +12.23 +4.93 Branched chain keto acid dehydrogenase E1, beta polypeptide -3.33 +10.32 +4.06 Aldehyde dehydrogenase 3 family, member B2 -3.12 +4.28 +3.52 NDRG family member 2 -5.98 +5.90 +3.35 Folate receptor 1 -10.49 +9.30 +2.53
Consensus genes for endometrial receptivity
-298 Genes -Probe selection: “Cross-linking”
-569 probes -8 copies per probe
-Controls
Agilent e-array: https://earray.chem.agilent.com/earray/
Patented in 2009: PCT/ES 2009/000386
Endometrial Receptivity Array (ERA)
Pellicer, 2012
.
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
non-receptive sample NR2
non-receptive sample NR1
receptive sample RC1
receptive profile
Endometrial Receptivity Assay (ERA) outcome
Pellicer, 2012
Aggiornamenti sulla PMA
novità legislative procedure diagnostiche
AMH/AFC ERA PGD/S
la stimolazione ovarica ciclo spontaneo prevenzione OHSS (GEC)
supporto fase luteale
Patologie diagnosticabili con la diagnosi pre-impianto (PGD)
malattie autosomiche recessive fibrosi cistica atrofia muscolare spinale talassemia anemia falciforme
malattie autosomiche dominanti distrofia miotonica corea di Huntington malattia di Charcot-Marie-Tooth rene policistico sindrome di Marfan
malattie legate al cromosoma X sindrome da X fragile distrofia muscolare di Duchenne emofilia A
Incidence of aneuploidy in over 20,000 oocytes
Kuliev et al, RBM Online 22:2, 2011
Analisi genetiche invasive nella PMA
Diagnosi pre-impianto Preimplantation Genetic Diagnosis – PGD
mirata al riconoscimento di patologie genetiche già identificate nei genitori e/o nella famiglia
Screening pre-impianto Preimplantation Genetic Screning – PGS
finalizzata all’identificazione di embrioni aneuploidi privi di possibilità di normale ulteriore sviluppo
teoricamente dovrebbe permettere di migliorare le probabilità di successo delle tecniche di PMA
Biopsia per PGS
ovocita solo 1° o 1° e 2° globulo polare
embrione in 3° giorno asportati 1 o 2 blastomeri congelamento o transfer in 5° giorno
blastocisti in 5° giorno asportate cellule del trofoectoderma congelamento o transfer in 6° giorno
FISH (fluorescence in-situ hybridization) solitamente analizzati solo alcuni cromosomi (13, 18, 21, x, y) può sovrastimare le aneuploidie quando applicata clinicamente non ha permesso di migliorare i tassi
di gravidanza
comprehensive chromosome screening (CCS) microarray CGH (comparative genomic hybridization)
amplificazione dell’intero genoma che permette l’analisi dei 22 autosomi e dei 2 gonosomi (x, y)
microarray SNP (single nucleotide polymorphism) il microarray contiene sonde per identificare i SNP può fornire maggiori informazioni rispetto alla CGH (origine parentale
delle aneuploidie, dati su crossover)
quantitative PCR (polymerase chain reaction) non richiede l’amplificazione del genoma
Tecniche per l’analisi genetica
Limiti della PGS
in pazienti di età elevata: ridotto numero di ovociti ed embrioni diminuite possibilità di sviluppo a blastocisti
presenza di mosaicismi nell’embrione possibilità di autocorrezione delle
aneuploidie blastocisti: discrepanze genetiche tra
trofoectoderma e massa cellulare interna
Status della tecnologia per la PGS nel 2013
PGS con tecnica FISH finora non si è dimostrata efficace per migliorare l’efficacia delle
tecniche di PMA Mastenbroek et al, Hum Reprod Update 17:454, 2011
PGS con tecnica microarray CGH appare promettente per una più efficace e sicura identificazione
degli embrioni aneuploidi Rubio et al, Fertil Steril, in press, 2013 (disponibile online)
Aggiornamenti sulla PMA
novità legislative procedure diagnostiche
AMH/AFC ERA PGD/S
rendere la stimolazione ovarica più sicura e accettata ciclo spontaneo user friendly prevenzione OHSS (GEC)
Terminology of ovarian stimulation Nargund et al, Hum Reprod 22:2801, 2007
natural cycle IVF spontaneous menstrual cycle, no drugs used
modified natural cycle IVF (MNC-IVF) 1. only hCG is used to trigger final follicle maturation, luteal
support optional 2. GnRH antagonist and FSH/hMG added in late stimulation, hCG to
trigger final follicle maturation, luteal support (progesterone or hCG) administered
mild IVF low dose gonadotropins and GnRH antagonist administered
conventional IVF standard IVF with full dose gonadotropins and GnRH agonists or
antagonists
Come rendere la stimolazione ovarica «user friendly»
via di somministrazione dei farmaci sottocutanea piuttosto che intramuscolare possibile sia con farmaci ricombinanti che di derivazione umana
altamente purificati
sistemi ad elevate concentrazioni di farmaco e con dosi facilmente modulabili sistemi multidose o con penna tarabile
riduzione della frequenza di somministrazione modifiche strutturali della molecola ormonale
Semplificazione dei metodi di stimolazione ovarica
FSH HP di derivazione umana siringhe pre-riempite da 75, 150, 225 e 300 UI
hMG HP di derivazione umana flaconi multidose da 600 e 1.200 UI
FSH ricombinante a penne pre-riempite da 300, 600 e 900 UI
FSH ricombinante b cartucce per penna da 300, 600 e 900 UI
corifollitropina a
Trigger della maturazione follicolare e ovocitaria
human Chorionic Gonadotropin (hCG) cicli con soppressione con GnRH agonisti o GnRH
antagonisti hCG ricombinante
flaconi 250 mg (7-8.000 UI hCG)
penna a dosi modulabili hCG di derivazione umana
formulazione unica 10.000 UI in 1 mL, modulabile
agonisti del GnRH solo in cicli di soppressione con GnRH antagonisti
triptorelina 200 mg, s.c. leuprorelina 1.000 mg, s.c. buserelina 500-750 mg, s.c.
Uso degli agonisti del GnRH per il trigger dell’ovulazione
g. -7 g. +2 g. +6 giorno del ciclo
FSH/hMG
GnRH antagonista
GnRH agonista
clinical G. E. Cognigni W. Ciampaglia F. Infante P. Pocognoli C. Tabarelli S. Taraborrelli M. Pavanati
laboratory L. Parmegiani S. Bernardi E. Troilo A. Arnone A. Maccarini A. Rastellini S. Lanzilotti
paramedics C. Aliprandi P. Ferrari G. Mattace S. Poli G. Nowbuth G. Tomacelli
administration J. Filicori R. Avella D. Morselli D. Balboni G. Benassi S. Trombin
reception & tech S. Agnini C. Cavallin G. Corazza S. D’Alessandro F. Fedon V. Maleca R. Pancaldi P. Rampa D. Scapuzzo E. Stasi
psychologists E. Dumit G. Rifelli
geneticist E. Pompilii
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