REDOX-POTENCIÁL MÉRÉSEN ALAPULÓ GYORS MIKROBIOLÓGIAI

MÓDSZER

Reichart Olivér

Szakmár Katalin

Mikrobiológiai minőség-ellenőrzés problémái 1.

Klasszikus (tenyésztéses) módszerek

Hosszú inkubációs idő (1-4 nap) A módszerek alkalmazhatósága, megbíz-

hatósága és költsége tartományfüggőNagy koncentrációknál:

Hígítás és telepszámlálás a30-300 cfu/ml tartományban

Alacsony koncentrációknál:MPN módszerMembrán szűrés

Mikrobiológiai minőség-ellenőrzés problémái 2.

Gyors mérési módszerek 1.(sejtszámlálás alapján)

Direkt számlálás Számlálókamra Flow cytometer

Csak tiszta folyadékban alkalmazható

TurbiditásmérésCsak tiszta folyadékban alkalmazható

Mikrobiológiai minőség-ellenőrzés problémái 2

Gyors mérési módszerek 2.(Anyagcseretermék detektálása alapján)

ATP mérésCsak 105 sejt felett alkalmazható

Impedancia mérésen alapuló módszerek Malthus Rabit Bactrac

Mikrobiológiai minőség-ellenőrzés problémái 3.

Impedimetriás gyors módszerek

Nagy pontosságú termosztát-igény miatt nagyon drága berendezés.

Speciális, kis vezetőképességű szubsztrátot igényel.

Probléma a szelektív szubsztrátokkal. A mérő cellák geometriája és térfogata adott. Kis koncentrációknál megbízhatatlan.

Redoxpotenciál mérésen alapuló módszer elvi alapjai

Kémiai reakció általános formában:

a A + b B c C + d D

[C]c [D]d Q = ------------ [A]a [B]b

Szabad energia és elektromos munka

DG = DG° + R T ln Q

DG = - n FDE.

-n F DE = - n F DE° + R T ln Q

Elektromotoros erő

R T [C]c [D]d DE = DE° - ------- ln ---------

n F [A]a [B]b

Biológiai rendszerekben

Energiaforrás a biológiai oxidáció, ami a környezetben redukciót eredményez.

A környezet redukciójának okai lehetnek:Oxigén elfogyasztásaRedukált komponensek feldúsulása

Tipikus oxidációs-redukciós reakciók biológiai rendszerekben:

[Oxidant] + [H+] + n e- [Reductant]

Nernst egyenlet:

RT [reductant]

Eh = E0 - ---- ln ------------------- nF [oxidant] [H+]

RT [oxidant] [H+]Eh = E0 + ----- ln -------------------

nF [reductant]

Eh : a normál hidrogén elektródra vonatkoztatott

redoxpotenciál (V)E0 : A rendszer normál redoxpotenciálja (V) R: Gáz-állandó R = 8.314 J/mol K F: Faraday állandó F = 9.648˙104 C/mol (J/V

mol)n: elektronok száma a redox-reakcióban

(n=1)

Mikroba-szaporodás redox-görbéje

E. coli szaporodás 1/2 TSB-ben

-400

-300

-200

-100

0

100

200

300

400

0 60 120 180 240 300

t (min)

Eh

(m

V)

4.5

5

5.5

6

6.5

7

7.5

8

8.5

lgN

(N

=cf

u/m

l)

Eh mV lgN

Különböző baktériumok redox-görbéi

Redox görbék TSB-ben

-400

-200

0

200

400

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00

t (h)

Eh (m

V)

steril Ps.aer. E.coli St. aur. Ent. faec. B.subt.

A kezdeti sejtszám hatása a redox-görbére

E. coli in TSB

-400

-300

-200

-100

0

100

200

300

400

0 120 240 360 480 600 720 840 960

t (min)

Eh (

mV

)

Steril steril lgN=0,09 lgN=2,38

lgN=3,39 lgN=4,25 lgN=4,80

Detektációs kritériumok

Impedimetriás módszerek RABIT: admittancia változás > 5 S/6minBACTRAC: impedancia változás > 5%

Redox-potenciál mérés:|E/ t|>1mV/min

Detektációs idő (TTD):A detektációs kritérium eléréséhez szükséges idő

A kezdeti sejtszám hatása a detektációs időre

E. coli in TSB

0

1

2

3

4

5

6

2 3 4 5 6

lgNo (CFU/ml)

TT

D (

h)

Mérőcella redoxpotenciál méréshez 1.

Mérőcella redox-potenciál méréshez 2.

Indirekt mérőcella

Mérőcella hatása a redox-görbére

Enterococcus kémcső, mérőcella

0

100

200

300

400

500

600

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00

t (h)

Eh

(m

V)

Kémcsőben Mérőcellában

Enterococcus faecalis különböző cellákban mérve

Enteroc. faecalis 1/2 TSB-ben y = -1.0833x + 9.857

0

1

2

3

4

5

6

7

2 3 4 5 6 7 8

lgN (cfu/cella ml)

TT

D (

h)

üveg aerob üveg anaerob kémcső

12 csatornás mérő-rendszer

VízfürdőMérőcellákAdatgyűjtőComputer MonitorSoftware for Windows

Termékben való közvetlen mérés

16 csatornás mérési elrendezés

32 csatornás mérési elrendezés

2 csatornás mérési elrendezés

Mozaik elrendezésű képernyő

Csoportosított gráfok

Mérési eredmények megjelenítése

Mérési eredmények megjelenítése

Mérési módszer validálása

Teszt-mikrobák és táptalajok 1.

Microorganisms Redox potential

Plate counting

Escherichia coli BBL, TSB TSA, Tergitol Enterobacter aerogenes

BBL, TSB TSA, Tergitol

Citrobacter freundii BBL, TSB TSA, Tergitol Klebsiella oxytoca BBL, TSB TSA, Tergitol Acinetobacter lwoffii BBL, TSB TSA, Tergitol Pantoea agglomerans

BBL, TSB TSA, Tergitol

Teszt-mikrobák és táptalajok 2.

Microorganisms Redox potential

Plate counting

Pseudomonas aeruginosa

Cetrimide, TSB

TSA, Cetrimide

Pseudomonas fluorescens

Cetrimide, TSB

TSA, Cetrimide

Enterococcus faecalis

Azide, TSB TSA, Slanetz-Bartley

Total count TSB TSA

A módszer validációs jellemzői 1.

Szelektivitás

A szelektív médium által adott.

Linearitás

1-től 107 cfu/mérőcella.

Enterococcus szelektív kimutatása azid levesben

Enterobaktériumok, B. subtilis és Enterococcus faecalis azid levesben, kémcsőben

0

100

200

300

400

500

600

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00

t (h)

Eh

(m

V)

Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, E. coli és Enterococcus faecalis Cetrimid-levesben

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

0 120 240 360 480 600 720 840 960 1080 1200 1320 1440

t (min)

Eh

(m

V)

Ps. aerug. Ps. fluoresc. E. coli Enterococcus

Enterococcus faecalis meghatározás linearitása

Entroc. faecalis Azid y = -2.0214x + 18.192

R2 = 0.9983

0123456789

10

2 3 4 5 6 7 8

lgN (cfu/cella ml)

TT

D (

h)

Pseudomonas aeruginosa meghatározás linearitása

Pseudomonas aeruginosa in Cetrimide

y = -154,75x + 1440,6

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 1 2 3 4 5 6 7 8

lgN

TT

D (

min

)

E. coli linearitása lemezöntéssel és membránszűréssel

TTD (min)

y = -56,429x + 566,38

R2 = 0,9995

y = -64,951x + 625,54

R2 = 0,9593

0

100

200

300

400

500

600

700

0 1 2 3 4lg N (cfu/flask)

TT

D (

min

)

TTD (min)s TTD (min)m

Impedimetriás és redox-módszer összehasonlítása

E. coli

0

2

4

6

8

10

12

0 2 4 6 8 10

lgN (CFU/ml)

TT

D (

h)

Rabit Bactrac Malthus redox

A módszer validációs jellemzői 2.

Érzékenység

Kimutatási határ (Detectation limit)

1 cell/test flask.

Meghatározási határ (Quantitation limit)Elméleti meghatározási határ 10 sejt/inoculum (1 log egység), ami megegyezik a kapott

kalibrációs görbékkel.

min13060Nlg

TTD

A módszerek érzékenysége

E. coli

0,81

1,21,41,61,8

Redox Bactrac Malthus Rabit

Methods

-DT

TD

/Dlg

N

A módszer validációs jellemzői 3.

TartományA kalibrációs görbék alpján 1-7 nagyságrend. 10 sejt alatt a Poisson eloszlás okoz

problémát, 107 sejt felett a TTD túl rövid a tranziens folyamatokhoz képest (hőmérséklet-,

redox-egyensúly, lag-periódus).

IsmételhetőségA kalibrációs görbékből számítva:

SDlgN = 0.092

SDN = 100.092 = 1.24 = 24%

A módszer validációs jellemzői 4.

Zavartűrés (Robustness)

Legfontosabb paraméter a hőmérséklet, amely két módon befolyásolja az eredményeket:

szaporodási sebesség hőmérséklet-függése

redox-potenciál hőmérséklet-függéseA mikroba szaporodási optimumán mérve, a szaporodási sebesség ±0.5 °C intervallumon belül nem változik.A hőmérséklet-ingadozás redoxpotenciálra kifejtett hatása kísérleti eredményeink szerint elhanyagolható.

Hőmérséklet hatása a redox-potenciálra

300

320

340

360

380

400

420

440

460

480

25 30 35 40 45 50

T (°C)

Eh

(m

V)

phyz. Salt Azid BBL Z-broth RCM

A hőmérséklet hatása a mérési módszerekre

Impedimetriás módszerek: A mért impedancia erősen hőmérséklet-függő. A detektációs kritériumok (5µS RABIT-nál, vagy 5%

növekedés BACTRAC esetében) már 0.025°C hőmérséklet-változással elérhetőek (RABIT Manual).

Ez az oka a szigorú hőmérséklet-szabályozási követelménynek (T=±0.002°C).

Redox-potenciál mérés: A mért redox-potenciált döntően csak a mikroba-

szaporodás határozza meg. A hőmérséklet-ingadozás hatása elhanyagolható.

Impedimetriás és redox mérési módszerek hőmérséklet-érzékenysége

Impedimetric method

Redox-potential

1°C változás hatása (Szubsztrát-függő) 20-200S 0.4-1.4mV

Hamis pozitív eredményt adó hőmérséklet-változás

0.004°C/min 0.7-2.5 °C/min

Szokásos méréshez tartozó kritikus hőfok-csúszás

0.025°C/6min 7-25 °C/10min

A redox-módszer alkalmazása

1. Víz mikrobiológiai ellenőrzése Össz-mikrobaszám Coliform, E. coli Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecalis

2. Nyers tej mikrobiológiai minősítése Össz-mikrobaszám Enterobacteriaceae

3. Hús mikrobiológiai ellenőrzése Össz-mikrobaszám Enterobacteriaceae

4. Felületek mikrobiológiai ellenőrzése Össz-mikrobaszám Enterobacteriaceae

5. Penész- és élesztőgombák számának meghatározása

Víz mikrobiológiai vizsgálatokÖsszcsíra

Water in TSBy = -60,807x + 525,03

R2 = 0,9973

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

0 1 2 3 4 5 6 7 8

lgN/100ml

TT

D (

min

)

Víz mikrobiológiai vizsgálatokColiformok

Coliforms in BBL

y = -67,611x + 596,28

R2 = 0,9865

y = -81,034x + 773,78

R2 = 0,9941

y = -101,94x + 1020,2

R2 = 0,9958

y = -132,3x + 1190

R2 = 0,9621

y = -88,257x + 855,63

R2 = 0,9714

0

200

400

600

800

1000

1200

0 1 2 3 4 5 6 7lgN

TT

D (

min

)

Citrobacter aerob Citrobacter anaerob Klebsiella anaerob Enterobacter aerob E. coli

Víz mikrobiológiai vizsgálatokPseudomonas aeruginosa

Pseudomonas Cetrimid y = -153,21x + 1422,5R2 = 0,9882

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 1 2 3 4 5 6 7 8

lgN/100ml

TT

D (

min

)

Víz mikrobiológiai vizsgálatokEnterococcus faecalis

Enterococcus AZIDy = -95,238x + 793,33

R2 = 0,9859

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

0 1 2 3 4 5 6 7 8

lgN/100ml

TT

D (

min

)

Ipari validálási eredmények 1.

72 palack vizsgálata Coliform mikrobákra

Laboratóriumi vizsgálati módszer Membrán szűrés: 3x250 ml ásványvíz 1 szűrőlapra.

Tenyésztés Tergitol agaron (37 °C, 48 h). 1 Petri csészén 3 palack egyesített eredménye. Eredmény: 48 óra.

Redox-potenciál mérési módszer Membrán szűrés: 3x250 ml ásványvíz 1 szűrőlapra.

4 membrán behelyezve 1 mérőcellába, BBL levesbe. Mérés: 37 °C. 1 cella 12 palack egyesített eredményét tartalmazza. Eredmény: 12 óra

Kontroll: 1 ml Citrobacter freundii szuszpensio (lgN = 3.66)

Ipari mérések eredménye 1.

72 bottles in BBL

-300,0

-200,0

-100,0

0,0

100,0

200,0

300,0

400,0

500,0

0 200 400 600 800 1000 1200

t (min)

Eh

(m

V)

1.-12. 13.-24. 25.-36. 37.-48. 49.-60. 61.-72. Citrobacter

Ipari mérések eredménye 1.

Minták 1.-12. 13.-24. 25.-36. 37.-48. 49.-60. 61.-72.

Laboratory negative negative negative negative negative negative

Redox negative negative negative negative negative negative

72 palack vizsgálata coliform mikrobákra

Ipari validálási eredmények 2.

66 palack vizsgálata Coliform mikrobákra

Laboratóriumi vizsgálati módszer Membrán szűrés: 3x250 ml ásványvíz 1 szűrőlapra.

Tenyésztés Tergitol agaron (37 °C, 48 h). 1 Petri csészén 3 palack egyesített eredménye. Eredmény: 48 óra

Redox-potenciál mérési módszer Membran szűrés: 3x250 ml ásványvíz 1 szűrőlapra.

3 membran behelyezve 1 mérőcellába, BBL levesbe. Mérés: 37 °C. 1 cella 9 palack egyesített eredményét tartalmazza. Eredmény: 12 óra.

Kontroll: 1 ml Citrobacter freundii szuszpenzió(lgN = 6.66)

Ipari mérések eredménye 2.

66 bottles

-400,0

-300,0

-200,0

-100,0

0,0

100,0

200,0

300,0

400,0

500,0

0 200 400 600 800 1000 1200

t (min)

Eh

(m

V)

1.-9. 10.-18. 19.-27. 28.-36. 37.-45. 46.-54. 55.-63.64.-66. Water1 Water2 E.coli (+) Negative

Ipari mérések eredménye 2.

Minták 1.-66. Bottles Water sample 1. Water sample 2.

Laboratory results negative negative negative

Redox method negative negative negative

66 palack vizsgálata coliform mikrobákra

Nyers tej össz-mikroba száma

Nyerstej 0,1/100ml y = -1.3345x + 12.981

R2 = 0.9634

0

2

4

6

8

10

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00

lgN (cfu/test cell)

TT

D (

h)

Enterobaktériumok tejben

Enterobacteriaceae in EE broth y = -0.935x + 8.2116

R2 = 0.9924

012

3456

789

0 1 2 3 4 5 6 7lg cfu/ test cell

TT

D (

h)

E. coli Enterobacter cloacae Citrobacter freundii

Salmonella abony Klebsiella oxytoca

Nyers hús össz-mikroba száma

Meat in TSBy = -2.6833x + 20.498

R2 = 0.9633

y = -3.15x + 19.456

R2 = 0.965

y = -2.3979x + 18.226

R2 = 0.9302

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

0 1 2 3 4 5 6 7lgN (cfu/test cell)

TTD

(h)

Chicken Pork Beef

Enterobacteriaceae húsban

Meat in EE broth y = -0.92x + 12.653

R2 = 0.9975

10.50

11.00

11.50

12.00

12.50

13.00

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50

lgN (cfu/test cell)

TT

D (

h)

Felületi tamponos vizsgálatok

E.coli, tampon y = -1.0860x + 8.8565

R2 = 0.9900

01

23

45

67

89

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00

lgN/Petri

TT

D(h

)

Redox-potenciál változás gombák szaporodása során (indirekt mérés)

Saccharomyces cerevisiae

200

250

300

350

400

450

500

550

600

0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00

t (h)

Eh

(m

V)

ch1 ch2 ch3 ch4 ch5 ch6

Saccharomyces cerevisiae kalibrációs görbe

Saccharomyces cerevisiae y = -6.9146x + 39.37

R2 = 0.996

05

1015202530354045

0 1 2 3 4 5

lgN (cfu/test cell)

TT

D (

h)

Aspergillus niger kalibrációs görbe

Aspergillus niger y = -6.1936x + 55.984

R2 = 0.9858

20

30

40

50

60

0 1 2 3 4 5

lgN (cfu/test cell)

TTD

(h)

A redox mérési módszer előnyei 1.

Egyszerű mérési technika. Nem igényel szigorú hőmérséklet-szabályozást. Gyors módszer, különösen nagy mikroba-számú

fertőzések esetében. Bármely tápleves alkalmazható (impedimetriás

mérések kis vezetőképességű, speciális tápleveseket igényelnek).

Különösen alkalmas membrán-szűréses módszer kiértékelésére.

A redox mérési módszer előnyei 2.

Gazdaságos, hatékony és egyszerű módszer pusztulás-kinetikai mérések kiértékelésére.

Nagyon hatékony módszer táptalaj-optimalizálási kísérletekhez.

A vizsgálatok költsége kisebb a klasszikus módszerekhez viszonyítva, különösen null-toleráns mikrobák (coliforms, Enterococcus, Pseudomonas, etc.) meghatározásánál