Beer

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Determinación de compuestos carbonilicos en la cerveza

• Damian Alberto Lampert• Nicolás Ariel Zona• Rodrigo Fontan• Manuel Vega Di Nezio

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AbstractAbstract

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Abstract (I)Abstract (I)

una Microextraccion en fase sólida seguida por cromatografía de gases y espectrometría de Masas, con el fin de determinar 41 compuestos carbonilicos que están presentes en la cerveza ya estacionada.

Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013

Se realizó:

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Se optimizo el método de derivatizacion en solución mediante:

• La selección de la fibra

• La selección de la temperatura, el tiempo de pre-incubacion y de extraccion

• La adicion de cloruro sodico

• La concentración de o-(2,3,4,5,6-pentafluorbenzil)hidroxilamina (PFBHA)


Abstract (II)Abstract (II)

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Abstract (III)Abstract (III)Se determinó que:

• Ciertos compuestos como el (E)-Nonanal fueron mejor extraídos mediante una derivatizacion en fibra.

• Otros compuestos como hidroxiacetona o 5-hidroximetilfurfural resultaron ser detectados mas fácilmente por el método de derivatizacion en solución.


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IntroducciónIntroducción

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Compuestos Carbonilicos

Compuesto

Aldehído

Cetona

Ácido carboxílico

Éster

Amida


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A concentraciones Bajasbrindan sabor a las bebidas alcohólicas.


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Métodos


10Vega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013

3 Estrategias se pueden seguir

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ExperimentalExperimental

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Instrumentación

• GC-MS (ThermoScientific)

• Columna Rtx-5SilMS (60m x0,25 µm I.D) con film de 1 µm.

Rango de temperatura: -60 a 330/350 ° C

Polidimetilsiloxano-divinilbenceno


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Inyector @ 250°C. Inyección Splitless (Desorción 2 minutos)

Gradiente de temperatura: • 2 minutos @ 60°C • 60-165°C a 50°C/min• 165-200°C a 2°C/min• 200-260°C a 4°C/min• 260-290°C a 5°C/min• 6 minutos @ 290°C

Carrier: Helio 1,5mL/min

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Detector

Dual Stage Quadrupole @ 250°C

Fuente de ionización: EI @ 70eV

Modo de detección TIC, barrido de m/z desde 35 hasta 400.

Software Xcalibur.

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Derivatización en fibra y HS SPME

La fibra PDMS-DVB se cargó con PFBHA durante 10 minutos @ 45°C Y 250rpm

Vial con 10 mL de cerveza y 3,5g de NaCl se incubó durante 30 minutos @ 45°C y 250 rpm.


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Optimización del procedimiento utilizando derivatización en solución

seguida de HS SPME

HeadSpace

10mL Cerveza + 50µl de solución 100mg/L de p fluorobenzaldehído (Patrón interno) + PFBHA.

Se optimizaron losparámetros detalladosen el abstract


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Variables Variables experimentalesexperimentales


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Revestimiento de la fibra SPME

La fibras evaluadas en este trabajo fueron:

• Polidimetilsiloxano (PDMS) 100 um

• Polidimetilsiloxano divinilbenceno (PDMS-DVB) 65 um

• Carboxen-polidimetilsiloxano (CAR-PDMS) 70 um

• Carbowax-divinilbenceno (CW-DVB) 70 um

• Dinivilbenceno-carboxen-polidimetilsiloxano(DVB-CAR-PDMS) 50/30 um


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Concentración de PFBHAConcentración de PFBHASe analizaron distintas cantidades de una solución de 20 g/L con el fin de obtener la mejor eficiencia en la resolución de los picos.

• 20 uL • 50 uL• 100 uL • 250 uL• 500 uL • 1000 uL


Parámetros fijos: 20 min. de pre-incubación y 30 min. de extracción a 50 ºC

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Temperatura de extracciónTemperatura de extracciónPara estudiar el efecto de la temperatura en la extracciónde los compuestos carbonilicos derivatizados se probaron siete temperaturas diferentes.

• 30 ºC • 40 ºC• 45 ºC • 50 ºC• 55 ºC • 60 ºC• 70 ºC


Parámetros fijos: 20 min. de pre-incubación y 30 min. de extracción.

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Pre-incubaciónPre-incubación

Cuatro periodos de tiempo distintos fueron examinados bajocontinuo agite a 500 rpm para equilibrar la muestra.

• 5 min. • 10 min.• 20 min. • 30 min.


Parámetros: 30 min. de extracción a temperatura definida.

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Tiempo de extracciónTiempo de extracciónCon el fin de encontrar el tiempo optimo, se expuso la fibra en el HS de la muestra por diferentes periodos de tiempo.

• 10 min. • 20 min.• 30 min. • 40 min.• 50 min. • 60 min.


Parámetros fijos: No definidos.

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Adición de salAdición de salEl efecto de la fuerza iónica en la eficiencia de la extracción fue examinada a través de la adición de diferentes cantidadesde cloruro de sodio en el vial.

• 0 g • 1 g• 2 g • 3 g• 3,5 g


Parámetros fijos: Parámetros definidos.

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Discusión yDiscusión y resultadosresultados


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41 compuestos carbonilicos volátiles y no volátiles de estructura variable fueron seleccionados con el fin deexplorar las características de la derivatizacion en fibra simple y la derivatizacion en solución.



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La técnica de derivatizacion en solución fue estudiadamediante la evaluación de los efectos de los siguientes parámetros en la eficiencia de la extracción.

• Revestimiento de la fibra

• Concentración de PFBHA

• Temperatura de extracción

• Tiempo de preincubación

• Tiempo de extracción

• Fuerza iónica

También una calibración y validación del método fue llevadasa cabo, con lo cual se evaluaron la linealidad y la repetitividadde la técnica.


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Revestimiento de la fibraFue evidente que la fibra PDMS-DVB otorga la mejor extraccionpara estudiar los compuestos anteriormente mencionados

PDMS-DVB

PDMS

DVB-CAR-PDMS

CAR-PDMS

CW-DVBVega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013


Concentración de PFBHAConcentración de PFBHA

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Aldehídos alifáticossaturados (SLA) y aldehídosramificados

Cetonas y compuestosacetilados

Concentraciones PFBHA

Concentraciones PFBHA

0,75 g/L de PFHBA


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Temperatura de extracciónTemperatura de extracción


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Compuestos volátiles(cadena corta)

Demás compuestos

Tº

Tº

Para evitar la reacciones no deseadas y obtener la mayorextraccion de todos los compuestos, la temperatura seleccionada fue

60 ºC


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Pre-incubaciónPre-incubación

Para permitir a los compuestos carbonilicos reaccionar conel PFBHA y realizar los análisis posteriores, el tiempo optimode pre-incubacion fue de :

10 min.


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Tiempo de extracciónTiempo de extracción


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Adición de salAdición de sal


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SOLO en Hidroxicarbonilos aumenta la eficiencia de extracción si se aumenta la cantidad de cloruro sodico debido a la disminución en la actividad de agua y la consiguiente incapacidad de formar puentes H entre el hidroxilo y el derivatizante.

Como consecuencia, la mejor extraccion se realizo SIN el agregado de Cloruro de sodio

0 g NaCl


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Calibración y ValidaciónCompuesto Rango (µg/L) R RSD (%)

Propanal 4-512 0,994 4,88

Decanal 0,07-256 0,909 4,18

2-butanona 1,6-204,8 0,996 3,85

2-acetilpirrol 18-128 0,989 12,84

Hidroxiacetona 40-5120 0,998 3,25

De un total de 41 compuestos carbonílicos analizados se presentan 5. Aquí, decanal y 2-acetilpirrol presentan curvas que no ajustan demasiado bien a la linealidad. En el caso del 2-acetilpirrol se lo atribuye a un pico desconocido que lo solapa parcialmente.El rango de concentraciones en el cual se mantiene la linealidad es muy amplio, siendo éste acorde y útil para las concentraciones estándar que se encuentran en la cerveza.RSD: relative standard deviationVega Di Nezio-Zona-Lampert-Fontan. TAI 2013

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Comparación técnicas de derivatización (I)

Compuesto En solución En fibra

LOD(µg/L) LOQ(µg/L) LOD(µg/L) LOQ(µg/L)

Propanal 1,2 4,1 1,7 5,7

Decanal 0,021 0,071 0,005 0,017

2-butanona 0,024 0,08 ND ND

2-acetilpirrol 5,5 18,2 1178 3927

Hidroxiacetona

4,2 14,0 220 733

2-nonanona 0,255 0,849 0,046 0,152

Furfural 0,66 2,20 6,0 20,0

2,3-pentadiona

0,26 0,86 30 101


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Comparación técnicas de derivatización (II)

Compuesto Concentración (µg/L)

En Solución En Fibra

Propanal 4,56 (+/- 0,17) 5,72 (+/- 0,26)

Decanal 0,82 (+/- 0,04) 1,04 (+/- 0,09)

2-butanona 12,35 (+/- 0,79) ND

2-acetilpirrol 110,1 (+/- 8,6) ND

Hidroxiacetona 1600 (+/- 123) 1742 (+/- 197)

2-nonanona ND 0,067 (+/- 0,002)

Furfural 492,6 (+/- 22,5) 503 (+/- 19)

2,3-pentadiona 14,4 (+/- 0,6) ND


40

Comparación técnicas de derivatización (III)


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Comparación técnicas de derivatización (IV)

• Mediante derivatizacion en solución se obtuvieron áreasmas grandes, por lo que el limite de detección del métodoes menor.

• Los compuestos mas polares se extrajeron mejor con derivatizacion en solución, no así los apolares.

• La derivatizacion en fibra aporto áreas mucho menores,y la ausencia de algunos picos.


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Comparación técnicas de derivatización (V)Derivatización en fibra

• No logra detectar moléculas de cadena pequeña.

• No detecta 5-HMF ni acetoína.

• No detecta dicetonas.

Derivatización en solución

• Áreas más grandes

• No logra detectar moléculas de cadena larga.

• Aumenta la eficiencia de extracción de las cetonas.


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ConclusionesConclusiones

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Parámetros óptimos paraParámetros óptimos para derivatizacion en solución derivatizacion en solución

• Una concentración de 0,75 g/L de PFBHA

• Sin agregado de NaCL.

• Pre-incubacion a 60 ºC durante 10 minutos

• Extraccion a 60 ºC durante 40 minutos con una fibra PDMS-DVB


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Mediante la calibración y validaciónse demostró que el método de derivatizacion en solución era sólido.


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Derivatizacion en soluciónDerivatizacion en solución

Esta técnica fue mas eficiente para detectar compuestos mas polares tanto carbonílicos como cetonas. La detección de 5-HMF, acroleína, hidroxiacetona, acetoina, glioxal y metilglioxal en la cerveza fue remarcable.


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Derivatizacion en fibra simpleDerivatizacion en fibra simple

Esta técnica demostró ser mucho mas afín para compuestos apolares de cadenas largas como (E)-2-nonanal


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FinFin

Technology

Beer