Mutatie Detectie en Genotypering m.b.v High-Resolution DNA Melting Analysis

Michiel van der Sanden

Wat is een smelt curve?Wat is een smelt curve?

Basis voor smelt curve analyse: Basis voor smelt curve analyse: “Heteroduplex” detectie“Heteroduplex” detectie

Melting Curves

Temperature

CG

TA

Heterozygote Amplification

TwoHomoduplexes

TwoHeteroduplexes

C

A

T

G

Observed Combinationof 4 Duplexes

Smeltcurve analyse, Heteroduplex” detectieHeteroduplex” detectie

Smelt curve profielen van een 100 bp product

• Homozygoten zijn makkelijk te onderscheiden van heterozygoten

• Verschillende heterozygoten geven unieke smeltpatronen

C/C HomozygoteC/G HeterozygoteC/T HeterozygoteC/A Heterozygote

Benodigd voor smeltcurve-analyse: Benodigd voor smeltcurve-analyse: LC Green LC Green + + saturating Dyesaturating Dye

Benodigd voor smeltcurve-analyse: Benodigd voor smeltcurve-analyse: Goede detectie-apparatuur (HR-1)Goede detectie-apparatuur (HR-1)

High Resolution Melter-1:

• glas-capillairen

• 40 samples/uur

• meest nauwkeurig

• Compensatie signaal

• “Eenvoudige” software

• Sample achteraf te gerbuiken voor sequence reactie

Benodigd voor smeltcurve-analyse: Benodigd voor smeltcurve-analyse: Goede detectie-apparatuur (Lightscanner 96/384)Goede detectie-apparatuur (Lightscanner 96/384)

• High throughput zeer hoog ( 1 plaat /10-15 minuten)

• 96 of 384 monsters per keer

• apparaat dummy-proof

•zeer “eenvoudige” en gebruiksvriendelijke software

•Sample achteraf te gebruiken voor sequence reactie

temperature→

fluor

esce

nce→

temperature→

temperature→

fluor

esce

nce→

fluor

esce

nce→

temperature→

A B

C D

Data analyse : van ruwe data tot difference plotRuwe data curves Normalisatie

Temperatuur shift Difference plot

Absoluut noodzakelijk voor een goede smelt-curve analyse:

Een perfecte PCR-reactie

PCR maakt of kraakt de fragment analyse d.m.v. smeltcurves

Waarom is de PCR de meest cruciale factor ?

Fluorescente dye maakt geen onderscheid en bindt dus alle dubelstrengs DNA (DSDNA) zonder onderscheid:

– Specifiek produkt, bij-produkt en primer-dimer produkt bouwen allen de dye in met gelijke affiniteit

– Alle produkten dragen bij aan het fluorescente signaal– Alle produkten dragen bij aan de smelt-curve

Factoren die de PCR beinvloeden

• Effectieve Primer Design (vertouw niet alleen op de software)• Primer zuiverheid (salted out, cartridge, HPLC, Gel)• Primer Concentratie (hoeveel is optimaal?)

• MgCl2 Concentratie (hoeveel is optimaal?)

• Storende toevoegingen (KCl, glycerol, DMSO, TMSO, anderen)• Genomisch DNA zuiver.• Fragment lengte• Cycling Condities (hoe veel , anneal temp, hold time, ramp

speed)• Enzyme, hot-start taq-polymerase aanbevolen

Veel problemen op te losen door LC Green PCR mastermix

Toenemend en zuiverder produkt na verhogen MgCl2 concentratie

zuiver produkt hangt af van gekozen annealing temperatuur

HR-1

LightScanner

Sensitivity and SpecificityDependence on Product Size:

Clin Chem. 2004;50:1748-54.

Fragment size (bp)

Sensitivity

Specificity

< 300 100% 100%

400 – 1000 96.1% 99.4%

Total (1248 rxns)

97.8% 99.7%

Controle van PCR;

eerst op gel, daarna pilot met smeltcurves

Optimaliseren smelt-curves met een

speciale “RV” Buffer

High-Resolution DNA Melting

• Scanning van PCR producten voor onbekende mutaties– Vinden van heterozygote mutaties t.o.v

homozygoten en wild-type Pre-sequencing

• Genotypering allelen– Complete genotypering tussen wild type,

heterozygous, and homozygous variants.

Trial lightscanner voor mutatie detectie

Trial lightscanner voor mutatie detectie (2)

Trial HR-1 voor gene scanningRuwe data Difference plot

Trial lightscanner voor gene scanning

Nieuwe metoden om homozygote mutaties te onderscheiden van Wild-type in

genescanning Nu slechts 40% van homozygote mutanten opgepikt met

smelt-curve analyse

• Probe melting• Wild-type inmengen

Tim

e (m

in)

Temperature (°C)

Dynamic Dot Blot for Allele Analysis (Heterozygote)

Anchor Probe Mutation Probe

Match

Mismatch

Flu

ore

scen

ce

Temperature (°C)

Temperature (°C)

-dF

/dT

Temperature (°C)

-dF

/dT

Factor V Leiden

Heterozygous

Homozygous Mutant

Homozygous WT

Clin Chem 1997; 43: 2262 - 2267

Twee voor de prijs van een met probe meltingScan & Genotype

Tem

per

atur

e

Time (sec)0 30 60 90 120

Scan the full fragment

Genotype by probe melting

Wild type inmengen

Mixture WT/WT

WT1

WT2WT1 + WT2

Mixture WT/HomozygootWT

HomozygousHomozyg + WT

Eliminate 99% of sequencing?

Scanning of PCR fragments for variants

DNA sequencing

~1% Not identified

Unlabeled probe genotyping of

known variants

Variant genotyped

~ 9% Identified

~ 90% Normal

~10% Abnormal

Wild type

Scanning by High-Resolution Melting

• Closed-tube– dsDNA dye before PCR– No processing, additions, or separations– No exposure to the environment

• Rapid– 1-2 min for single samples– 5-10 min for 96/384 samples

• Non-destructive– Downstream processing if necessary

Vergelijk smelt-curve versus andere technieken

Light-scanner

WAVE REVEAL ABI Prism

Sequencer

Base Technology Amplicon Melting

Denaturing HPLC

Temperature Gradient Capillary Electrophoresis

Capillary DNA Sequencing

Post PCR Treatment None None None Sample purification Cycle

sequencing

Time per run 10-15 4~6 min 90 min 120 min

Sample per run 1/96/384 1 24~192 16~48

Sample per hour 384/1536 10~15 16~128 8~24

Cost per sample 35 cents 40 cents 12~82 cents $1.8~3.0

Bedankt !!!