超速离心技术在 生物医学中的应用

超速离心技术在超速离心技术在生物医学中的应用生物医学中的应用

赵 勇 博士

中山大学生命科学学院

中心已将本次培训讲座录制视频，需要视频的老师和同学请带移动硬盘到科技楼北 810 房（原北 806 房）进行拷贝。

内容：

• 超速离心的基本方法

• 离心转子的选择

• 如何用超速离心做研究

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破碎细胞提取 DNA

破碎细胞提取 DNA

破碎细胞提取 DNA

破碎细胞提取 DNA

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15N 培养基

14N 14N 14N14N

14N/ 14N

15N/ 15N

15N/ 14N 15N/ 14N

14N/ 14N

Meselson-Stahl 实验

DNA 半保留复制实验 ----CsCl 离心

离 心 方 法离 心 方 法

• 差速离心法

• 速率区带离心法

• 等密度梯度离心法密度梯度离心法

离心方法 - 差速离心法• 差速离心法（ Differential Centrifugation) 特点：最常用的方法操作简便，但其分离的纯度不高。 基本原理：逐次增加离心力，每次可沉降样品溶液中的 一些 组分。

在这种方法中，离心管在开始时装满了均一的样品溶液（见图）。通过在一定速度下一定时间的离心后，就可得到两个部分：沉淀和上清。

沉降系数 （ s ）

离心方法 离心方法 - - 差速离心法差速离心法

差速离心后的细胞组分－组织样品的亚细胞分离－

离心管中离心前后的样品

离心方法 离心方法 - - 密度梯度离心法密度梯度离心法（ Density Gradient Centrifugation ）

v = 沉降速率d = 颗粒直径 ( 流体力学等效球体 )Pp = 颗粒密度P1 = 液体密度η= 介质粘度g = 离心力

•  颗粒沉降速率和它的大小成比例。• 沉降速率和它自身密度与周围介质密度之间的差别成比例。 • 当颗粒密度等于周围培养基密度时，沉降速率为 0 。• 沉降速率随着介质粘度的增加而降低。 • 沉降速率随着离心力的增加而增加。

离心方法 离心方法 - - 速率区带离心法速率区带离心法

离心前，在管中预先装入密度梯度介质；而样品铺在梯度介质上– 利用各颗粒在梯度介质中的沉降速度

不同，使具有相同沉降速度的颗粒处于同一梯度层内而达到分离的目的

– 样品颗粒的密度必须大于梯度柱中任何一点的密度；在最大颗粒沉降到管底前必须停止离心

（ Rate Zonal Centrifugation ）

离心方法 离心方法 - - 速率区带离心法速率区带离心法速率区带离心常用的介质

蔗糖 细胞器、病毒、大片断 DNA 、 RNA

聚蔗糖（ Ficol

l ）分离各种细胞、细胞器（淋巴、肝、肿瘤、血）

Percoll SiO2/PVP 复合物，细胞、细胞器分离氯化铯（ CsC

l ）DNA 、 RNA 、病毒、脂蛋白

卤化物 K(Na)Br(I) 脂蛋白、 RNA

离心方法 离心方法 - - 等密度梯度离心法等密度梯度离心法

– 分离效果取决于颗粒密度差异– 分离前，样品与梯度介质混合

一起– 在离心时，梯度介质在管中重

新分布，自我形成梯度– 样品颗粒随着梯度的分布在管

中沉降或上浮，直到与其密度相等的介质处停留

（ Isopycnic Centrifugation ）

可以自我形成的物质

• CsCl 自形成梯度

• 碘盐自形成梯度（ Nycodenz 或 metrizamide ）

• 胶体硅（ Percoll ）自形成梯度

离心方法选择离心方法选择

速率区带离心 等密度梯度离心通常应用蔗糖 通常应用氯化铯密度相近大小不等 密度相差较大

最大的梯度密度低于最小密度的沉降样品

最大的梯度密度大于密度最大的沉降样品

在最高的沉降物质达到管底前停止，短时间，低速度

使各组分沉降到其平衡的密度区，长时间，高速度

区别速率区带离心和等密度梯度离心

密度梯度离心法介质的选择介 质 DNA RNA 核蛋白 膜 亚细胞 细胞 病毒

蔗 糖 — — + ++ +++ + ++

聚蔗糖 — — — + + +++ ++

氯化铯 +++ ++ + — — — ++

细颗粒硅溶胶 — — — + ++ ++ +

碘化物 + + +++ +++ +++ ++ ++

*+++ 很好， ++ 好， + 可以，— 不适用

转 头转 头

纯 度

分 离 速 度

垂直转头 近垂直转头 固定角转头 水平转头

转头 --- 离心技术的核心

转头选择：定角转头转头选择：定角转头• 在离心过程中，离心管与轴之间的角

度是固定的。• 优点

– 沉降效率高。

– 非常好的适用性，容量范围也很广，从几拾微升到几百毫升的样品都可处理。

• 基本应用范围： – 亚细胞器片段的差速沉降。 – 脂蛋白的差速悬浮分离。

转头选择：水平转头转头选择：水平转头

• 在离心过程中，离心管与轴之间的角度从开始 0变成 90，停止时又成为 0 。

• 优点– 由于长通径，因此可以得到最好的纯度。 – 可以使用开口离心管，因此装卸样品量较大。

• 基本应用范围： – 等密度的亚细胞片段的分离和亚细胞器的沉降。

– 蛋白复合体､亚细胞器的速率区带离心。 – 病毒､ DNA 的等密度梯度分离。  

转头选择：垂直转头转头选择：垂直转头• 分离机理与固定转头相似，但与轴之间的角

度为 0°

• 优点– 分离效率最高。 – 样品密度可达 1.7g/ml ，两个小时就可完成质粒

DNA 的分离。

• 基本应用范围： – 等密度的质粒 DNA 的分离。 – 亚细胞器片段的等密度分离。 – 蛋白质的速率区带分离。 – 脂蛋白的等密度分离。

转头选择：近垂直转头转头选择：近垂直转头

• 转头的设计是基于垂直转头，弥补其低沉淀回收率的不足，离心管与轴之间的角度少于 10° 。

• 优点– 可承受与垂直转头同样的速度，但可达到固定

转头所能达到的分离样品的纯度。 – 分离较快，而且密度可达 1.7g/ml 。

• 基本应用范围 – 等密度的质粒 DNA 的分离。 – 等密度的脂蛋白的分离。

密度梯度在不同转子中的形成

转子的选择

Type of rotorType of separation

Pelleting Rate-zonal IsopycnicFixed-angle Excellent Poor Poor

Vertical Poor Good Good

Swing-out Inefficient Excellent Adequate

收集细胞或组织勻浆 细胞破碎

通过差速沉淀离心方法浓缩细胞器

利用密度梯度离心方法

纯化细胞器

5 000 x g10 分钟

30 – 100 000 x g1 – 6 小时

（超过一次）

100 000 -1 000 000 x g2 - 24 小时

台式 / 高速 / 大容量离心机

超速 / 高速离心机 超速离心机

分离细胞的常用方法

肝组织细胞中亚细胞结构的分离肝组织匀浆液

沉淀物（细胞核）

沉淀物（线粒体）

上清液

沉淀物（溶酶体）

上清液

沉淀物（核糖体）

上清液

上清液

1,000 g ， 10分钟

3,300 g ， 10分钟

16,300 g ， 20分钟

100,000 g ， 30分钟

差 速 离 心

肝组织细胞中核糖体亚基的分离沉淀物

沉淀物( 核糖体 , 70S ）

444,000 g

沉淀物

沉淀物( 核糖体亚基 , 30S, 50S ）

30,000 g

25-40% 蔗糖梯度

268,000 g

水解

速度区带离心

NaBr 梯度分离血清脂蛋白人全血

100g

血细胞 血清NaBr 密度梯度离心

血清

NaBr 剃度

血清蛋白

VLDLLDLHDL

速率区带离心

质粒 DNA 的分离纯化细菌沉淀

质粒 DNA 溶解于10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA,

pH 7.6 缓冲液纯化

每毫升溶液加入 1g CsCl 和 0.6mg EB ，加入 Triton X-100 使其最终浓度为 0.01%

离心分离

NaOH-SDS 方法得到粗制的质粒 DNA

等密度梯度离心

个 人 的 研 究 经 历

Telomere End Structure(Telomeric Overhang)

T-loop formation Telomerase extension

Question: Whether or not both ends of chromosome have a long overhang

Determination of the Length of the Telomeric Overhang

Is there an overhang at each end of each chromosome?

Replication of the Chromosome End

3’5’

Replication complex

3’

3’

TTAGGG

AATCCC

5’

5’

+Lagging

Leading

5’ 3’

5’3’ ChromosomeLaggingLeading

TTAGGGAATCCC

Separation of Leading and Lagging Telomeres

3’

3’

TTAGGGTTAGGG

AATCCCAATCCC

5’

5’

Lagging

Leading

AATCCCAATCCC

TTAGGGTTAGGG

T → BrdUCsCl

Zhao Y et al. Nucl. Acids Res. 2008.

Lagging Telomeres have a Much Longer Overhang than the Leading Telomeres

384

96

54

36

21

+ - + -LagLead

Exo I

Mean Length: 30 110 nt

Zhao Y et al. Nucl. Acids Res. 2008.

Long overhang is present at one end of the chromosome

How to study telomerase extension during one cell cycle

Telomerase Extension of Telomeric Overhang

hTERThTRtemplate

Telomere

The Strategy to Study Telomerase Extension

3’5’

TTAGGG-3’

AATCCC-5’

Telomerase

TTAGGG-3’Replication

In BrdU

Un-extended

Extended (L)DSN CsCl

DSN= Duplex Specific Nuclease

Thymidine

Thym+BrdU

1.72 1.74 1.76 1.78 1.80 1.82 1.840

1

2

3

100% Ends of Telomeres Were Extended by Telomerase in H1299 Cells

Zhao Y et al. Cell.  2009.

1.72 1.74 1.76 1.78 1.80 1.82 1.840

1

2

3 T/BrdUThy

Sig

na

l Int

en

sity

Density (g/ml)

(50%/50%)

BrdU

Un-extended

Extended

Full-BrdU

Telomere Length Maintenance in Human Cancer Cells

Replication induced overhang

(~60nt)

Telomeraseextended overhang

(~60nt)

50% 50%

~126nt

Telomerase add~60nt to each telomere

19kb —

7.7kb —6.2kb —

4.3kb —3.5kb —

2.7kb —

1.9kb —

1.5kb —

0.9kb —

In the absence oftelomerase

35PD 0

Tel-shortening: 55 ( bp/PD )

54—96—

250—

400—

1600—

Exo I ＋ －

Overhang Length

~126nt

Zhao Y et al. Mol Cell. 2011

Dogma: Telomerase Preferentially extend the shortest

telomere

Sucrose Gradient Separation of Long and Short Telomeres

To

tal

Gradient

Long telomeres

short telomeres

Telomerase Extension of Telomeres is not Length Dependent

Long Telomeres

Short Telomeres

谢 谢 ！