Introduction

Avec l’augmentation de la pollution environnementale le risque de contaminations alimentaires préoccupe de plus en plus la communauté vue les maladies sévères qu’elle pourrait engendrer.

D’où l’importance de développer des méthodes pour une détection rapide de toute sorte de contamination.

À savoir:

I. Salmonella enterica serovar Typhimurium : Bactérie gram (-)

responsable des symptômes qui vont de la diarrhée légère à la gastro-entérite aiguë chez l’homme et cause la fièvre typhoïde chez les animaux.

93.8 millions des cas de gastro-entérite dans le monde sont causées par une infection de Salmonella avec 155,000 mort chaque année dont 80.3 millions sont victime d’aliments contaminé par la bactérie en question.

Méthodes classique de détection de contamination :

Culture Trop lente

ELISA

Besoin d’un grand nombre de bactérie pour engendré un signal

PCRNe pas pouvoir distingué entre bactérie morte ou vivante

La présence D’ATP,

d’ADN non cible,

protéines et autre

particule forme une

barrière ne permettent

pas à ces méthodes de

détecter les cellules

cible.

Méthode basée sur l’utilisation d’un bactériophage rapporteur :

Principe : insertion d’un gène rapporteur dans le génome du bactériophage spécifique à la bactérie qu’on veut détecté.

Avantages :

1. Spécifique à la bactérie cible

2. Capacité de distinguer entre bactérie vivante et morte

3. Production de masse facile

4. Moins couteux

5. Longue durée de vie

6. Détection rapide

Idée générale

SPC32H CDABE

SPC32H

LUX CDABE

Bactériophage de

Salmonella Typhimurium

Opéron bactérien

Enzyme qui ce trouve dans les cellules des organismes bioluminescents et qui catalyse l’oxydation de la luciférine ( FMNH2 + Aldéhyde aliphatique) en oxyluciférine avec émission de photons .

Capacité de clonage limitée

=> on élimine les gènes non

essentiels et on les remplaces avec l’opéron

bactérien

Opéron bactérien de 6 Kb

Substrat de luciférase

Les gènes Lux Gènes responsables des réactions qui entrainent l’émission de lumière

Ils sont utilisé dans la construction de bio rapporteurs

Émettent une lumière bleu-vert a 490 nm

Il existe 5 gènes lux : A, B, C, D et E

Les différentes combinaisons entre ces gènes génère différents bio rapporteurs.

LuxAB•Luciférase•Addition de substrats exogènes •Erreurs

LuxCDE•Complexe d’acide gras réductases.•Substrat de luciférase

LuxCDABE

•Pas besoin de substrats exogènes•Facile•rapide

Milieux et conditions de cultures :

37 C – Aérobie ̊

Milieu LB ( bouillon – agar 1.5 % )

Ampicilline (Ap) : 50 μg/ml

Kanamycine (Km) : 50 μg/ml

Chloramphénicol (Cm) : 25 μg/ml

L(+)- arabinose 100 Mm

Mitomycine C ( MMC ) : 1.0 μg/ml

Saccharose (20 %)

N-décanal (1 % ) = n- décylaldéhyde (substrat exogène pour LuxAB)

Souche bactérienne, bactériophage et plasmides :

Souche : SR5100 ΔLT2gtrABC1 (32H); SR5003 lysogenized by SPC32H

( LT2 souche sauvage de salmonella hôte pour le phage SPC32H )

E. coli S17-1 λpir

SPC32H : phage qui infecte Salmonella Typhimurium

Plasmides :

Red Helper pKD46

pKD13

pCP20

pCE70

PBBR lux

plasmide suicidaire PDS132

1 – One-step inactivation method of chromosomal gene

Méthode de Datsenko et wanner. Principe :

Remplacer par recombinaison homologue, une séquence chromosomique par un gène de résistance à l’aide d’amorces portant des extensions homologues au gènes cibles.

Produit PCR constitué par le gène

de résistance à la kanamycine

entouré par des séquences FRT et

dont les extrémités comprennent

des séquences homologue au gène

à éliminer => porté par pKD13

2- Induction :

Pousser la bactérie lysogène à libérer une grande quantité de phages ( + que la quantité qu’elle libère normalement )

La portion de bactéries qui subissent un cycle lytique devient considérable.

Agent inducteur : Mitomycine C.

3- Luminométrie:

Appareil :

Luminomètre Fonction :

Mesurer une intensité lumineuse

( bioluminescence et ATP métrie )

Il comprend :

1. Un Détecteur de lumière qui compte les photons

2. Un Système électronique converti et affiche la mesure de photons en RLU ( relative luminescence units )

3. Un tube photomultiplicateur

4. Une chambre de mesure

5. Un injecteur de réactifs.

I- La construction du Phage

Génome SPC32H

Gène Lux CDABE

Taille augmente de 15 %

Diminution du pouvoir

infectieux du phage

Capacité de la tête du phage est limitée

Solution ??????????

Choix et délétion des gènes non essentiels : Les gènes impliquées dans la conversion lysogénique :

• Antigène-O Acétylase ( oac )

• Glucose translocase ( gtrA)

Le gène (Int) séquence codante pour l’intégrase .

( on a gardé une partie du cote 5’ terminal importante pour l’excision )

Le site situé directement après l’opéron CPS.

Conversion lysogénique : le gène du phage s’intègre dans les

chromosomes de la bactérie et la mettent en état latent ( lytique lysogénique ) et la

rendant plus virulente ex. : modification de l’antigène O de salmonella qui est reconnu

par le Sys. immunitaire

Rôle dans l’ intégration du génome du phage dans le chromosomes de

l’ hôte et son excision

Elimination par la méthode one-step en utilisant :

• le plasmide pKD13 portant le gène de résistance a la kanamycine

• le plasmide pCP20 portant le gène de FLP recombinase ( mais pas pour le site situé après l’opéron CPS )

Insertion du gène Lux : I- Choix du site cible :

• Directement après le Promoteur de CPS

Pourquoi ?

• Région transcrite de manière efficace

Preuve ?

• On a inséré dans cette région le gène lacz sans promoteur apporté par le plasmide pCE70 et sous traitement par MMC on a induit un cycle lytique. Après test de la β-Galactosidase on a prouvé que ce promoteur (Pcps) est largement transcrit par suite cette région serait la plus convenable.

Insertion du gène Lux : II- Préparation à l’insertion:

a. Le plasmide pBBRlux porte les gènes Lux ( AB ou CDABE)

b. Amplification du gène par PCR ( fragment de pBRlux avec le gène dans son centre)

c. Clonage du fragment amplifié dans le plasmide suicidaire pDS132

d. Lysogénisation d’ E. coli S17-1 λpir par le phage SPC32 H ( contenant le gène de résistance a la kanamycine au niveau du site cible ( one-step method) )

e. Transformation D’Ecoli par pDS–luxAB ou pDS-LuxCDABE

f. Conjugaison entre E. Coli transformée et lysogénisée .

Plasmide suicidaire pDS132:

1. plasmide non réplicatif, 2. aide a l’ intégration du fragment d’ADN.3. disparait au cours des générations 4. gène dont l’expression peut être létale (ici sacB)

5. gène de résistance aux antibiotiques ( chloramphénicol « cm » )

Insertion du gène Lux : III- Intégration au site cible SPC32H

KmR

pDS-LuxPremière

recombinaison homologue

Par compétition du saccharose

(présent à 20%)Deuxième

recombinaison homologue

SPC32H:LuxInsertion validée par

séquençage

KmR et CmS

KmR et CmR

KmS et CmS

Gène sacB :Gène de la Bacillus Subtilis confère une

sensibilité au saccharose au bac

gram(-)C’est le gène suicidaire

de pDS132

II- Contrôle de l’efficacité du Phage

modifié

1- Contrôle de l’affinité du phage rapporteur

But :

Savoir si la modification génétique de SPC32H a altérée son affinité et son habilité de lyser la bactérie Salmonella Typhimurium.

Méthode :

Test de concurrence bactériennes mesurée par D.O.

Échantillons testés :

- Solution de phages : SPC32H-ABi + culture Salmonella

- Solution de phages : SPC32H-AB + culture Salmonella

- Solution de phages : SPC32H-CDABE + culture Salmonella

- Solution de phages : SPC32H + culture Salmonella

- Solution de contrôle négatif : Tampon SM + culture Salmonella

Phage contenant le

gène luxAB et

le gène (Int)

codant pour

l’intégrase

Tampon utilisé pour dilution et stockage de bactériophages

Souche sauvage du phage

non modifié

Résultats :

Cycle Lysogénique présence de (Int )

L’ introduction du gène lux AB n’a pas altérée le pouvoir infectieux de la

souche sauvage

SPC32H tolère l’insertion de fragment de

2kb

Début de la lyse de par SPC32H-

AB Début de la lyse par SPC32H-CDABE

Cette Intervalle peut être due à :

1- Complication dans l’assemblement du phage due à la surexpression du gène luxCDABE à partir du promoteur CPS.

2- Problèmes d’encapsidation du phage causés par l’augmentation de la taille du génome du phage de 3kb > souche sauvage.Après 3 h d’action le

taux de Salmonella inhibée est devenu à peut-près égale pour les deux phages.

Ces résultats indiquent que l’affinité et le pouvoir infectieux du phage SP32H n’ont pas étés altérer

par la modification de son génome.

2- Validation de la production de bioluminescence par le phage génétiquement modifié

But :

Mettre en évidence la production de bioluminescence par les cellules infectées par le phage modifié contenant les gènes lux .

Méthode :

Mesure luminométrique

• Dilution en série de Culture de S. Typhimurium ou de E. Coli MG1655 ou de bouillon de Salmonella d’ échantillon alimentaire

Infection par les phages modifiés (10^8 PFU/mL )

Il faut ajouter

avant la mesure, 4 μL n-

décanal(1%)

pour les phages

contenant le

gène luxAB sans lux CDE

Résultats :

SPC32H-ABi-2=

SPC32H-ABi-1

-Le gène (Int)

Tout les phages ont présentés des

niveaux comparable de luminescences

SPC32H-ABi-2 etSPC32H-ABi-1

procurent le même niveau de

bioluminescence

l’absence d’ intégrase n’aboutit pas

directement une activité lytique

Pourquoi SPC32H-ABi-2 n’entre pas en

cycle lytique (T=100) comme SPC32H-AB ??

L’ intégrase est nécessaire pour la lysogénie Mais il y a aussi les gènes répresseurs qui inhibent toute expression de gènes lytiques . L’ élimination du gène Int dans SPC32H-ABi-2 ne conduira ni a un cycle lytique et ni un cycle lysogénique pour un certain temps la cellule reste en état appelé pseudolysogénique .

SPC32H-CDABE présente une bioluminescence signifiante et sans lyse immédiate

3- Contrôle de détection spécifique de Salmonella vivante

Test de l’affinité

But :

Mesurer la quantité de salmonella d’ après l’ intensité de l’ émission lumineuse

Procédure :

- Dilution en série de cultures de salmonella 10X

- Infection par SPC32H-CDABE ( 10^8 PFU/mL )

- Mesure de la bioluminescence émise pour 2 h d’infection

( pour capter le maximum de signal lumineux même pour les plus petites concentration de salmonella )

Test de spécificité

Dans les aliments et dans l’environnement Salmonella se trouve avec beaucoup d’autre bactéries pour cela la méthode de détection utilisée ne doit pas être influencé par la présence d’autres bactéries

On a mélangé la souche MG1655 d’ E. Coli avec le phage SPC32H-CDABE et on a mesuré la bioluminescence.

On a mélangé la souche MG1655 avec Salmonella et le phage et on a mesuré la bioluminescence

Résultats :

on a put détecter 20 CFU/ml de salmonella

Il y a corrélation entre la valeur RLU et le nombre de bactéries énuméré par comptage directe

L’infection avec SPC32H-CDABE permet de savoir le nombre de salmonella

grâce aux signaux bioluminescent

Test de l’affinité Test de spécificité

Aucune émission de

bioluminescence

Niveau de bioluminescence

égal a celui qui est émis en présence de salmonella seul

L’ intensité de détection n’est pas

altérée par présence d’autre bactérie non spécifique à SPC32H-

CDABE

3- Contrôle de détection spécifique de Salmonella vivante Test de l’ habilitée de SPC32H-CDABE de détecter SEULMENT les Salmonella

vivante:

Capacité de distinguer entre bactérie vivante et morte est une des objectifs de l’utilisation de la Méthode basée sur l’utilisation d’un bactériophage rapporteur.

Procédure:

• Culture de Salmonella de 10^5 UFC/ml

• La moitié de cette quantité est traitée 30 min avec de l’ éthanol 70% (v/v)

• Récupération des bactéries et resuspension dans un bouillon LB

• Mélange des cellules morte avec les cellule vivante ensemble dans des ratios différents ( 100 %, 10%, 1%, 0.1% et 0% de cellules vivante ).

• Infection de chaque Mélange avec SPC32H-CDABE ( 10^8 PFU/ml)

• Mesures luminométrique.

Résultats :

Échantillons contrôles

Pas de

cellules

vivantes

pas de signal

lumineux

L’ intensité du signal lumineux augmente

avec l’augmentation du taux des cellules vivante dans la

solution.

SPC32H-CDABE détecte SEULMENT les Salmonella vivantes ce qui prévient les

faux-positif obtenus par les tests classiques dues à aucune distinction entre cellule

morte et vivante

III- Applications sur les aliments: Laitue, Tranche de porc, Lait

1- Contaminations artificielles des échantillons alimentaires

A- préparation de l’inoculum pour la contamination artificielle

i. culture de Salmonella dans 3 ml de bouillon LB à 37 C H pour obtenir une valeur de D.O600 = 0.5 ~ 4 x 10^7 CFU/ml

ii. Dilutions en séries 10 X ( de 10 a 1 x10 ^6 CFU/ml ) dans bouillon LB

iii. Quantification de la concentration par étalement sur gélose LB ou XLD

B- Contamination des échantillons

Laitue Iceberg

• 3 échantillons de 10 g• Quantification sur XLD• 1 ml de salmonella dans chaque

échantillon• Séchage 2 h à température

Ambiante• Homogénéisation dans un Blender

dans 90 ml de bouillon LB• Dilutions en séries. • Culture de 0.1 ml des échantillons

sur XLD pour mesurer la quantité de Salmonella

• 5 ml de chaque échantillon dans tube stériles pour mesure luminométrique

Tranche de porc

• 3 échantillons de 10 g• Trempés dans l’inoculum pour 30

min• Homogénéisation• Culture de 0.1 ml sur XLS • 5 ml de chacun sont transférés

dans tube de test stériles pour mesure luminométrique

Lait pasteurisé

• 3 échantillons de 10 ml• + 1 ml de culture dans chacun.• Stockage 2 h à 4 C ̊• Homogénéisation• Culture sur XLD • Mesure luminométrique

Consommée frais et

sans cuisson

Viande de porc,

poulet et bœuf ont

un effet inhibiteur

sur la détection des éléments

pathogènes par PCR

Un des inconvénients des autres phages portant les gènes lux c’est l’inhibition

du signal lumineux dans les échantillons turbide (trouble - laiteux) on veut tester la

capacité de notre Phage rapporteur

Laitue Porc

Lait

Niveau de bioluminescence important avec une intensité dépendante du nombre des

salmonella même comparable au niveau du signal émis de l’

échantillon standard ne contenant que salmonella

L’ intensité du signal est moins

important que celui des autres

échantillons mais continue a

démontré une allure dose-

dépendante et linéaire en

corrélation avec le nombre de bactérie

Résultats

ConclusionsLe phage peut détecté une très petite quantités de salmonella 20 CFU/ml

Sa sensibilité n’est pas altérer par les constituants des aliments

Les phages rapporteurs SPC32H-CDABE peuvent être utiliser dans les laboratoires comme une méthode de détection précise de pathogènes.