OLEH

SITI NURLELA (B1J007010)

Pembimbing I : Dr. Sc. Agr. Nurtjahjo Dwi S., M.App, Sc.

Pembimbing II : Ir . Budi Prakoso , M.Sc. D.Tech. Sc

Kecipir dengan nama latin Psopocharpus tetragonolobus termasuk dalam family leguminoceae yang tumbuh secara merambat, dan mempunya ciri morfologi bentuk daun trifolia, bunganya berwarna putih, biru, dan ungu, buahnya berbentuk polong bersegi.

Tanaman kecipir mampu hidup pada tanah berbahan organik rendah, maupun tanah berpasir , suhu udara 150 – 320 , dan mampu beradaptasi di datarn rendah maupun didataran ketinggian hingga 2000 m diatas permukaan laut (dpl)

Sunrjono dalam Rukaman (2000) menyatakan kecipir yang umum dibudidayakn di Indonesia ada 2 jenis yaitu : (1) kecipir polong pendek dengan bunga berwarna ungu, ukuran biji besar. (2) kecipir polong panjang dengan bunga berwarna putih dan ukuran biji lebih kecil.

Tanaman kecipir di Indonesia produktifitasnya relatif rendah karena kurangnya perhatian petani untuk tanaman ini, padahal tanaman ini mempunyai manfaat seperti, kandungan proteinnya pada biji (32,8%) bisa digunakan sebagai bahan pangan.

Salah satu cara peningkatan keragaman kecipir secara genetik bisa melalui teknik mutasi dengan bahan kimia seperti Ethyl methane sulphonate dengan hasil tanaman tahan terhadap penyakit.

Pemecahan kendala keragaman genetik yaitu ditemukannya marka molekuler , dan marka yang digunakan dalam penelitian ini, berbasis PCR –AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorpism)

AFLP adalah teknik studi keragaman genetik berdasarkan fragmen pemotongan DNA (dengan enzim retriksi tertentu) dan amplifikasinya (perbanyakan).

AFLP memiliki keuntungan tidak memerlukan pengetahuan atau data tentang sekuens DNA genom yang akan dianalisa, hanya memerlukan sampel DNA dalam jumlah yang sedikit, teknik ini dapat digunakan untuk berbagai jenis sampel DNA

Perumusan masalah :

1. Bagaimanakah keanekaragaman genetik kecipir polong pendek mutan dan wild type berdasarkan marka AFLP ?

2. Adakah perbedaan hasil marka pada kecipir polong pendek mutan dengan kecipir polong pendek wild type ?

Tujuan penelitian :

1.Mengetahui keanekaragaman genetik kecipir polong pendek mutan dan wild type berdasarkan marka AFLP

2. Mengetahui perbedaan hasil marka pada kecipir polong pendek mutan dengan kecipir polong pendek wild type.

1. Materi , Lokasi, dan Waktu Penelitian

1.1 Materi

Objek utama yang akan diteliti adalah kotiledon dan akar kecipir (Psophocarpus tetragonolobus (L). DC) hasil mutasi

Ethyl Methane Sulfonate (EMS) generasi ke-2 (M2) koleksi Dr. Nurtjahjo D Sasongko dan wild type masing-masing 10 sampel.

Bahan-bahanEkstrak DNA kotiledon dan akar kecipir mutan dan wildtype, Cetyl trimethylammonium bromide (CTAB) buffer, merkaptoetanol, chloroform, isoamil alkohol, TE (Tris-HCl dengan EDTA) buffer, RNAse, Amonium asetat 7M, isopropanol, dan etanol absolut, gel agarosa 1%, enzim retriksi (EcoRI, PstI, dan MseI), DNA linker, Primer (Primer E-A, EAC, dan MG), Aquabidest, Adapter Ligation Solution, T4 DNA ligase, Etidium bromide.

1.2 lokasi dan waktu penelitian

Alat-alatAutoklaf, freezer, sarung tangan, tisu, tabung PCR 0,2 ml, oven, alat elektroforesis, mortal dan pestle steril, beaker glass, Laminar Air Flow (LAF), UV Transilumminator, tabung eppendorf ukuran 1,5 ml, shaker waterbath, sentrifuge 12.000rpm, tip dan mikropipet ukuran 10µl, 50 µl, 100oµl, vortex, dan Polimerase Chain Reaction (PCR) dan gel documentation system dengan kamera digital.

1Penelitian akan dilakukan di Laboratorium Pemuliaan Tanaman

Fakultas Pertanian Universitas Jenderal Soedirman. Analisis marka AFLP dilakukan di Laboratorium Riset Universitas Jenderal Soedirman dan akan dilakukan pada bulan April

hingga Agustus 2012.

2.Metode Penelitian2.1 Rancangan Penelitian

2.2 Cara Kerja

Penelitian ini menggunakan metode non eksperimen. Diawalai dengan penyemaian benih, kemudian kotiledon dan akar dari kecipir tersebut di isolasi, hasil DNA isolasi dipotong dengan

menggunakan 3 enzim retriksi (EcoRI, PstI, dan MSeI), kemudian DNA diligasi menggunakan T4 DNA ligasi, tahap

selanjutnya Pre-PCR dan PCR (dengan 2 pasang primer E-A dan M-G, dan A-AC dan M-G), kemudian tahap akhirnya melalui

proses elektroforesis untuk melihat hasil pola pita DNA .

Penelitian ini terdiri atas dua bagian utama. Bagian pertama yaitu sterilisasi alat dan bahan, dan tahap kedua yaitu analisis AFLP meliputi isolasi DNA dari

akar dan kotiledon kecipir mutan dan wildtype, pemotongan DNA dengan menggunakan tiga enzim

retriksi (EcoRI, MseI, dan PstI) dan ligasi oleh adapter , PCR dengan satu pasang primer dan elektroforesis.

2.2.1 Sterilisasi Alat dan Bahan

2.2.2 Isolasi DNA (Protokol Laboratorium Pemuliaan Tanaman Fakultas Pertanian, UNSOED)

Alat, media, dan bahan kimia tertentu disterilkan dengan autoklaf pada suhu 1210C dengan tekanan 15 Psi selama 2

jam.

Sampel yang sudah dihaluskan dimasukkan ke dalam ependorf steril dan ditambahkan CTAB buffer sebanyak 600 µl.

dihomogenkan dengan divortex dan diinkubasi pada waterbath shaker incubator selama 1 jam dengan suhu 65°C.

diturunkan ke suhu ruang dan akan ditambahkan 600 µl Chloroform : Isoamylalcohol (24:1).

divortex selama 1-5 menit.

disentrifuse 12000 rpm selama 5 menit.

Larutan yang dihasilkan akan dipindahkan ke dalam tabung eppendorf lain dan akan ditambahkan Chloroform :

Isoamylalcohol dengan volume C : I sama dengan volume larutan.

divortex lagi selama 1-5 menit , Dan akan disentrifuse 12000 rpm selama 5 menit.

Larutan yang dihasilkan akan dipindahkan ke dalam tabung eppendorf lain (masing-masing sampel/tabung eppendorf

volumenya disamakan).

ditambahkan isopropanol 2/3 kali volume supernatan kemudian akan dikocok 20 kali dan akan disentrifuse 12000 rpm selama

2-3 menit.

Supernatan akan dibuang, kemudian akan ditambahkan TE buffer 100 µl dan pelet yang terbentuk akan dilarutkan.

RNase 3 µl akan ditambahkan dan akan diinkubasi 37°C selama 1 jam menggunakan waterbath shaker incubator.

ditambahkan ammonium asetat 7 M sebanyak 50 µl dan etanol absolute 2-3 kali volume larutan dalam eppendorf, dan akan disentrifuse selama 2-3 menit, kemudian buang supernatan.

dicuci dengan etanol 70% sebanyak 500 µl kemudian dikocok, dan akan disimpan didalam freezer dengan suhu -20 0C selama

1 malam.

disentrifuse selama 2-3 menit, dan buang supernatan

Pelet dikeringkan menggunakan oven dengan suhu 65°C selama 30-60 menit.

ditambahkan TE buffer 25 µl dan DNA dilarutkan.

disimpan di dalam freezer -200C.

2.2.3 Pemotongan DNA genomik dilakukan dengan enzim restriksi EcoRI, MseI, dan PstI ( Protokol AFLP Analysis System I dalam Haris, 2003).

dicampurkan 2,5 μl bufer reaksi 5X ; 2,5 μL DNA(50 ng/μl); 1 μL EcoRI/MseI/ PstI dan 6,5 μl akuades.

diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37°C, yang diikuti dengan inkubasi selama 15 menit pada suhu 70°C untuk

menon-aktifkan enzim.

diligasi dengan 12 μl larutan ligasi adapter dan 0,5 μl T4 DNA ligase.

diinkubasi selama 2 jam pada suhu 20°C. Hasil ligasi kemudian diencerkan 10X dengan bufer TE.

2.2.4 Pre-PCR dengan primer E-A dan M-Ghasil ligasi diambil 3 µl dan di tambah 147 µl TE dan di

vortex selama 10 detik, kemudian diambil 5 µl

Easy Do PCR ditambah 20 µl Akuabidest vortex 10 detik, dan diambil 10 µl

Primer E-A 3,6 µl ditambah Primer M-G 90 µl, kemudian di vortex 10 detik, setelah tercampur

diambil 5 µl.

Total volume DNA +Easy do PCR+Primer 20 µl vortex selama 10 detik dan sentrifuse selama 10 detik

optimasi DNA dengan PCR dilakukan dalam 20 siklus,denaturasi awal pada 940C selama 30 detik, 560C selama 1 menit, dan 720C

selama 1 menit. Serta diturunkan pada suhu 40C n, hasilnya diencerkan 50X.

2.2.4 PCR dengan Primer E-AC dan M-GDiambil 1 µl dan di tambah 49 µl TE dan di vortex selama

10 detik, kemudian diambil 5 µl

Easy Do PCR ditambah 20 µl Akuabidest vortex 10 detik, dan diambil 10 µl

Primer E-A 3,6 µl ditambah Primer M-G 90 µl, kemudian di vortex 10 detik, setelah tercampur

diambil 5 µl.

Total volume DNA +Easy do PCR+Primer 20 µl vortex selama 10 detik dan sentrifuse selama 10 detik

PCR dilakukan dalam 20 siklus,denaturasi awal pada 940C selama 30 detik, 560C selama 30 detik, dan 720C selama 1 menit. Serta

diturunkan pada suhu 40C .

2.2.5 Elektroforesis

5 µl hasil PCR menggunakan Primer E-A dan M-G di elektroforesis menggunakan agarose 1% selama 2 jam

pada 120 V dan 1 jam pada 150 V

5 µl hasil PCR menggunakan Primer E-AC dan M-G di elektroforesis menggunakan agarose 1% selama 2 jam

pada 50V dan 1 jam pada 60 V

3. Metode Analisis

Metode analisis yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah metode deskriptif dengan

mendeskripsikan hasil pola pita DNA kecipir yang di dapat setelah proses eklektroforesis dan membuat

dendogram.

No KegiatanBulan ke-

1 2 3 4 5 6

1 Penulisan dan konsultasi Proposal            

2 Seminar Proposal            

3 Persiapan dan Pelaksanaan Penelitian           

4 Analisis data            

5 Penyusunan Laporan            

6 Seminar Hasil            

TERIMAKASIH