Técnica de Conteo de Colonias Bacteriana

TECNOLÓGICO DE ESTUDIOS

SUPERIORES DE ECATEPEC

DIVISIÓN DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOQUÍMICA

MICROBIOLOGÍA

PRACTICA No. 5

CUENTA DE COLONIAS POR LAS TÉCNICAS DE

VACIADO EN PLACA E INOCULACIÓN EN

SUPERFICIE

EQUIPO 3:

DELGADO MEZA MARICRUZ

NÚÑEZ GARCÍA BENJAMÍN ARMANDO

RAMOS GONZÁLEZ MARÍA DEL ROCÍO

RODRÍGUEZ PINEDA MARÍA ALEJANDRA

YÁÑEZ VARELA JUAN ANTONIO

PROFESORA:

YANIN GABRIELA SANDOVAL GÓMEZ

GRUPO: 3551

Laboratorio de microbiología – Práctica No. 5

Cuenta de colonias por las técnicas de vaciado en placa

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PRÁCTICA No. 5

Cuenta de colonias por las técnicas de vaciado en placa e inoculación.

OBJETIVO:

El alumno aislará bacterias aerobias por las técnicas de vaciado en placa e inoculación en

superficie.

MARCO TEÓRICO:

El crecimiento de las poblaciones microbianas puede medirse de diferentes maneras.

Alguno métodos determinan el número de células y otros la masa total de la población,

que a menudo es directamente proporcional al número de células. La magnitud de la

población normalmente se registra como el número de células que hay en un mililitro de

líquido o en un gramo de material sólido. Como las poblaciones bacterianas suelen ser

muy grandes la mayoría de los métodos de cuantificación se basan en mediciones directas

o indirectas de muestras muy pequeñas; después se determina mediante cálculos el

tamaño de la población total. Supongamos, por ejemplo, que una millonésima parte de un

mililitro (10-6 mL) de leche agria contiene 70 células bacterianas. Entonces debe haber 70

veces 1 millón de células, o sea 70 millones de células por mililitro.

Sin embargo, este método resulta poco práctico para medir una millonésima parte de un

mililitro de líquido o de un gramo de alimento. Por consiguiente, el procedimiento se

efectúa indirectamente en una serie de diluciones. Por ejemplo, si añadimos 99 mililitros

de agua, cada mililitro de esta dilución tendrá una centésima parte de las bacterias que

tenía cada mililitro de la muestra inicial. Si mediante una serie de diluciones de este tipo

se puede estimar con facilidad el número de bacterias en la muestra original. Para

encontrar las poblaciones microbianas en alimentos sólidos (como en una hamburguesa)

se realiza un homogenizado en una licuadora de alimentos con una parte de alimento y

nueve partes de agua. Después pueden tomarse muestras de esta preparación diluida al

10% y realizar más diluciones o efectuar recuentos celulares.

Recuentos en placa

El método utilizado con más frecuencia para la medición de poblaciones bacterianas es el

recuento en placa. Una ventaja importante de esta técnica es que mide el número de

células viables. Una desventaja es que se requiere bastante tiempo, por lo general 24

horas o más. Para que se formen colonias visibles. Esto puede plantear un grave problema



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en algunas aplicaciones, como por ejemplo el control de calidad de la leche, cuando no es

posible mantener un lote determinado tanto tiempo.

El recuento en placa se basa en la suposición de que cada bacteria crece y se divide para

producir una sola colonia. Esto no siempre es cierto porque las bacterias con frecuencia

crecen unidas en cadenas o como grumos. Por consiguiente, a menudo una colonia no se

produce como resultado de una única bacteria sino de segmentos cortos de una cadena o

de un agregado bacteriano. Para reflejar esta realidad los recuentos en placa suelen

informarse como unidades formadoras de colonias (UFC).

Cuando se realiza el recuento en placa es importante que crezca sólo un número limitado

de colonias en la placa. Cuando hay demasiadas colonias algunas células se encuentran

apiñadas y ni pueden desarrollarse; esta situación es causa de inexactitudes en el

recuento. La convención de la Food and Drug Administration de los Estados Unidos ha

señalado que se cuenten solo las placas con 25 a 250 colonias, si bien muchos

microbiólogos prefieren placas con 30 a 300 colonias. Para asegurar que algunos

recuentos estén dentro de estos límites el inóculo original se diluye varias veces en un

proceso denominado dilución seriada.

Fuentes de error en el recuento en placa

El número de colonias que se obtiene en una determinación de viables no sólo depende

del tamaño del inóculo si no también de lo adecuado que sea el medio de cultivo y de las

condiciones de incubación, así como la duración de la incubación. Las células depositadas

en la placa no se desarrollarán todas en colonias a la misma velocidad y se se emplea un

corto tiempo de incubación, se obtendrán menos colonias de las posibles. Además, el

tamaño de las colonias varía y si se desarrollan colonias muy pequeñas pueden pasar

desapercibidas en el recuento. Es habitual establecer las condiciones de incubación

(medio, temperatura y tiempo) que permitan obtener el mayor número de colonias para

un determinado organismo y usar luego estas mismas condiciones. La determinación de

viables puede estar sujeta a grandes errores y, si se desean recuentos precisos, han de

hacerse con cuidado y hacer las placas de las diluciones por duplicado. Hay que advertir

que una agrupación de dos o más células sólo producirá una colonia, de modo que el

recuento de viables será erróneamente menor. El recuento se expresa a menudo como

unidades formadoras de colonias obtenidas, más que como número de células viables (ya

que una unidad formadora de colonias pudo originarse a partir de una o más células

iniciales).



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Pese a estas dificultades, el recuento de viables suministra una buena información sobre

el número de células viables y este procedimiento se usa ampliamente. En la

alimentación, industria láctea, medicina y microbiología acuática, el recuento de viables se

emplea rutinariamente. El método tiene la ventaja de una elevada sensibilidad: se pueden

contar muestras con pocas células, lo que permite una detección muy sensible de la

contaminación microbiana de productos o materiales. Además, el uso de medios

selectivos y de ciertas condiciones de cultivo permite contar mediante la determinación

de viables, tipos celulares particulares en una población mixta de microorganismos.

La gran anomalía del recuento en placa

Aunque es una técnica muy sensible, el recuento en placa puede ser irrealizable cuando se

trata del recuento de muestras naturales suele dar un número mucho mayor de

organismos que los que se obtiene en cultivo en placas de cualquier tupo de medio.

Algunos microbiólogos se refieren a este hecho como “la gran anomalía del recuento en

placa”. ¿Por qué los recuentos directos al microscopio? Esto se debe a una combinación

de factores, como el hecho de que los métodos microscópicos cuentan células muertas,

mientras que los métodos de viables no; y al hecho de que diferentes organismos, incluso

en una muestra muy pequeña, pueden tener requerimientos nutricionales y de cultivo

muy diversos. Por tanto, aunque los recuentos en placa específicos con medios altamente

selectivos, como en el análisis microbiano de aguas residuales o de alimentos, puede dar

resultados fiables, “los recuentos del número total de células” de los mismos habitad

pueden ser, y habitualmente son, subestimados en varios órdenes de magnitud.

El género Lactobacillus.

Caracteres morfológicos:

En género Lactobacillus (lactis-leche; bacillus – pequeños bacilos), se caracteriza por

presentar células en forma de bacilos largos y extendidos, aunque con frecuencia pueden

observarse bacilos cortos o coco-bacilos coryneformes; lo cual hace que se puedan

confundir con género aislados habitualmente de materiales clínicos. Estos bacilos se

presentan comúnmente formando cadenas y en general son no mótiles. Son Gram

positivos y sólo las células muertas pueden dar resultados variables a la tinción de Gram.

Además, no esporulan y algunas cepas presentan cuerpos bipolares que probablemente

contentan polifosfato.



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Caracteres culturales y de las colonias:

Las colonias de Lactobacillus en medios sólidos son pequeñas (2-5 mm), convexas, suaves,

con márgenes enteros, opacas y sin pigmentos. Sólo en algunos casos se presenta

coloración amarillenta o rojiza.

Algunas especies forman colonias rugosas; generalmente no presentan actividad

proteolítica ni lipolítica que pueda apreciarse mediante halos claros formados en medios

sólidos que contengan proteínas o grasas.

Normalmente no reducen los nitratos, pero esta reacción puede ocurrir en algunos casos

cuando el pH está por encimo de 6.0. Los lactobacilos no licúan la gelatina ni digieren la

caseína.

Tampoco producen indol ni ácido sulfhídrico (H2S). La producción de pigmentos es rara y

cuando ocurre, éstos pueden ser de color amarillo o naranja hacia un tono ferroso o

rojizo.

Los lactobacilos no desarrollan olores típicos al crecer en medios comunes, pero

contribuyen a modificar el sabor de alimentos fermentados, produciendo compuestos

volátiles como diacetilo y sus derivados y hasta H2S y aminas en el queso.

Especies de Lactobacillus.

Se divide el género Lactobacillus en 44 especies, que se ubican en tres grupos. Además

algunas de estas especies se subdividen en varias subespecies; tales son los casos de:

Lactobacillus delbrueckii (con tres subespece¿ies: bulgaricus, lactis, delbrueckii).

Lactobacillus salivarius (con dos subespecies: salivarius y salicinus).

Lactobacillus casei (con cuatro subespecies: casei, pseudoplatarum, rhamnosus y

tolerans).

Lactobacillus coryniformis (con dos subespecies: coryniformis y torquens).

Nutrición y condiciones de crecimiento.

Los lactobacilos presentan particularidades para cada especia respecto a los

requerimientos nutricionales complejos para los aminoácidos, péptidos, derivados de

ácidos nucléicos, vitaminas, sales, ácidos grasos o ésteres de ácidos grasos y carbohidratos

fermentables.



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Requieren no sólo carbohidratos como fuentes de carbono y energía, sino también:

aminoácidos, vitaminas y nucleótidos. Generalmente estos requerimientos variados

suelen suplirse cuando el medio de cultivo de los lactobacilos contiene carbohidratos

fermentables, peptona, extracto de carne y extracto de levadura, aunque una

suplementación con jugo de tomate, manganeso, acetato y ésteres del ácido oleico,

especialmente Tween 80, resulta estimuladora y hasta esencial para muchas especies. Por

eso, estos compuestos se incluyen en el medio MRS.

METODOLOGÍA:

Preparación del material:

Preparar agua peptonada suficiente para siete tubos (16/150 con tapón de rosca)

que contendrán 9 ml cada uno, y 90 ml para un frasco con tapa de rosca azul.

Preparar 300 ml de medio MRS para posteriormente vaciar en siete placas de Petri.

**Medio MRS: Para aislamiento, cultivo y enumeración de Lactobacilos y otras bacterias

acido lácticas de alimentos y otros materiales.

Método de la secuencia de diluciones:

1. Homogenizar la muestra agitándola vigorosamente.

2. Transferir 10 ml de muestra a un frasco con 90 ml de agua peptonada. Agitar para

homogenizar.

3. Transferir a un tubo con 9 ml de agua peptonada, 1 ml de la solución hecha de la

muestra para así lograr una disolución 10-1.

4. De la disolución 10-1 tomar 1 ml y llevar a un segundo tubo con 9 ml de agua

peptonada y así lograr una disolución de 10-2.

5. Realizar sucesivamente los mismos pasos como se muestra en le figura hasta lograr

una disolución de 10-7.



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Técnica de vaciado en placa (Método A):

1. En condiciones asépticas, tomar 1 ml de la disolución 10-1 y vaciar sobre una caja

Petri (sin agar).

2. Verter 15 ml de agar fundido y girar suavemente para mezclar. [Fig. (a)]

3. Repetir el mismo procedimiento con cada una de las siete diluciones hechas e

incubar durante 2 a 5 días a 30 ºC.

Técnica de expansión en placa (Método B):

1. En condiciones asépticas, verter el agar en la caja Petri y esperar a que solidifique.

2. Tomar 0.1 ml de la disolución 10-1 e inocular sobre el agar.

3. Introducir en alcohol una varilla de vidrio y flamearla, dejarla enfriar en un

extremo de la caja.

4. Extender el inoculo en toda la superficie de la placa pasando la varilla repetidas

veces. Flamear la varilla para cada disolución. [Figura (b)]



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5. Repetir el mismo procedimiento con cada una de las siete diluciones hechas e

incubar durante 2 a 5 días a 30 ºC.

Conteo de colonias:

1. Seleccionar solo las cajas que tengan entre 30 y 300 colonias.

2. Multiplicar la cuenta por la inversa del factor de dilución y el resultado será en

UFC/ml.



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RESULTADOS:

Técnica de vaciado en placa):

Figura 1

Figura 2

Figura 3 Figura 4



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Se debe inocular el MRS agar con el material o muestra original (homogeneizada)

utilizando la técnica de vaciado en placa. La incubación debe ser de 3 días a 35°C o hasta 5

días a 30° (DE MAN, ROGOSA & Sharpe, 1960) para presentar crecimiento de colonias que

facilite su conteo (Fig.4). El tiempo de incubación, en esta ocasión, fue de 7 días a 30°C

por lo que el conteo de colonias no fue posible dado el crecimiento excesivo de éstas (Fig.

1, Fig. 2, Fig. 3), y así, cada caja que presentaba crecimiento fue etiquetada como

“incontable”.

El tiempo de muestreo óptimo debería ser aquel lo suficientemente largo para captar

material en cantidad detectable y lo suficientemente corto para evitar la sobrecarga del

soporte de captación, es decir, al dejar incubar las muestras más tiempo del que se debía,

el microorganismo continuó con su crecimiento, lo cual provocó que el resultado del

conteo de colonias fuese incontable.

La densidad de las colonias crecidas en el medio de cultivo afectó a la fiabilidad del

resultado. Demasiadas colonias incontables son difíciles de examinar.

Técnica de expansión en placa:

El tiempo de incubación fue demasiado largo para poder obtener un número de colonias

que se encuentren en el rango entre 30 y 300, las cuales se consideran como viables para

efectuar un cálculo para el número de unidades formadoras de colonias. Por lo tanto se

obtuvo un crecimiento en todas las placas por arriba de 300 colonias así que no se

tomaron para un cálculo de UFC. Además de que también se encontró en las placas con

contaminación por hongos.



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CONCLUSIÓN:

El manejo de este tipo de técnicas es de suma importancia por su manejo tan frecuente en

diversas áreas que dependen de la microbiología. La experiencia mas valiosa obtenida fue

la realización de la técnica, aun que por circunstancias extra no se lograron obtener los

resultados deseados.



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CUESTIONARIO:

1. Explicar las ventajas y desventajas de la técnica de vaciado en placa.

VENTAJAS DESVENTAJAS

- Es útil en muestras que se sospechan con un bajo número de

UFC por que se utiliza 1 ml.

- Microorganismos sensibles al calor se dañan por el agar fundido.

- Las colonias de bacterias crecen debajo de la superficie y no son

adecuadas para el conteo.

2. Explicar las ventajas y desventajas de la técnica por incubación en superficie

VENTAJAS DESVENTAJAS

-Es útil en muestras que se sospechan con un alto número de

UFC por que se utiliza 0.1ml.

-Los microorganismos no se dañan por el agar fundido.

-Carencia en la uniformidad de la extensión

3. Discuta en base al número de colonias que encontraron en cada una de las cajas, si

estuvo bien desarrollada la técnica.

Por que el tiempo de incubación fue muy largo, el número de colonias obtenidas rebasa el

rango que se encuentra entre 30 y 300 para realizar el conteo. Así que ese fue un

impedimento para el cálculo de UFC.

4. Se desea conocer el número de bacterias por gramo de una muestra de pimienta

molida, por lo que realiza siguiente serie de diluciones decimales de 10-1 a 10-8,

siembra 0.1 ml en cajas por técnica de inoculación en superficie y obtiene los

siguientes resultados.



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DILUCIÓN CUENTA MICROBIANA

10-1 Incontable

10-2 Incontable

10-3 Incontable

10-4 Incontable

10-5 325

10-6 30

10-7 4

10-8 Sin crecimiento



¿Qué dilución utilizará para conocer el número de células por gramo de pimienta y por

que?

Se utiliza la 10-6 ya que es la única que tiene un número de colonias que cae dentro del

rango (30 – 300).

¿Cuál es el número de bacterias por gramo de pimienta? Indique los cálculos a realizar y

sus resultados.

UFC616 10301030

Número de colonias

reportadas en la placa

Inversa de la

dilución de la placa

Se reporta como Unidades

Formadoras de Colonias o

Celulas/gr de pimienta



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BIBLIOGRAFÍA:

Madigan, M.T., Martinko y J. Parker. Brock: Biologia de los microorganismos. Madrid, España: 10º edición. Pearson. Paginas: 145 – 148.

ROGOSA, M., a. SHARPE, M.E.: An approach to the classification of the lactobacilli. – J. Appl. Bact., 22; 329-340 (1959).

Luz María Samaniego Fernández; Maryla Sosa del Castillo., Lactobacillus spp.: Importantes promotores de actividad probiótica, antimicrobiana y bioconservadora., Centro de Estudios Biotecnológicos. Facultad de Agronomía. Universidad de Matanzas “Camilo Cienfuegos”. Matanzas, Cuba.

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