Bai giang cong nghe enzyme

Trường Cao Đẳng Kinh tế Công nghệ TPHCM

Khoa Công nghệ Sinh học

**************************

CCÔÔNNGG NNGGHHỆỆ EENNZZYYMMEE (Tài liệu lưu hành nội bộ)

CBDG: ThS. Lê Thanh Hải

HIAST

TPHCM, 03/2013

CÔNG NGHỆ ENZYME i

MỤC LỤC

1. MỞ ĐẦU ................................................................................................................................. 1

1.1. Lịch sử nghiên cứu và phát triển công nghệ enzyme ........................................................ 1

1.2. Khái niệm về enzyme........................................................................................................ 2

1.2.1. Bản chất sinh học của enzyme ................................................................................... 3

1.2.2. Bản chất hóa học của enzyme .................................................................................... 4

1.2.3. Cấu trúc của enzyme .................................................................................................. 5

1.3. Cơ chế tác dụng của enzyme............................................................................................. 7

1.3.1. Cơ chế xúc tác của enzyme ....................................................................................... 7

1.3.2. Năng lượng xúc tác .................................................................................................... 8

1.3.3. Sự tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất .................................................................. 8

1.3.4. Động học của phản ứng enzyme ................................................................................ 9

1.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng enzyme .......................................................... 10

1.3.5.1. Nhiệt độ ............................................................................................................ 10

1.3.5.2. pH ..................................................................................................................... 11

1.3.5.3. Chất kìm hãm ................................................................................................... 11

1.3.5.4. Chất hoạt hóa .................................................................................................... 12

1.3.6. Tính chất đặc hiệu của enzyme................................................................................ 13

1.4. Phân loại enzyme ............................................................................................................ 13

1.4.1. Danh pháp quốc tế của enzyme ............................................................................... 13

1.4.2. Phân loại enzyme ..................................................................................................... 14

1.4.2.1. Oxydoreductase ................................................................................................ 14

1.4.2.2. Transpherase ..................................................................................................... 14

1.4.2.3. Hydrolase ......................................................................................................... 15

1.4.2.4. Lipase ............................................................................................................... 15

1.4.2.5. Isomerase .......................................................................................................... 15

1.4.2.6. Ligase ............................................................................................................... 15

1.5. Phương pháp tách và làm sạch enzyme .......................................................................... 15

1.5.1. Các phương pháp phá vỡ tế bào .............................................................................. 15

1.5.2. Phương pháp gây biến tính chọn lọc ....................................................................... 16

1.6. Phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme ..................................................... 17

1.6.1. Các nhóm phương pháp xác định khả năng xúc tác của E ...................................... 17

1.6.2. Đơn vị hoạt độ ......................................................................................................... 17

2. KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG CÔNG NGHỆ ENZYME .................................................. 18

2.1. Ý nghĩa của kỹ thuật tinh sạch trong công nghệ enzyme ............................................... 18

CÔNG NGHỆ ENZYME ii

2.2. Kỹ thuật cơ bản ............................................................................................................... 19

2.2.1. Các phương pháp cơ học tách enzyme .................................................................... 19

2.2.2. Các phương pháp phá vỡ tế bào sinh vật ................................................................. 19

2.2.2.1. Phá vỡ tế bào bằng phương pháp cơ học: ........................................................ 20

2.2.2.2. Phá vỡ tế bào bằng phương pháp không phải cơ học: ..................................... 20

2.2.2.3. Các phương pháp cô đặc .................................................................................. 21

2.2.2.4. Các phương pháp tinh sạch enzyme ................................................................. 21

2.2.2.5. Tạo sản phẩm enzyme ...................................................................................... 21

3. ENZYME CỐ ĐỊNH ............................................................................................................. 22

3.1. Chuyển hóa sinh học ....................................................................................................... 22

3.1.1. Chuyển hóa vật chất do enzyme tự do hay enzyme hòa tan .................................... 22

3.1.2. Chuyển hóa vật chất bằng enzyme không hòa tan .................................................. 22

3.1.3. Chuyển hóa vật chất do các quá trình lên men ........................................................ 23

3.1.4. Chuyển hóa vật chất do tế bào cố định .................................................................... 23

3.2. Đặc điểm của enzyme cố định ........................................................................................ 23

3.3. Phương pháp tạo enzyme cố định ................................................................................... 23

3.3.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme cố định ............................................................. 23

3.3.2. Phương pháp cố định enzyme ................................................................................. 25

3.3.2.1. Chất mang dùng để cố định enzyme ................................................................ 25

3.3.2.2. Phương pháp cố định enzyme .......................................................................... 25

3.4. Ứng dụng của enzyme cố định ....................................................................................... 26

3.4.1. Sản xuất fructose nhờ enzyme glucose isomerase .................................................. 27

3.4.2. Sản xuất L-amino acid nhờ enzyme aminoacylase cố định .................................... 28

4. THU NHẬN ENZYME......................................................................................................... 28

4.1. Chọn nguồn nguyên liệu ................................................................................................. 28

4.2. Thu nhận enzyme ............................................................................................................ 31

5. ỨNG DỤNG CỦA ENZYME .............................................................................................. 32

5.1. Tình hình ứng dụng enzyme trong công nghiệp trên thế giới ........................................ 32

5.2. Ứng dụng trong y học ..................................................................................................... 34

5.3. Ứng dụng trong hóa học ................................................................................................. 34

5.4. Ứng dụng trong công nghiệp .......................................................................................... 34

5.4.1. Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm ................................................................. 34

5.4.2. Ứng dụng trong công nghiệp dệt ............................................................................. 36

5.4.3. Ứng dụng trong công nghiệp thuộc da .................................................................... 36

5.5. Ứng dụng trong nông nghiệp .......................................................................................... 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................................. 36

CÔNG NGHỆ ENZYME 1

1. MỞ ĐẦU

1.1. Lịch sử nghiên cứu và phát triển công nghệ enzyme

Enzyme học là môn học nghiên cứu về vật chất phân tử có hoạt tính sinh học. Môn học này phát triển rất mạnh nhờ những thành tựu của môn hóa sinh học, vi sinh vật học, di truyền học và cả những tiến bộ của ngành hóa học và vật lý học.

Bảng 1.1. Những cột mốc quan trọng trong nghiên cứu và phát triển môn enzyme học[2]

STT Năm Nội dung nghiên cứu, phát triển

1 1833 Payen và Persoz tách được diastase từ malt

2 1874 Hansen là người đầu tiên tách được rennet từ bao tử cừu

3 1876 Kiihne là người đầu tiên đề nghị gọi chất xúc tác sinh học là enzyme

4 1897 Hai anh em nhà Buchner chứng minh dịch chiết từ nấm men có thể chuyển hóa đường glucose thành cồn và CO2

5 1900 Rohm sử dụng enzyme protease trong công nghệ thuộc da

6 1913 Rohm là người đầu tiên sử dụng enzyme trong chất tẩy rửa

7 1917 Boidin và Effront nghiên cứu α-amylase của B.subtilis và ứng dụng trong ngành dệt

8 1920 – 1928 Will Slitter tinh sạch được enyzme

9 1926 Samner kết tinh được enyme urease

Northrop kết tinh được protease

10 1928 Fleming phát hiện ra penicilline

11 Thế chiến II Bắt đầu sản xuất kháng sinh theo mô hình công nghiệp, sử dụng amyloglucosidase đường hóa tinh bột. Sử dụng penicillineacylase trong sản xuất penicilline

12 1969 Tanabec co đã xây dựng quy trình công nghiệp sản xuất amino acid. Sử dụng glucose isomerase trong sản xuất dịch đường giàu fructose


13 1972 Boyer et al. đưa ra kỹ thuật di truyền. Kỹ thuật này có tác động tích cực trong công nghệ enzyme

14 1973 Tanobe co sản xuất aspartic acid bằng lên men cố định tế bào

Winter và Ferch đưa ra công nghệ sản xuất protein

15 1984 Nito xác lập quá trình cơ bản tạo acrylamide và một loại quá trình sản xuất có sự tham gia của enzyme

16 1984 - nay Đã phát hiện hàng trăm loại enzyme khác nhau, đưa vào sản xuất công nghiệp và ứng dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất và đời sống. kỹ thuật enzyme cố định, tế bào cố định đã đưa công nghệ enzyme đạt được nhiều kết quả cao

Diastase: là enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân tinh bột thành maltose. Diastase là enzyme đầu tiên được phát hiện ra. Nó được chiết tách từ malt vào năm 1833 bởi Anselme Payen và Jean-Francois Persoz – nhà Hóa học tại nhà máy đường của Pháp. Tên “diastase” xuất phát từ tiếng Hy Lạp (diastasis), trong dịch nha nóng, các enzyme này thủy phân tinh bột trong hạt đại mạch thành các đường hòa tan và vì thế có thể tách phần bỏ malt với phần còn lại của hạt. Ngày nay, diastase là α, β hoặc γ-amylase.

Rennet là enzyme được sản xuất trong dạ dày của động vật có vú khi còn trong giai đoạn bú sữa mẹ và thường được sử dụng để làm phomai. Rennet là một hỗn hợp enzyme, bao gồm: các enzyme thủy phân protein (protease) gây đông tụ sữa, có thể tách phần sữa đông (phần chất rắn) và phần huyết thanh sữa (phần chất lỏng). Những enzyme hoạt động trong dạ dày bê được gọi là chymosin hoặc rennin. Ngoài ra, cũng có những enzyme quan trọng khác như: pepsin và lipase.

Protease: (còn gọi là peptidase hoặc proteinase) là enzyme thủy phân protein

αααα-amylase là enzyme thủy phân liên kết alpha của phân tử polysaccharide như tinh bột và glycogen thành glucose và maltose. Alpha amylase được tìm thấy chủ yếu ở người và động vật có vú khác, ngoài ra, chúng còn có mặt trong các loại hạt có chứa tinh bột và được tiết ra bởi một số loại nấm.

Urease: là enzyme xúc tác phản ứng thủy phân ure thành carbon dioxide (CO2) và amoniac (NH3), hiện diện trong vi khuẩn đường ruột. Urease được tìm thấy trong vi khuẩn, nấm men và thực vật.

1.2. Khái niệm về enzyme

Sinh vật được phân ra 2 nhóm dựa vào cấu tạo cơ thể của chúng: sinh vật đơn bào và sinh vật đa bào. Mặc dù chúng có sự khác biệt rất lớn về cấu tạo cơ thể và những đặc điểm sinh lý khác nhau nhưng chúng đều giống nhau về trao đổi chất với môi trường bên ngoài và một số đặc điểm về biến dị di truyền.

Sinh vật được xem như là một hệ thống mở có liên quan chặt chẽ đến quá trình trao đổi chất của cơ thể ở trong tế bào và giữa tế bào với môi trường ngoài. Quá trình trao đổi chất bên trong tế bào và giữa tế bào với môi trường bên ngoài là biểu hiện sinh động nhất của sự sống. Sự khác nhau giữa tế bào sống và vật chất không phải sự sống chính là khả năng trao đổi chất này. Khi cơ thể không còn khả năng trao đổi chất thì cơ thể sẽ chết. Do đó mối quan hệ giữ cơ thể với bên ngoài là mối quan hệ hữu cơ.

Quá trình trao đổi chất bao gồm quá trình dị hóa và quá trình đồng hóa. Quá trình dị hóa là quá trình phân giải vật chất để cung cấp cho tế bào năng lượng và vật liệu xây dựng tế bào, quá trình này có thể xảy ra trong tế bào hoặc ngoài tế bào.

Quá trình di hóa xảy ra trong tế bào là quá trình cung cấp năng lượng, vật chất cho quá trình tổng hợp vật chất để tạo ra sinh khối nhằm làm đổi mới vật chất tế bào.

Quá trình dị hóa ngoài tế bào phần lớn chỉ đáp ứng như cầu về vật chất, giúp cho tế bào tổng hợp các chất trong tế bào. Năng lượng tạo ra từ quá trình dị hóa ngoài tế bào thường được giải phóng ở dạng nhiệt năng.

CÔNG NGHỆ ENZYME

Quá trình tổng hợp vật chất cho tlượng từ các phản ứng do quá trình dcủa sinh vật đối với môi trường xung quanh.

Hình

Sản phẩm của quá trình trao đổi ch

� Sản phẩm bậc 1 � Sản phẩm bậc 2

Sản phẩm bậc 1: là các sản phẩm đưCác sản phẩm này sẽ được tham gia tr

Sản phẩm bậc 2: là các sản phẩm cbào. Trong quá trình tổng hợp, mtheo mà sẽ thoát ra khỏi tế bào. Hisinh tổng hợp thừa có liên quan chtruyền, nhiều khi điều chỉnh hệ gen schất được tạo ra do quá trình phân gi(quá trình dị hóa ngoài tế bào). Mdị hóa trong tế bào)

Quá trình trao đổi chất liên tục đưchất trong thiên nhiên. Quá trình chuynhiều chu trình chuyển hóa các chkhông chỉ ở trong tế bào sinh vật mà cnày được xúc tác bởi một loại protein đbào được gọi là enzyme ngoại bào. Các enzyme thnội bào và enzyne ngoại bào đều đư

1.2.1. Bản chất sinh học của enzyme

Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứsinh vật sống tổng hợp nên và tham gia vào cá

Như vậy, bản chất sinh học của enzyme là ssinh hóa trong và ngoài tế bào sinh v

� Enzyme được tạo ra trong tếtạp và được điều khiển, kiểm soát r

� Enzyme tham gia phản ứng c� Enzyme tham gia phản ứng trong đi

enzyme được tổng hợp và hođộ của cơ thể và của tế bào sinh vđộng trong khoảng 30 - 40oC

t cho tế bào chỉ xảy ra trong tế bào. Quá trình này thưng do quá trình dị hóa. Như vậy, quá trình trao đổi chất được xem như h

ng xung quanh.

Hình 1.1. Hệ thống mở của tế bào sinh vật

i chất tạo ra 2 dạng sản phẩm:

m được tạo ra cả trong quá trình phân giải và cả trong quá trình tc tham gia trực tiếp nên vật chất tế bào và tham gia các các quá trình t

m cũng được tạo ra từ quá trình tổng hợp và quá trình phân gip, một số vật chất được tạo ra không tham gia vào quá trình trao

bào. Hiện tượng này được coi như quá trình sinh tổng hcó liên quan chặt chẽ đến hệ di truyền có trong tế bào. Do đó, vi

gen sẽ thu được lượng lớn các sản phẩm sinh tổng ho ra do quá trình phân giải sẽ không tham gia vào quá trình trao đổi ch

bào). Một số vật chất khác thoát ra khỏi tế bào vào môi trư

c được xảy ra giữa trong và ngoài tế bào, tạo nên sự t trong thiên nhiên. Quá trình chuyển hóa theo con đường sinh vật đóng vai trò r

n hóa các chất có trong thiên nhiên. Các phản ứng sinh họt mà cả ở ngoài môi trường, bao quanh tế bào đó. Các ph

i protein đặc biệt gọi là enzyme. Các enzyme tham gia các phi bào. Các enzyme thực hiện trong tế bào gọi là enzym

u được tổng hợp trong tế bào.

a enzyme

ứu về enzyme và đã đi đến thống nhất: enzyme là mp nên và tham gia vào các phản ứng sinh học

a enzyme là sản phẩm của các quá trình sinh học và thbào sinh vật. Các loại enzyme đều có những đặc tính chung như sau:

ế bào sinh vật: quá trình tổng hợp enzyme là một quá trình hm soát rất chặt chẽ

ng cả trong tế bào sống và cả khi enzyme được tách khng trong điều kiện nhiệt độ ôn hòa. Vì trong quá trình s

p và hoạt động trong điều kiện nhiệt độ của tế bào và nhibào sinh vật thường là nhiệt độ thấp. Phần lớn nhiệt đ

C

3

ường phải thu nhận năng c xem như hệ thống mở

trong quá trình tổng hợp. bào và tham gia các các quá trình tế bào.

quá trình phân giải của tế o ra không tham gia vào quá trình trao đổi chất tiếp

ng hợp thừa. Hiện tượng bào. Do đó, việc điều chỉnh hệ di

ng hợp thừa. Môi số vật i chất nằm ở ngoài tế bào

bào vào môi trường (quá trình trình

biến đổi liên tục của vật ò rất quan trọng trong rất ọc xảy ra thường xuyên

bào đó. Các phản ứng sinh học i là enzyme. Các enzyme tham gia các phản ứng ngoài tế

i là enzyme nội bào. Cả enzyme

enzyme là một loại protein được

c và thực hiện các phản ứng c tính chung như sau:

t quá trình hết sức phức

c tách khỏi tế bào sống ì trong quá trình sống của tế bào,

bào và nhiệt độ của cơ thể. Nhiệt t độ cơ thể sinh vật dao


� Enzyme có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể từ giai đoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hoàn toàn năng lượng dự trữ trong các hợp chất hóa học. Quá trình chuyển hóa này được thực hiện theo chuỗi phản ứng, mỗi phản ứng được xúc tác bởi một loại enzyme. Các enzyme này lần lượt thay thế nhau xúc tác để các phản ứng lần lượt xảy ra, để cuối cùng tạo thành CO2, H2O, một số chất khác và giải phóng năng lượng. Cũng có thể chuỗi phản ứng sẽ tạo thành chu kỳ chuyển hóa khép kín. Trong chuỗi chuyển hóa hở hay chuỗi chuyển hóa khép kín, sản phẩm của phản ứng trước sẽ là cơ chất cho phản ứng sau

� Enzyme có thể thực hiện một phản ứng: Các phản ứng thường xảy ra ở ngoài tế bào (khi ta thực hiện chúng trong ống nghiệm). Trong tế bào thường không xảy ra phản ứng enzyme đơn (một phản ứng) mà thường xảy ra các phản ứng theo chuỗi phản ứng.

� Phản ứng enzyme là những phản ứng tiêu hao năng lượng rất ít. Trong khi đó, các phản ứng hóa học được xúc tác vởi các chất xúc tác hóa học đòi hỏi năng lượng rất lớn. Nhờ có hoạt động xúc tác của enzyme, các phản ứng sinh hóa xảy ra liên tục trong điều kiện năng lượng ôn hòa.

� Enzyme chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng. Gen quyết định tổng hợp ra một loại enzyme. Mỗi một enzyme quyết định một phản ứng sinh hóa. Các nhà khoa học đưa ra cơ chế sau:

Một gen => một enzyme => một phản ứng Như vậy, gen quyết định bản chất sinh học và bản chất hóa học của enzyme. Cơ chế này có một ý nghĩa rất lớn trong việc điều khiển tổng hợp enzyme trong tế bào sinh vật.

1.2.2. Bản chất hóa học của enzyme

Nếu tách enzyme ra khỏi tế bào và tiến hành phân tách thành phần hóa học của chúng, ta sẽ thấy chúng thuộc 2 nhóm:

1. Nhóm enzyme đơn cấu tử:

Thuộc nhóm này bao gồm những enzyme chỉ được cấu tạo một thành phần hóa học duy nhất là protein. Những enzyme được tạo thành chỉ từ protein duy nhất được gọi là enzyme đơn cấu tử

2. Nhóm enzyme đa cấu tử

Thuộc nhóm này bao gồm những enzyme có 2 thành phần:

� Apoprotein hay apoenzyme: Phần protein thuần � Agon: Phần thứ 2 là thành phần không phải protein. Phần này thường là những chất hữu cơ đặc hiệu

có vai trò thúc đẩy quá trình xúc tác.

Ở những enzyme đa cấu tử, phần apoenzyme đóng vai trò xúc tác nhưng nếu thiếu thành phần thứ hai (các chất hữu có đặc hiệu) thì enzyme không thể hoạt động được. Chính vì thế, chất hữu cơ đặc hiệu này còn được gọi là chất cộng tác (cofactor).

Các chất hữu cơ đặc hiệu này có thể gắn rất chặt với phần protein, cũng có thể gắn rất lỏng với phần protein. Ta có thể dễ dàng tách chúng ra khi tiến hành thẩm tích qua màng. Ở đây xảy ra 2 hiện tượng:

� Những chất hữu cơ đặc hiệu gắn chặt với protein bằng liên kết đồng hóa trị được gọi là nhóm phụ (prosthetic)

� Những chất hữu cơ đặc hiệu gắn không chặt với protein và dễ dàng tách chúng ra khỏi protein được gọi là coenzyme

Tuy nhiên, sự phân biệt này chỉ mang tính chất tương đối. Ngoài ra các nhà khoa học cũng cho thấy, trong thành phần của những enzyme có sự hiện diện của một số kim loại. Các kim loại này thường là một trong những thành phần của chất hữu cơ đặc hiệu

Ví dụ: trong hệ enzyme cytochrome, catalase, peroxydase, sắt (Fe) gắn chặt với nhân porphyrin.

Các kim loại có trong thành phần của enzyme thường rất dễ tách ra khỏi enzyme. Trong trường hợp enzyme mất kim loại, chúng sẽ mất hoạt tính. Khi ta đưa các kim loại tương ứng vào các enzyme, hoạt tính enzyme lại được khôi phục. Tính chất này mang tính chất thuận nghịch. Vai trò của kim loại trong hoạt động của enzyme vẫn chưa được làm sáng tỏ. Tuy nhiên các nhà khoa học cũng cho rằng, có thể kim loại đóng vai trò liên kết giữa enzyme và cơ chất, liên kết giữa apoenzyme và coenzyme, tham gia trực tiếp vào quá trình vận chuyển điện tử như vai trò của sắt trong cytochrome và peroxydase.


Bảng 1.2. Một số enzyme có chứa kim loại [2]

STT Enzyme Kim loại

1 Hệ cytochrome, catalase, peroxydase Sắt (Fe)

2 Polyphenoloxydase Đồng (Cu)

3 Carbonic anhydrase Kẽm (Zn)

4 Peptidase Mangan (Mn), Sắt (Fe), Magie (Mg)

5 Phosphatase Magie (Mg)

6 Arginase Mangan (Mn)

1.2.3. Cấu trúc của enzyme

Enzyme là protein đặc biệt. Ngoài cấu trúc giống như cấu trúc bình thường của một protein, enzyme còn có cấu trúc rất đặc biệt liên quan đến hoạt động của enzyme. Không phải toàn bộ các phần của enzyme đều tham gia vào hoạt động xúc tác, mà chỉ có những bộ phận rất đặc biệt mang tính đặc hiệu trong phân tử protein mới tham gia xúc tác phản ứng. Bộ phận đặc hiệu này được gọi là trung tâm hoạt động của enzyme

Trung tâm hoạt động của enzyme bao gồm:

� Những nhóm hóa học, những liên kết peptide tiếp xúc trực tiếp với cơ chất. � Những nhóm hóa học, những liên kết peptide không tiếp xúc trực tiếp với cơ chất nhưng có chức

năng trực tiếp trong quá trình xúc tác

Phần còn lại đóng vai trò như một cái khung, giữ cho cấu trúc không gian thích hợp với khả năng xúc tác. Nếu bị tác động bởi các điều kiện bên ngoài như nhiệt độ, pH, nồng độ các chất, bộ khung này sẽ biến đổi cấu trúc không gian. Từ đó làm thay đổi sâu sắc hoạt tính enzyme.

Phần của phân tử enzyme không có liên quan đến hoạt tính enzyme, nếu bị tác động, bị mất đi hoặc bị biến đổi sẽ hoàn toàn không ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme

Trung tâm hoạt động của enzyme thường chứa các amino acid có nhóm hóa học hoạt động mạnh như amino acid serine, histidine, cysteine, lysine, arginine, glutamic acid, aspartic acid, tryptophan. Các nhóm hóa học này hoạt động có khả năng gắn với cơ chất để tạo thành phức chất enzyme - cơ chất. Những nhóm hóa học hoạt động mạnh bao gồm:

� Nhóm NH2 của lysine � Nhóm -SH của cysteine � Nhóm γ-carboxyl của glutamic acid

Các gốc amino acid tạo ra trung tâm hoạt động của enzyme thường không nằm cạnh nhau trong chuỗi polypeptide thẳng (cấu trúc bậc 1). Trong thực tế, chuỗi popypeptide của enzyme tồn tại ở trạng thái không gian (cấu trúc bậc 3, bậc 4) nên các amino acid thường tồn tại gần nhau theo cấu trúc không gian. Do cấu trúc không gian như vậy, trung tâm hoạt động được tạo thành.

Trong trung tâm hoạt động của enzyme người ta còn thấy có ion kim loại. Các ion kim loại có mặt trong trung tâm hoạt động của enyzme có vai trò xúc tác rất lớn.

Ngoài các gốc amino acid, ion kim loại, các nhà khoa học còn cho thấy các nhóm chức của coenzyme cũng được coi như một phần cấu tạo của trung tâm hoạt động của enzyme.


Mỗi một enzyme thường có 1 trung tâm hoạt động. Tuy nhiên cũng có enzyme có 2 trung tâm hoạt động (alcohol hydrogenase của gan), thậm chí có enzyme có tới 4 trung tâm hoạt động (alcohol dehydrogenase của nấm men)

Hoạt động xúc tác của trung tâm hoạt động có liên quan tới cơ chất. Các nhà khoa học khi nghiên cứu vấn đề này đã đưa ra 3 quan điểm quan trọng:

1. Chỉ những cơ chất có cấu trúc phân tử thích hợp với trung tâm hoạt động của enzyme mới có thể kết hợp được với trung tâm hoạt động của enzyme để tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất.

Theo quan điểm này, cơ chất có cấu trúc phân tử trùng với trung tâm hoạt động là hiện tượng kết hợp rất chặt chẽ và mang tính đặc hiệu cao. Chính vì thế, mỗi loại enzyme chỉ có thể tham gia xúc tác phản ứng cho một loại cơ chất nhất định.

2. Các loại enzyme thường tạo ra trung tâm hoạt động có cấu trúc không gian nhất định.

Các trung tâm hoạt động thường được hình thành sẵn ở các enzyme. Chính những trung tâm hoạt động của enzyme quyết định cho phép những cơ chất cấu trúc tương ứng với trung tâm hoạt động mới được kết hợp vào. Quan điểm này do Fisher đề xướng. Thuyết của Fisher tuy đã giải thích được các hiện tượng gắn kết giữa cơ chất và trung tâm hoạt động của enzyme nhưng nhiều kết quả thực nghiệm, thuyết này chưa giải thích được trọn vẹn

3. Thuyết trung tâm hoạt động linh hoạt của Koshland được nhiều nhà khoa học chấp nhận hơn.

Theo thuyết này, các nhóm chức của trung tâm hoạt động của enzyme tự do chưa có thể tham gia xúc tác ngay. Chính cơ chất là tác nhân tác động làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động của enzyme. Chính tác động cảm ứng này của cơ chất làm cho các gốc amino acid, các nhóm chức của trung tâm hoạt động di chuyển, định hướng một cách thích hợp, chính xác để gắn cơ chất vào trung tâm hoạt động và thực hiện quá trình xúc tác.

Như vây, Koshland cho rằng trung tâm hoạt động của enzyme chỉ được tạo thành khi có sự tác động cảm ứng của cơ chất. Chính cơ chế mềm dẻo này của trung tâm hoạt động đã giải thích được sự cạnh tranh giữa cơ chất và các chất không phải cơ chất nhưng lại có cấu trúc không gian giống cơ chất. Khi đó, các chất giống cơ chất chiếm chỗ trong trung tâm hoạt động của enzyme và phản ứng cơ chất không xảy ra.

Hình 1.2. Mô hình của Fisher giải thích cơ chế tác động của enzyme với cơ chất


Hình 1.3. Mô hình của Kosland giải thích cơ chế tác động của enzyme với cơ chất

1.3. Cơ chế tác dụng của enzyme

1.3.1. Cơ chế xúc tác của enzyme

Mọi vi sinh vật đều được cấu tạo từ tế bào. Các tế bào luôn luôn tiến hành quá trình trao đổi chất với môi trường bên ngoài bằng những phản ứng sinh hóa. Các phản ứng xảy ra luôn luôn được xúc tác bởi các enzyme của tế bào. Như vậy, enzyme đóng vai trò rất quan trọng trong sinh lý của tế bào. Tác động của enzyme vào các phản ứng sinh hóa mang 2 ý nghĩa đối với tế bào:

1. Làm giảm năng lượng hoạt hóa phản ứng

Tất cả các phản ứng sinh hóa trong tế bào sinh vật đều được thực hiện trong điều kiện ôn hòa, trùng với nhiệt độ của cơ thể. Các phản ứng enzyme thường không đòi hỏi nhiệt độ cao, do đó nó đảm bảo cho mọi hoạt động sinh lý bình thường của tế bào. Trong khi đó, năng lượng chi phí cho những phản ứng hóa học thường rất cao.

Đặc điểm làm giảm năng lượng hoạt hóa của phản ứng enzyme có ý nghĩa rất lớn trong sinh lý của sinh vật. Đặc điểm này gắn liền với quá trình tiến hóa của sinh vật, nếu nhiệt độ cơ thể tăng sẽ lảm rối loạn toàn bộ quá trình sinh lý của tế bào. Khi đó cơ thể sẽ chuyển từ trạng thái sinh lý bình thường sang trạng thái bệnh lý. Cơ thể ở trạng thái bệnh lý là kết quả của sự rối loạn các phản ứng enzyme. Chính vì thế, việc duy trì trạng thái sinh lý bình thường của tế bào hay của cơ thể đồng nghĩa với việc duy trì hoạt động hài hòa của các phản ứng enzyme

2. Enzyme tham gia vào các phản ứng sinh hóa thường làm tăng tốc độ phản ứng

Tốc độ phản ứng tăng sẽ làm tăng mức độ chuyển hóa cơ chất. Như vậy quá trình trao đổi chất của tế bào sẽ tăng. Kết quả là tế bào sẽ tăng nhanh về số lượng và khối lượng. Như vậy, enzyme không chỉ đóng vai trò duy trì trạng thái sinh lý của tế bào mà còn đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển và sinh sản của tế bào, duy trì sự chuyển hóa vật chất trong các chu trình chuyển hóa trong thiên nhiên. Nhờ có hoạt động của enzyme mà khối lượng cơ chất được chuyển hóa trong một đơn vị thời gian trong tế bào lớn gấp hàng ngàn lần khối lượng tế bào.

Bản chất của các phản ứng enzyme là khi có sự tham gia xúc tác của các enzyme, các cơ chất sẽ được hoạt hóa mạnh, từ đó làm thay đổi tính chất hóa học của cơ chất, kết quả sau phản ứng sẽ tạo ra những sản phẩm của phản ứng. Dưới tác dụng của enzyme, cơ chất có thể có những thay đổi không chỉ về cấu trúc hóa học, mà còn thay đổi tính chất hóa học. Quá trình xúc tác của enzyme xảy ra qua 3 giai đoạn:

Giai đoạn thứ nhất: Enzyme sẽ kết hợp với cơ chất bằng những liên kết yếu, nhờ đó sẽ tạo ra phức hệ enzyme – cơ chất. Phức hệ này thường không bền. Phản ứng tạo ra phức hệ enzyme – cơ chất thường xảy ra rất nhanh và đòi hỏi ít năng lượng.

Giai đoạn thứ hai: khi cơ chất tạo phức với enzyme sẽ bị thay đổi cả cấu hình không gian, cả về mức độ bền vững của các liên kết. Kết quả là các liên kết bị phá vỡ và tạo ra sản phẩm

Giai đoạn thứ ba: Đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm quá trình phản ứng được tạo thành và tách ra khỏi enzyme

Cơ chế xúc tác tổng quát của enzyme:

Trong đó: E – enzyme (enzyme) S – Cơ chất (substrate) P – Sản phẩm (products)

E + S ES E + P


Hình 1.4. Cơ chế xúc tác của enzyme

1.3.2. Năng lượng xúc tác

Enzyme tham gia hầu hết các phản ứng sinh hóa trong cơ thể sống. Nhờ hoạt động xúc tác của enzyme, các tế bào có thể chuyển hóa lượng cơ chất rất lớn. Enzyme sử dụng nguồn năng lượng nào và sử dụng năng lượng bằng cách nào để tiến hành quá trình xúc tác mà khả năng xúc tác lại lớn như vậy?

Các nhà khoa học đưa ra 2 cách sử dụng năng lượng liên kết để tiến hành quá trình xúc tác:

Thứ nhất: enzyme sử dụng năng lượng liên kết để làm giảm năng lượng hoạt hóa. Năng lượng này được giải phóng trong quá trình hình thành liên kết yếu trong tương tác qua lại giữa enzyme và cơ chất.

Thứ hai: enzyme sử dụng năng lượng liên kết tạo phản ứng xúc tác đặc hiệu thông qua cơ chế sau:

� Giảm entropy: enzyme và cơ chất luôn ở trạng thái chuyển động trong dung dịch lỏng. Nếu không có năng lượng liên kết, enzyme sẽ rất khó định hướng tác động lên cơ chất, giữ cơ chất và định hướng phản ứng.

� Làm mất vỏ nước bao quanh: nhờ tương tác yếu giữa enzyme và cơ chất có khả năng làm giảm toàn bộ liên kết hydrogen tồn tại giữa cơ chất và nước bao quanh

� Năng lượng liên kết do các tương tác yếu tạo ra ở trạng thái chuyển tiếp được sử dụng làm căng hoặc uốn khúc cơ chất, tạo điều kiện cho enzyme xúc tác phản ứng dễ dàng

� Năng lượng liên kết tạo ra cấu hình không gian của enzyme sao cho phù hợp với cấu hình không gian của cơ chất

1.3.3. Sự tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất

Brown và Henri là những nhà khoa học đầu tiên đưa ra thuyết “phức hợp trung gian”. Sau đó, Michaelis và Menten phát triển thêm.

Theo thuyết này, enzyme sẽ kết hợp với cơ chất, tạo ra một phức hợp không gian giữa enzyme và cơ chất. Do tác dụng của enzyme, cơ chất bị biến đổi mạnh và cuối cùng tạo ra sản phẩm. Sự tạo thành phức hợp enzyme - cơ chất thường xảy ra rất nhanh và về bản chất thì phức hợp này hoàn toàn không bền vững. Các tính chất này của phức hợp enzyme và cơ chất phụ thuộc rất nhiều ở bản chất hóa học của cơ chất

Để tạo thành phức hợp enzyme - cơ chất có đến năm loại liên kết tham gia. Các liên kết này có đặc tính riêng và năng lượng liên kết khác nhau. Các liên kết này bao gồm: liên kết phối trí, liên kết hydrogen, liên kết ion, liên kết kị nước lực Van der Waals và liên kết do chuyển dịch điện tích

Enzyme là những phần tử protein có phân tử lượng lớn. Trên bề mặt của phân tử enzyme tồn tại rất nhiều nhóm hóa học đặc hiệu. Các nhóm chức này đóng vai trò quan trọng trong định hướng và giúp cơ chất enzyme tiếp cận với nhau. Khi enzyme và cơ chất tương tác với nhau thường tạo ra liên kết yếu, tạo ra năng lượng kết hợp . Năng lượng được tạo ở từng liên kết yếu này thường nhỏ, nhưng có nhiều năng lượng liên kết nên tổng năng lượng trong phản ứng enzyme là rất lớn.

Enzyme sẽ sử dụng nguồn năng lượng này để làm giảm năng lượng trong phản ứng enzyme. Năng lượng giảm trong phản ứng enzyme được chuyển qua hệ thống các chất tham gia phản ứng. Lượng năng lượng giảm trong quá trình hoạt hóa phải bằng lượng năng lượng các chất tham gia phản ứng nhận được.


Theo ý kiến của các nhà khoa học, đầu tiên cơ chất phải được hoạt hóa để chuyển sang trạng thái chuyển tiếp tạm thời để tương tác với cơ chất tạo nên phức enzyme – cơ chất (ES). Sau đó phức hợp này lại được hoạt hóa để chuyển thành trạng thái chuyển tiếp tạm thời sang phức hợp EP (P là sản phẩm). Sau đó phức hợp EP lại chuyển sang trạng thái tạm thời khác để tạo thành P và giải phóng E tự do. Năng lượng của sản phẩm sẽ thấp hơn mức năng lượng của cơ chất ban đầu. Toàn bộ quá trình phản ứng được diễn giải chính thức như sau

E + S => ES => EP => E + P

Năng lượng cần thiết để làm giảm năng lượng hoạt hóa quá trình xúc tác, đồng thời cũng tạo ra tính đặc hiệu cho phân tử enzyme. Tính đặc hiệu của enzyme là khả năng nhận biết, chọn lọc cơ chất để tiến hành các phản ứng riêng theo bản chất từng loại enzyme.

1.3.4. Động học của phản ứng enzyme

Năm 1913 hai nhà khoa học Michaelis và Menten đưa ra mô hình động học để giải thích phản ứng được xúc tác bởi enzyme và lập phương trình phản ánh quan hệ giữa vận tốc phản ứng với nồng độ cơ chất và enzyme. Theo mô hình này, enzyme và cơ chất sẽ kết hợp với nhau, tạo nên phức hợp enzyme – cơ chất (ES). Phức hợp ES sẽ lại được chuyển hóa tiếp tục để tạo thành sản phẩm (P) và giải phóng enzyme (E). Enzyme được giải phóng lại thực hiện những phản ứng mới.

Hai nhà khoa học trên đã đưa ra mô hình chuyển hóa trong phản ứng enzyme với một cơ chất duy nhất như sau:

Trong đó: k1, k2, k3, k4: là hằng số vận tốc của các phản ứng tương ứng.

Khi nghiên cứu động học phản ứng enzyme, người ta thường xác định vận tốc ban đầu của phản ứng khi

� Lượng sản phẩm P tạo thành chưa đáng kể nên K4 là hằng số vận tốc phản ứng tạo ES từ P và E nhỏ nhất và xấp xỉ bằng 0.

� Đồng thời nồng độ cơ chất rất lớn so với nồng độ enzyme tổng [Eo]. Ngoài ra, phản ứng chuyển hóa từ ES thành E + P là phản ứng quan trọng nhất, quyết định toàn bộ quá trình chuyển hóa S thành P.

Vận tốc phản ứng ES thành P + E tỷ lệ với nồng độ ES, khi nồng độ ES càng cao thì vận tốc phản ứng càng cao nên:

Vi = k3[ES] (1)

Giả sử nồng độ enzyme ban đầu được kí hiệu là [Eo], nồng độ phức enzyme – cơ chất là [ES], nồng độ enzyme tự do khi phản ứng đạt được điểm cân bằng là [E]. Ta sẽ có:

[E] = [Eo] – [ES] (2)

Ở giai đoạn đầu của phản ứng, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng enzyme sẽ phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất. Ta có thể tính được vận tốc phản ứng trong trường hợp sau:

Vận tốc phản ứng thuận: V1 = k1[E][S] (3)

Vận tốc phản ứng nghịch: V2 = k2[ES] (4)

Vận tốc phản ứng tạo ra sản phẩm: V3 = k3[ES] (5)

Trong giai đoạn cân bằng, sự phân ly ES sẽ cân bằng với sự tạo ra ES. Khi đó vận tốc phản ứng sẽ là: V1 = V2 + V3 (6)

Thay (2, 3, 4, 5) vào (6) ta được:

k1([Eo] – [ES])[S] = (k2 + k3)[ES] (7)

Từ đó ta có: [ES] = k1[Eo][S]/(k1[S] + [k2 + k3]) (8)

Nếu chia 2 vế cho k1, thay (k2 + k3)/k1 = km (hằng số michaelis – menten) ta sẽ có:

[ES] = [Eo][S]/(km + [S]) (9)

k4 k2

k1 k3 E + S ES E + P


Khi [S] >> [Eo] tất cả enzyme đều tham gia tạo phức ES và vận tốc phản ứng Vi sẽ đạt cực đại (Vmax), ta có [ES] = [Eo]

Vận tốc cực đại: Vmax = k3[Eo] (10)

Có thể viết:

Vi/Vmax = [ES]/[Eo] = 1/(1+km/[S]) (11)

Phương trình Michaelis – Menten

Vi = Vmax[S]/(km + [S]) (12)

Hình 1.5. Phương trình Michaelis Menten

� Nếu [S]<<km: ở nồng độ cơ chất thấp, V phụ thuộc tuyến tính vào [S] � Nếu [S]>>km: vận tốc phản ứng đạt cực đại, không phụ thuộc vào [S]. Như vậy [S] đã đủ lớn đến

mức nào đó, nếu tiếp tục tăng [S], V cũng không tăng theo � Nếu [S] = km; vận tốc phản ứng bằng ½ vận tốc cực đại

Người ta dễ dàng xác định được km và Vmax bằng cách nghịch đảo cả 2 vế của phương trình michaelis – menten:

1/Vi = (km + [S])/(Vmax[S]) (13)

Phương trình này là phương trình tuyến tính có dạng y = ax + b

Nếu vẽ đồ thị, đường thẳng sẽ cắt trục tung ở 1/Vmax và cắt trục hoành ở -1/km và độ nghiêng bằng km/Vmax

Hình 1.6. Phương trình nghịch đảo của Michaelis Menten

Từ phương trình trên, ta dễ dàng xác định được vị trí Vmax, km trong thí nghiệm xác định tốc độ Vi của phản ứng enzyme với nồng độ cơ chất ban đầu khác nhau.

1.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng enzyme

1.3.5.1. Nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme. Tốc độ phản ứng enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt quá nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng enzyme sẽ giảm đến mức triệt tiêu.

Người ta thường sử dụng hệ số nhiệt Q10 để biểu thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng. Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme cao nhất được gọi là nhiệt độ tối ưu. Phần lớn enzyme hoạt


động mạnh nhất ở nhiệt độ 40 – 50oC. Nhiệt độ tối ưu của những enzyme khác nhau là hoàn toàn khác nhau. Một số enzyme khác có nhiệt độ tối ưu ở 60oC, một số khác lại có nhiệt độ tối ưu ở 70oC, thậm chí có một số enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis lại hoạt động mạnh ở 90oC

Nếu đưa nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm. Khi đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính.

Ngược lại, ở nhiệt độ 0oC enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhưng khi đưa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đều đến mức tối ưu.

Nhiệt độ tối ưu của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, kim loại, pH, các chất bảo vệ. Người ta thường sử dụng nhiệt độ để điều khiển hoạt động của enzyme và tốc độ phản ứng trong chế biến và bảo quản thực phẩm.

Hình 1.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng enzyme

1.3.5.2. pH

pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng của enzyme

Nhiều enzyme hoạt động rất mạnh ở pH trung tính. Tuy nhiên cũng có nhiều enzyme hoạt động ở pH acid yếu. Một số khác lại hoạt động mạnh ở pH kiềm và cả pH acid.

VD: một số protease hoạt động ở pH kiềm (protease kiềm), một số lại hoạt động ở pH acid (protease acid) và một số protease lại hoạt động ở pH trung tính (protease trung tính)

Người ta thường sử dụng ảnh hưởng của pH để điều hòa phản ứng trong bảo quản, chế biến lương thực, thực phẩm, trong tuyển chọn giống vi sinh vật…

Hình 1.8. Ảnh hưởng của pH đến phản ứng enzyme

1.3.5.3. Chất kìm hãm

Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là các chất có mặt trong các phản ứng enzyme, làm giảm hoạt tính của enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thay đổi tính chất hóa học, cấu tạo hóa học và tính chất vật lý của chúng.

Các chất gây kìm hãm hoạt động của các enzyme bao gồm các ion, các phân tử vô cơ, các chất hữu cơ và cả protein. Các chất kìm hãm có ý nghĩa rất lớn trong điều khiển các quá trình trao đổi ở tế bào sinh vật.

Cơ chế kìm hãm của các chất kìm hãm có thể là thuận nghịch hoặc không thuận nghịch. Trong trường hợp các chất kìm hãm thuận nghịch, phản ứng giữa enzyme và chất kìm hãm sẽ nhanh chóng đạt được trạng thái cân bằng.


Các chất kìm hãm kết hợp với enzyme bằng liên kết đồng hóa trị. Theo đó, các chất kìm hãm gắn rất chặt vào enzyme, tạo thành phức enzyme – chất kìm hãm (EI). Phức hợp này bị phân rã rất chậm. Tùy thuộc vào bản chất của chất kìm hãm mà người ta chia ra những chất kìm hãm sau:

Chất kìm hãm cạnh tranh: các chất kìm hãm cạnh là những chất có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất. Chúng thường là những chất kìm hãm thuận nghịch. Chúng có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme. Khi đó, chúng sẽ chiếm vị trí của cơ chất trong trung tâm hoạt động. Nếu chất kìm hãm đã chiến được vị trí trong trung tâm hoạt động thì cơ chất sẽ không còn cơ hội tiếp cận với trung tâm này. Cơ chế loại trừ lẫn nhau của chất kìm hãm và trung tâm làm giảm số lượng các enzyme kết hợp với cơ chất. Kết quả là hoạt động của enzyme sẽ giảm.

Vì có cấu trúc không gian giống nhau, nên các chất cạnh tranh và cơ chất đều có xu hướng chiếm vị trí trong trung tâm hoạt động. Vận tốc phản ứng lúc này phụ thuộc vào 2 yếu tố:

� Phụ thuộc vào nồng độ cơ chất và nồng độ chất canh tranh. Nếu nồng độ cơ chất đủ lớn sẽ loại trừ được hiện tượng cạnh tranh.

� Phụ thuộc vào ái lực giữa cơ chất và chất cạnh tranh với enzyme

Chất kìm hãm không cạnh tranh:

Nếu như trong cơ chế kìm hãm cạnh tranh, các chất kìm hãm chiếm trung tâm hoạt động của enzyme thì cơ chế kìm hãm không cạnh tranh, chất kìm hãm không chiếm trung tâm hoạt động của enzyme mà là ở một vị trí ngoài trung tâm hoạt động của enzyme. Kết quả sự kết hợp này, chất kìm hãm làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme theo chiều hướng bất lợi cho hoạt động xúc tác. Vì thế các chất kìm hãm làm giảm hoạt động của enzyme.

Khi chất kìm hãm không cạnh tranh kết hợp với enzyme sẽ làm vận tốc phản ứng enzyme bị giảm mặc dù quá trình này không làm thay đổi ái lực giữa enzyme và cơ chất. Mức độ kìm hãm của chất kìm hãm không cạnh tranh không phụ thuộc vào tương quan nồng độ cơ chất và chất kìm hãm. Cơ chất dù có lượng lớn bao nhiêu cũng không loại trừ được tác dụng kìm hãm của chất kìm hãm.

Các chất kìm hãm không cạnh tranh có thể là các chất sau:

1. Kìm hãm bởi sản phẩm của phản ứng: các sản phẩm của phản ứng có thể đóng vai trò như chất kìm hãm không cạnh tranh. Nếu như phản ứng xảy ra do chất A và chất B, có sự tham gia của enzyme để tạo thành sản phẩm P1 và P2 thì enzyme có ái lực với cả P1, P2 và cả chất A và B. Khi đó sản phẩm P1, P2 được xem là chất kìm hãm không cạnh tranh

2. Kìm hãm do thừa cơ chất: trong phản ứng enzyme thông thường thì: E + S <=> ES => E + P

Khi ES được tạo thành rất có thể có một cơ chất gắn với ES tạo thành ESS làm chúng không thể chuyển hóa tạo tiếp tục được để tạo sản phẩm và giải phóng enzyme tự do.

Hình 1.9. Chất kìm hãm cạnh tranh

Hình 1.10. Chất kìm hãm không cạnh tranh

1.3.5.4. Chất hoạt hóa

Các chất có tác dụng làm tăng hoạt tính của enzyme gọi là các chất hoạt hóa enzyme. Các chất hoạt hóa enzyme có bản chất hóa học rất khác nhau. Chúng có thể là những anion, các ion kim loại từ ô thứ 11 đến ô thứ 55 trong bảng hệ thống tuần hoàn, các chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp. Tuy nhiên, các chất hoạt hóa chỉ có tác dụng ở một nồng độ nhất định. Vượt quá nồng độ này, chúng sẽ gây ức chế hoạt động của enzyme

CÔNG NGHỆ ENZYME

Ở nồng độ hoạt hóa, các chất hoạkhả năng phá vỡ một số liên kết chức năng trong trung tâm hoạt đ

1.3.6. Tính chất đặc hiệu của enzyme

Tính chất đặc hiệu là biểu hiện khchất đặc hiệu rất cao. Tính chất đchất xúc tác khác.

Mỗi một loại enzyme chỉ có khảmột kiểu phản ứng nhất định. Tính ch

1. Đặc hiệu kiểu phản ứng

Tính chất đặc hiệu kiểu phản ứng bichuyển hóa nhất định trong các kithủy phân…

2. Đặc hiệu cơ chất

Khi tham gia vào các phản ứng , các lonhiên không phải cơ chất nào cũng có khenzyme. Người ta phân tích đặc hi

A – đặc hiệu tuyệt đối

Là khả năng xúc tác của enzyme đcó khả ngăng xúc tác đối với một cơ ch

B – đặc hiệu tương đối

Là khả năng xúc tác của enzyme tác d

C – đặc hiệu quang học (đặc hiệu l

Là khả năng xúc tác của enzyme đvà trans)

1.4. Phân loại enzyme

1.4.1. Danh pháp quốc tế của enzyme

Khi số lượng enzyme mới được phát hingười tìm ra nó. Dần dần, theo thấy có tính chất gần giống nhau honhững quy ước quốc tế về tên gọenzyme đó thuộc nhóm nào và bả

Theo quy ước quốc tế, tên gọi củkiểu phản ứng mà chúng tham gia. Theo đó, tên g

ạt hóa thường làm nhiệm vụ chuyển nhóm hydrogen hot trong phân tử tiền enzyme hoặc các chất có tác d

t động của enzyme

Hình 1.11. Chất hoạt hóa enzyme

a enzyme

n khả năng xúc tác của enzyme đối với cơ chất nhất đặc hiệu của enzyme cho thấy sự khác biệt rất l

ả năng xúc tác cho sự chuyển hóa một hay nhiều cơ chnh. Tính chất đặc hiệu của enzyme biểu hiệu ở một số ki

ng biểu hiện ở chỗ, mỗi enzyme chỉ có thể xúc tác cho mnh trong các kiểu phản ứng như phản ứng oxy hóa khử, phản ứ

ng , các loại cơ chất phải gắn với trung tâm hoạt đũng có khả năng tiếp cận và gắn được vào với trung tâm ho

c hiệu cơ chất theo mức độ sau:

a enzyme đối với một cơ chất nhất định. Ngoài cơ chất này ra, enzyme t cơ chất nào khác nữa.

a enzyme tác dụng lên một kiểu liên kết hóa học nhất định

u lập thể)

a enzyme đến một trong 2 dạng đồng phân quang học của cơ ch

a enzyme

c phát hiện còn ít, người ta thường gọi tên enzyme theo ý thích cn, theo thời gian, số lượng enzyme tìm ra ngày một nhiều và nhng nhau hoặc giống nhau, người ta phân loại chúng thành t

ọi enzyme để khi nghiên cứu và ứng dụng chúng ai cản chất hóa học của chúng ra sao.

ủa enzyme thường được gọi theo cơ chất đặc hiệu ctham gia. Theo đó, tên gọi của 1 enzyme thường có 2 phầ

13

n nhóm hydrogen hoạt những chất có t có tác dụng phục hồi các nhóm

ất định. Enzyme có tính t lớn giữa enzyme và các

u cơ chất nhất định theo kiểu đặc hiệu sau:

xúc tác cho một kiểu phản ứng ứng chuyển vị, phản ứng

t động của enzyme. Tuy i trung tâm hoạt động của

t này ra, enzyme này không

a cơ chất (đồng phân cis

i tên enzyme theo ý thích của từng u và những enzyme tìm ra

i chúng thành từng nhóm và đưa ra ng chúng ai cũng có thể hiểu được

u của chúng cùng với tên ần:


Phần đầu là tên cơ chất: trong trường hợp phản ứng đó là phản ứng lưỡng phân thì phần thứ nhất là tên gọi của 2 cơ chất viết cách nhau hai chấm.

Phần sau chỉ khái quá bản thân của phản ứng:

Ví dụ: enzyme urease có tên gọi hệ thống là carbanite-amideohydrolase

Các enzyme thường ở cuối tên có đuôi “…ase”

Tuy nhiên, có nhiều loại enzyme vì thói quen nên vẫn được gọi theo tên cũ, không theo hệ thống phân loại. Ví dụ như trypsin, chimotrypsin, pepsin…

1.4.2. Phân loại enzyme

Năm 1960, hiệp hội hóa sinh quốc tế (IUB) đã thống nhất phân loại enzyme ra làm 6 lớp và được đánh số thứ tự từ 1 đến 6. Các số thứ tự này là cố định cho mỗi lớp. Mỗi lớp lại chia ra làm nhiều tổ, mỗi tổ lại chia ra làm nhiều nhóm, chính vì thế, theo hệ thống phân loại, mỗi enzyme thường có 4 chữa số: số thứ nhất chỉ lớp, số thứ 2 chỉ tổ, số thứ 3 chỉ nhóm, số thứ 4 chỉ enzyme

1. Oxydoreductase: các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử

2. Transpherase: các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị

3. Hydrolase: các enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân

4. Liase: các enzyme xúc tác cho phản ứng phân cắt không cần nước, loại nước tạo thành liên kết đôi hoặc kết hợp phân tử nước vào liên kết đôi

5. Isomerase: các enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa

6. Ligase: các enzyme xúc tác cho phản ứng tổng hợp có sử dụng liên kết giàu năng lượng của ATP…

1.4.2.1. Oxydoreductase

Đây là enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử. Các enzyme này là những enzyme phức tạp. Chúng bao gồm 2 thành phần. Phần coenzyme của chúng là NAD+, NADP+, FMN, FAD, heme…. Lớp enzyme này được phân hóa thành những nhóm sau:

A- Dehydrogenase: nhóm này tham gia vào các phản ứng tách H trực tiếp từ cơ chất và chuyển chúng đến NAD+, NADP+, FMN, FAD.

Các dehyrogenase xúc tác cho giai đoạn đầu của chuỗi hô hấp, vận chuyển đồng thời cả proton và electron. Ngoài ra, chúng còn tham gia xúc tác cho chiều ngược lại, chuyển H từ NADH+H+ hoặc NADPH+H+, FMNH2, FAD-H2 đến cơ chất và khử cơ chất. Đây là những phản ứng đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình tổng hợp

B – Oxydase: đây là phản ứng xúc tác cho quá trình chuyển electron đến oxy. Chúng hoạt hóa oxy làm cho chúng có khả năng kết hợp với proton có trong môi trường. Lớp enzyme này tác dụng trực tiếp với oxy

C – Oxygenase: đây là enzyme xúc tác cho phản ứng kết hợp trực tiếp oxy vào phân tử của hợp chất hữu cơ có vòng thơm

Nhóm này có 2 loại, oxygenase và hydroxylase, oxygenase xúc tác cho phản ứng kết hợp toàn bộ phân tử oxy. Hydrogenase xúc tác cho phản ứng kết hợp một nửa phân tử oxy (thường ở dạng OH) vào hợp chất hữu cơ

D – Peroxydase: đây là enzyme có coenzyme là heme, xúc tác cho phản ứng oxy hóa các hợp chất hữu cơ khi có H2O2

1.4.2.2. Transpherase

Transpherase cũng thuộc lớp enzyme phức tạp. Coenzyme của transpherase có bản chất hóa học rất khác nhau tùy theo vào bản chất của nhóm được chuyển vị. Lớp transpherase bao gồm những enzyme tiêu biểu sau:

A – acyltranspherase: enzyme này tham gia chuyển hóa nhóm acyl thông qua coenzyme A, tạo thành phức CoAS-acyl. Khi đó, nhóm carboxyl của acid kết hợp với nhóm –SH của coenzyme A tạo thành liên


kết thioester giàu năng lượng. Các enzyme này có vai trò quan trọng trong chuyển hóa lipid và phân giải glucose

Glucosyltransferase: enzyme này tham gia xúc tác cho phản ứng vận chuyển đường hexose, pentose từ chất cho đến chất nhận khác nhau, thường gặp nhất là nhóm OH của một gốc saccharide khác hoặc của gốc phosphate, nguyên tử nitrogen của nhân vòng.

Ngoài ra, enzyme này cũng tham gia xúc tác cho quá trình tạo cấu trúc phân nhánh trong phân tử glycogen, amylopectin

Phosphotransferase: enzyme này tham gia xúc tác chuyển hóa gốc phosphoryl. Trong phản ứng này thường có sự tham gia của ATP với ý nghĩa như một chất cho. Gốc phosphate được chuyển từ ATP đến nhóm hydroxyl của alcohol hay saccharide

1.4.2.3. Hydrolase

Hydrolase tham gia xúc tác cho các quá trình thủy phân. Chính vì thế, nước là thành phần không thể thiếu được của những phản ứng do enzyme này tham gia. Có rất nhiều enzyme thuộc lớp enzyme này như:

A – peptide hydrolase: enzyme này tham gia xúc tác phản ứng thủy phân peptide, tạo thành những phân tử thấp và các amino acid.

Các enzyme peptide hydrolase thủy phân các liên kết peptide ở giữa chuỗi peptide gọi là endopeptide hydrolase hay proteinase. Đại diện cho endopeptide hydrolase là pepsin, trypsin, chymotrypsin. Các enzyme peptide hydrolase thủy phân các liên kết peptide ở đầu chuỗi peptide gọi là exo peptide hydrolase hay peptidase

Năm 1960, Hartley chia proteinase ra làm 4 nhóm chính:

� Proteinase serine: trong enzyme này, gốc serine đóng vai trò xúc tác ở trung tâm hoạt động. Nhóm này bao gồm trypsin, chymotrypsin, elastase, các proteinase làm đông máu, acrosin

� Proteinase thiol: trong trung tâm hoạt động có nhóm –SH trực tiếp tham gia phản ứng, bao gồm papain, bromelin, ficin

� Proteinase kim loại: trong trung tâm hoạt động, kim loại có đóng vai trò quan trọng trong xúc tác � Proteinase acid (aspartic proteinase): trong trung tâm hoạt động có nhóm gammar carboxyl

B – lipase: enzyme này tham gia quá trình xúc tác cho phản ứng thủy phân triglycerol (dầu thực vật và mỡ động vật) tạo thành acid béo tự do và glycerol. Chúng xúc tác phản ứng thủy phân lần lượt từng liên kết chứ không phải cắt đứt cả 3 liên kết ester cùng một lúc.

1.4.2.4. Lipase

Pyruvate decarboxylase: enzyme này tham gia xúc tác cho phản ứng loại CO2 ra khỏi phân tử pyruvic acid, tạo thành aldehyde tương ứng là acetaldehyde. Đây là phản ứng quan trọng trong lên men rượu. Enzyme này là enzyme đa cấu tử, coenzyme của chúng ta là thiamipiro phosphate

Fumarate hydrolase: enzyme này là xúc tác cho phản ứng tách thuận nghịch phân tử nước khỏi malic acid tạo thành fumaric acid (acid có một nối đôi)

1.4.2.5. Isomerase

Enzyme này xúc tác cho phản ứng chuyển hóa tương hỗ phức tạp giữa galactose và glucose. NAD+ trong enzyme này tham gia trực tiếp trong phản ứng.

1.4.2.6. Ligase

Enzyme này tham gia xúc tác cho phản ứng carboxyl hóa pyruvic acid, tạo thành oxaloacetic acid. Chúng cần acetyl-coA và Mg2+ cho phản ứng xúc tác. Biotin là chất mang CO2 đã hoạt hóa và chuyển thành acid pyruvic

1.5. Phương pháp tách và làm sạch enzyme

1.5.1. Các phương pháp phá vỡ tế bào

Enzyme là loại protein được tạo thành trong tế bào, phần lớn chúng tồn tại trong tế bào. Các enzyme này thường không có khả năng di chuyển qua màng sinh học. Do đó, việc tách chúng ra khỏi tế bào là diều rất khó khăn.


Để thu nhận enzyme nội bào, người ta phải phá vỡ tế bào bằng nhiều phương pháp. Các phương pháp phá vỡ tế bào thường sử dụng như:

1. Phương pháp cơ học: nghiền bi, nghiền có chất trợ nghiền như bột thủy tinh, cát thạch anh, đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa…

2. Phương pháp vật lý: dùng sóng siêu âm

3. Phương pháp hóa học: dùng các loại dung môi, butylic, acetone, glycerol, ethylacetate.

Có 3 khó khăn trong khi tách enzyme khỏi tế bào cần phải hết sức lưu ý:

� Enzyme có trong tế bào sinh vật với lượng không lớn so với các thành phần khác. Do đó, việc tách để thu nhận thành phần nhỏ này là điều rất khó.

� Enzyme là chất hữu cơ không bền, chúng rất dễ bị biến tính khi bị tác động của các yếu tố bên ngoài. � Enzyme là protein. Protein enzyme luôn luôn đi cùng những loại protein không phải enzyme nhưng

lại có tính chất hóa lý rất giống protein enzyme. Do đó, việc tách protein enzyme ra khỏi các loại protein không phải lúc nào cũng đạt được kết quả tốt và không phải không gặp những khó khăn nhất định

1.5.2. Phương pháp gây biến tính chọn lọc

Sau khi phá vỡ tế bào, người ta thường sử dụng nước, dung dịch đệm, dung dịch muối trung tính để tách enzyme ra khỏi sinh khối đã xử lý theo những phương pháp trên. Dịch chiết thu được người ta gọi là chế phẩm enzyme thô. sở di gọi là chế phẩm enzyme thô vì trong chế phẩm này ngoài enzyme còn có nước, protein không phải enzyme các thành phần của tế bào.

Như vậy việc làm sạch enzyme chính là việc loại các protein không phải là enzyme (đôi khi loại bỏ cả các protein – enzyme không mong muốn), nước, các thành phần khác của tế bào khỏi enzyme. Công việc này hoàn toàn không dễ dàng. Do đó, việc làm sạch enzyme đòi hỏi người làm nghiên cứu về enzyme, ngoài sự hiểu biết về enzyme ra còn phải nắm vững rất nhiều thao tác kỹ thuật khác nhau để tránh gây mất tính hoạt động của enzyme.

Để loại bỏ những thành phần không phải là enzyme ta đang cần, người ta thực hiện một số phương pháp sau:

1. Phương pháp gây biến tính chọn lọc: phương pháp này dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH làm biến tính chọn lọc các loại protein tạp. Phương pháp này chỉ thích hợp với enzyme chịu aicd và bền nhiệt. Người ta đưa nhiệt độ của dung dịch enzyme lên 50 – 70oC và pH < 5. ở điều kiện này những enzyme không bền nhiệt và không chịu được pH thấp sẽ bị biến tính. Sau đó bằng phương pháp ly tâm hoặc phương pháp lọc để loại bỏ các thành phần không phải enzyme mà ta mong muốn.

2. Phương pháp kết tủa phân đoạn: dựa trên cơ sở về khả năng kết tủa của các enzyme ở nồng độ muối khác nhau, người ta thường sử dụng (NH4)2SO4 để kết tủa phân đoạn enzyme. Bằng cách này, người ta được một số protein tạp ở giai đoạn đầu của quá trình làm sạch enzyme. Ngoài muối (NH4)2SO4 ra, người ta còn sử dụng một số dung môi hữu cơ để kết tủa enzyme. Phương pháp kết tủa này thường làm biến tính rất nhanh. Vì thế trước khi tiến hành kết tủa, người ta tiến hành làm lạnh các chất kết tủa và cả dung dịch enzyme

3. Phương pháp hấp thụ chọn lọc: người ta có thể hấp thụ trực tiếp vào dung dịch enzyme, hoặc cho dung dịch enzyme chảy qua một cột, trong cột có chứa chất hấp thụ. Chất hấp thụ được sử dụng rộng rãi là hydrocyapatite. Người ta có thể thực hiện một trong hai cách sau: hoặc là hấp thụ enzyme hoặc là hấp thụ protein tạp. Để tránh làm biến tính enzyme, người ta thường thực hiện quá trình hấp thụ ở nhiệt độ 0oC. Sau khi hấp thụ người ta lại tiến hành quá trình chiết enzyme (quá trình phản hấp thụ) bằng dung môi thích hợp.

4. Phương pháp sắc ký: dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi giữa protein tan trong nước và tác nhân trao đổi ion, người ta áp dụng phương pháp người ta sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion để làm sạch enzyme. Người ta thường sử dụng tác nhân trao đổi ion sau:

� Nhựa trao đổi ion � Dẫn xuất ester của cellulose như carboxymethyl-cellulose, diethylamino-ethyl-cellulose (DEAE-

cellulose), triethylamino-ethyl-cellulose


Người ta thường sử dụng DEAE –cellulose hơn cả. Ưu điểm của DEAE-cellulose là ngoài tạp chất protein, các loại nucleic acid đều được loại khỏi enzyme.

� Sephadex là dẫn xuất của polysaccharide dextran. Trong chất này các phân tử của chúng thường liên kết với nhau bởi các liên kết ngang nhờ tác dụng của epichohydrin, tạo thành “sàng phân tử”. Số lượng liên kết ngang càng nhiều, kích thước sàng phân tử càng nhỏ.

Khi tiến hành lọc, các chất phân tử có kính thước nhỏ sẽ khuếch tán vào bên trong các hạt sephadex đã được ngâm trong dung dịch đệm. Các phân tử có kích thước lớn hơn không có khả năng đi vào hạt sẽ được chiết nhanh ra khỏi cột. phương pháp này được ứng dụng rộng rãi trong kỹ thuật enzyme.

Hiện nay, chưa có một phương pháp chuẩn nào thật sự hiệu quả trong việc làm sạch enzyme. Do đó, việc làm sạch enzyme chỉ thật sự có hiệu quả khi ta biết lựa chọn các phương pháp riêng, kết hợp với nhau, tạo ra một hệ thống nối tiếp nhau một cách hài hòa nhất.

1.6. Phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme

1.6.1. Các nhóm phương pháp xác định khả năng xúc tác của E

Người ta xác định khả năng xúc tác của enzyme thông qua việc xác định hoạt độ hoạt động của enzyme. Người ta cũng không thể định lượng enzyme trực tiếp mà phải xác định gián tiếp thông qua hoạt độ hoạt động của chúng hoặc thông qua khả năng làm giảm cơ chất sau một thời gian phản ứng.

Hiện nay, nhiều phòng thí nghiệm sử dụng một trong 3 nhóm phương pháp sau để xác định khả năng xúc tác của enzyme:

� Tiến hành đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành sau một thời gian nhất định và lượng enzyme đã xác định trước. phương pháp này được áp dụng rộng rãi và đã được xác định là tương đối chính xác.

� Tiến hành xác định thời gian cần thiết để thu nhận được một lượng biến đổi nhất định của lượng cơ chất hay lượng sản phẩm tương ứng với một lượng enzyme nhất định

� Tiến hành chọn nồng độ enzyme cần thiết để trong một thời gian nhất định sẽ thu được sự biến đổi nhất định về cơ chất hay về sản phẩm.

Bảng 1.3. Các nhóm phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme [2]

Phương pháp Các thông số cố định Các thông số thay đổi

1 Thời gian Nồng độ enzyme

Lượng cơ chất và sản phẩm

2 Lượng cơ chất hay sản phẩm Nồng độ enzyme

Thời gian

3 Thời gian Lượng cơ chất hay sản phẩm

Nồng độ enzyme

1.6.2. Đơn vị hoạt độ

Khả năng xúc tác của enzyme được xác định thông qua hoạt độ hoạt động của enzyme. Hoạt độ hoạt động của enzyme được xác định thông qua đơn vị hoạt độ. Người ta biểu diễn đơn vị hoạt độ qua những đơn vị sau:

a - đơn vị hoạt độ quốc tế (UI): đơn vị hoạt độ quốc tế là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 micromol cơ chất trong 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn

b - katal (kat): đơn vị kat là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa được 1mol cơ chất sau 1 giây ở điều kiện tiêu chuẩn

1UI = 16,67nano kat (nkat)


c - hoạt độ riêng: hoạt độ riêng của một chế phẩm enzyme là số đơn vị UI (hoặc một đơn vị katal) ứng với 1 ml dung dịch (nếu là dung dịch) hoặc 1mg protein (nếu là bột khô) của chế phẩm enzyme. Khi biết được khối lượng phân tử của enzyme ta hoàn toàn có thể tính được hoạt độ riêng của phân tử.

d - hoạt độ riêng của phân tử: hoạt độ riêng của phân tử enzyme là số phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi một phân tử enzyme trong một đơn vị thời gian.

Việc xác định hoạt độ của enzyme thường được các nhà khoa học đưa ra những phương pháp rất cụ thể cho từng loại enzyme, ứng với từng loại cơ chất. Tuy nhiên, khi tiến hành xác định hoạt độ của enzyme cần lưu ý những điểm cơ bản sau:

� Khi tiến hành xác định hoạt độ của enzyme cần phải cho lượng cơ chất trong một giới hạn thích hợp đủ thừa để bão hòa enzyme. Lượng cơ chất cho vào không được quá nhiều. Nếu lượng cơ chất quá nhiều sẽ gây ức chế hoạt động của enzyme

� Đối với những enzyme dễ mất hoạt tính cần phải có chất hoạt hóa hoặc làm bền enzyme, thì cần phải cho những chất này vào trước khi cho cơ chất vào để thực hiện phản ứng.

� Khi xác định hoạt độ enzyme cần chú ý phải thực hiện trong điều kiện pH cố định và thích hợp với hoạt động tối ưu của enzyme nghiên cứu. pH thường thay đổi tùy thuộc vào cơ chất và dung dịch đệm

� Khi xác định hoạt độ enzyme cần lưu ý đến nhiệt độ. Các nhà khoa học cho rằng không nên xác định hoạt độ enzyme ở nhiệt độ tối ưu của enzyme mà ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ tối ưu đó một ít để tránh khả năng làm biến tính enzyme khi có sự biến động về nhiệt độ

� Thời gian xác định hoạt độ enzyme chỉ nên kéo dài khoảng 5 - 10 phút, không nên kéo dài quá, dễ gây giảm hoạt độ của enzyme. Tuy nhiên, cũng có những trường hợp kéo dài đến 24 giờ đối với những enzyme có khả năng hoạt động yếu. Trong trường hợp phải kéo dài thời gian, cần thiết phải cho chất ức chế hoạt động hoặc tiêu diệt vi sinh vật

Ngoài ra, hiện nay trên thế giới có rất nhiều cách biểu thị đơn vị hoạt độ của enzyme như:

MWU – đơn vị biểu thị lượng enzyme cần thiết chuyển hóa một mg tinh bột hòa tan đến dextrin trong 30 phút ở điều kiện thí nghiệm;

SKB – là lượng enzyme cần thiết để dextrin hóa 1g beta-dextrin giới hạn để kích thước xác định sau 1 giờ ở điều kiện thí nghiệm

2. KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG CÔNG NGHỆ ENZYME

2.1. Ý nghĩa của kỹ thuật tinh sạch trong công nghệ enzyme

Công nghệ enzyme được bắt đầu từ giai đoạn sản xuất chế phẩm enzyme thô và kết thúc ở giai đoạn tạo thành chế phẩm tinh khiết.

Bắt đầu từ chế phẩm enzyme thô, người ta tiến hành tinh sạch enzyme bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Các kỹ thuật tinh sạch thường đưa đến những kết quả quan trọng như sau:

Khối lượng chế phẩm enzyme sẽ được giảm dần qua từng bước tinh sạch. Chế phẩm enzyme thô thường chứa những thành phần cơ bản sau:

� Nước chiếm khối lượng lớn nhất � Protein không có hoạt tính sinh học � Các tạp chất từ tế bào (nếu là nguồn động vật và thực vật), môi trường nuôi cấy (nếu là nguồn từ vsv) � Enzyme (hay protein có hoạt tính sinh học)

Như vậy, quá trình tinh sạch là quá trình loại bỏ ba phần trên, chỉ nhận sản phẩm cuối là protein có hoạt tính sinh học. Việc loại bỏ thành phần đầu không thể thực hiện trong một giai đoạn mà phải thực hiện qua nhiều giai đoạn khác nhau, ở mỗi giai đoạn ta sẽ loại bỏ được một phần không phải là enzyme ra khỏi hỗn hợp. Khi các thành phần không phải là enzyme được loại dần ra, khối lượng chế phẩm sẽ giảm theo.

Như vậy, nếu enzyme được tinh sạch theo những kỹ thuật khác nhau sẽ thu nhận những giá trị quan trọng sau:

� Giảm khối lượng. Trị số này có nghĩa cho việc đóng bao bì, vận chuyển, sử dụng và bảo quản. � Tăng được hoạt tính enzyme có ý nghĩa rất lớn trong quá trình sử dụng sau này. � Tăng giá trị kinh tế thông qua giá thành sản phẩm

Để giải quyết được trong những mục tiêu trên, ta thực hiện những kỹ thuật cơ bản sau:


2.2. Kỹ thuật cơ bản

2.2.1. Các phương pháp cơ học tách enzyme

Các phương pháp cơ học được ứng dụng nhiều để tách enzyme khỏi tế bào và các thành phần khác gồm 2 phương pháp:

� Phương pháp ly tâm: ly tâm là tách vật chất rắn ra khỏi dung dịch. Trong công nghệ enzyme, phương pháp ly tâm thường được ứng dụng khá rộng rãi để thu nhận dung dịch enzyme, dung dịch này chứa các enzyme ngoại bào. Enzyme nội bào nằm trong tế bào sinh vật muốn thu nhận enzyme nội bào ta cần phải tiến hành phá vỡ tế bào.

Phần lớn enzyme ngoại bào là enzyme hòa tan. Như vậy khi tiến hành ly tâm, dung dịch được tách khỏi các thành phần rắn là dung idjch enzyme thô. Dung dịch enzyme thô này còn chứa thành phần sau:

� Protein có hoạt tính sinh học � Các chất hòa tan khác � Nước

Phương pháp ly tâm chỉ tách được thành phần rắn có tỷ trọng lớn hơn dung dịch. Dịch thu được chưa phải là chế phẩm enzyme tinh khiết mà là chế phẩm enzyme thô, vì còn chứa protein không hoạt động, nước và các chất hòa tan khác.

Để tránh hiện tượng biến tính của enzyme, trong những mẫu nghiên cứu, người ta thường tiến hành ly tâm lạnh, còn trong sản xuất theo quy mô công nghiệp, người ta thường tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp.

Trong quy mô công nghiệp, người ta thường tiến hành ly tâm thu nhận dung dịch enzyme bằng máy ly tâm liên tục. Phương pháp ly tâm liên tục có những ưu điểm là thời gian thu nhận sản phẩm nhanh, liên tục và không gây ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzyme.

� Phương pháp lọc: trong công nghệ enzyme, sau khi phá vỡ thành tế bào sinh vật hay sau khi lên men, người ta thường sử dụng quá trình lọc để thu nhận dung dịch enzyme nội bào, enzyme ngoại bào hòa tan.

Lọc cũng là phương pháp tách thành phần rắn ra khỏi dung dịch. Lọc là một phương pháp khi thực hiện thường gặp nhiều khó khăn như kích thước vật chất dưới tế bào thường rất nhỏ và độ nhớt của dung dịch thường rất cao. Cả hai yếu tố này đều làm cản trở quá trình lọc. Tốc độ lọc phụ thuộc rất lớn vào: diện tích bề mặt vật liệu lọc, áp suất khi lọc, độ nhớt dịch lọc…

Trong công nghiệp sản xuất enzyme, người ta thường sử dụng các kiểu sau:

� Lọc ép: thường được sử dụng trong trường hợp dung dịch cần lọc có khối lượng nhỏ. Phương pháp này sử dụng để lọc enzyme rất có hiệu quả.

� Lọc chân không: là phương pháp được ứng dụng nhiều nhất trong nghiên cứu và trong sản xuất các sản phẩm sinh học có hoạt tính. Trong đó lọc chân không quay được sử dụng nhiều hơn cả.

� Lọc theo dòng chảy cắt ngang: trong những năm gần đây, nhiều nhà máy sản xuất enzyme sử dụng phương pháp lọc theo dòng chảy cắt ngang. Theo đó, dòng dung dịch lọc sẽ chảy song song bề mặt nguyên liệu lọc. Phần lọc sẽ được thoát qua vật liệu lọc và đi xuống phía dưới. Phương pháp này có ưu điểm là làm giảm sức đề kháng quá trình lọc của vật liệu rắn.

� Lọc thông thường: phương pháp lọc thông thường đã có từ rất lâu, hiện nay, ở một số nhà máy vẫn còn sử dụng. Phương pháp này dần được thay bằng phương pháp khác nhanh hơn, có hiệu quả hơn.

2.2.2. Các phương pháp phá vỡ tế bào sinh vật

Mục đích của việc phá vỡ tế bào là giải phóng toàn bộ các chất có trong tế bào. Cùng với các chất có trong tế bào được giải phóng ra ngoài là enzyme nội bào.

Đối với tế bào động vật và tế bào thực vật ta phải tiến hành nghiền nát trước khi thực hiện các quá trình trích ly, lọc, cô đặc, làm sạch và sấy

Đối với tế bào vsv phải tiến hành tách bằng phương pháp ly tâm hoặc bằng phương pháp lọc. Phần dịch lọc thu được của một trong hai phương pháp này là dịch chế phẩm enzyme ngoại bào. Phần sinh khối vsv sau khi ly tâm hoặc lọc chứa enzyme nội bào. Việc phá vỡ tế bào động vật và thực vật không mấy khó


khăn nhưng phá vỡ tế bào vsv rất phức tạp vì tế bào vsv vừa có kích thước nhỏ, vừa có thành tế bào có cấu trúc khá đặc trưng. Do đó, phá vỡ tế bào vsv đòi hỏi phải có những phương pháp đặc biệt.

2.2.2.1. Phá vỡ tế bào bằng phương pháp cơ học:

Mục đích của phá vỡ tế bào là giải phóng các chất có trong tế bào và đảm bảo được hoạt tính của enzyme nội bào.

� Đối với tế bào động vật (thường sử dụng toàn bộ cơ quan hay mô bào) có chứa enzyme và cần phải được trữ ở nhiệt độ thấp để tránh mất hoạt tính enzyme. Trước khi trữ lạnh cần loại bỏ mỡ hoạt các thành phần khác bám theo mô bào đó, mẫ cần được xử lý nhanh và phải được thu nhận enzyme trong thời gian không quá 4 giờ kể từ khi giết mổ.

� Đối với tế bào và mô thực vật cũng cần phải được làm sạch và được trữ lạnh nếu chưa tiến hành thu nhận enzyme ngay.

� Tế bào động vật và thực vật thường rất dễ phá vỡ bằng các phương pháp cơ học. Riêng đối với tế bào vsv, việc phá vỡ tế bào gặp phải khó khăn nhất định: � Thứ nhất: tế bào vsv có kích thước quá nhỏ, việc phá vỡ tế bào bằng phương pháp nghiền nếu

không có chất trợ nghiền sẽ không có hiệu quả. � Thứ hai: vsv là cơ thể đơn bào, khi phát triển trong môi trường (đb là mt lỏng) có nhiều cơ chất

thủy phân, chúng sẽ tạo ra nhiều enzyme ngoại bào tương ứng. Các enzyme ngoại bào này hòa han trong mt và dễ dàng tách chúng ra khỏi dung dịch nuôi cấy. Do đó trong công nghiệp, trừ trường hợp phải thu nhận enzyme nội bào người ta mới tiến hành nghiền tế bào ở vsv

Phương pháp đồng hóa áp lực cao: là phương pháp được ứng dụng rộng rãi nhất để phá vỡ tế bào vsv. Huyền phù tb vsv sẽ được nén với một áp suất cao, chúng va chạm rất mạnh vào vành ống. Tb bị phá vỡ bởi lực cắt và sức nén.

Phương pháp nghiền ẩm: là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất enzyme. Trong quá trình nghiền, người ta sử dụng những viên bi thủy tinh có kích thước 0,2 – 1mm để tăng quá trình phá vỡ tế bào. Trong nhiều trường hợp, người ta không dùng viên bi thủy tinh mà người ta dùng hạt thủy tinh vì hạt thủy tinh có độ ma sát cao hơn

2.2.2.2. Phá vỡ tế bào bằng phương pháp không phải cơ học:

Ngoài 2 phương pháp cơ học trên, người ta còn phá vỡ tế bào bằng phương pháp sau:

Phương pháp hóa học: dựa vào khả năng tạo ra áp suất thẩm thấu mạnh, hoặc khả năng oxy hóa mạnh của các chất hóa học để phá vỡ thành tế bào. Phương pháp này không đòi hỏi áp suất cao, nên ít chi phí và dễ thực hiện. Tuy nhiên, vì trong quá trình thực hiện, người ta sử dụng hóa chất nên các hóa chất này thường lẫn vào trong hỗn hợp, đòi hỏi quá trình tách rất phức tạp. Một trong những hóa chất sử dụng nhiều là acetone

Phương pháp vật lý: là sử dụng siêu âm, thường được sử dụng trong quy mô ptn chưa sử dụng trong công nghiệp. Phương pháp vật lý là tạo shock nhiệt hoặc shock thẩm thấu. Nguyên tắc của phương pháp này là khi đưa nhiệt độ của huyền phù tb xuống nhiệt độ rất thấp, ngay lập tức nâng nhiệt lên 40oC khi đó thành tế bào sẽ bị phá vỡ và người ta thu được huyền phù tế bào vỡ. Phương pháp này thường dễ thực hiện, đảm bảo được hoạt tính của enzyme nhưng hiệu suất phá vỡ tế bào không cao.

Phương pháp sinh học: có 2 phương pháp hiện đang được sử dụng rộng rãi là phương pháp tự phân và phương pháp thủy phân bằng enzyme đưa từ bên ngoài vào.

Phương pháp tự phân là tạo điều kiện tối ưu cho một số enzyme có khả năng phân giải một số thành phần của thành tế bào, các enzyme này phải là những enzyme có trong tb và là của tb đó. Bình thường các enzyme này không hoạt hoạt động mạnh, nhưng nếu điều kiện nhiệt độ, pH, nước ở bên ngoài tb mà trùng với mức độ hoạt độ tối ưu của chúng, thì chúng sẽ hoạt động mạnh và thủy phân thành tế bào, làm chết tế bào.

Tự phân là quá trình được áp dụng nhiều trong phá vỡ thành tế bào các loại nấm men. Người ta thường tiến hành tự phân huyền phù tế bào nấm men ở nhiệt độ 48 – 52oC trong khoảng thời gian 6 – 24 giờ. Phương pháp này có nhiều nhược điểm vì trong quá trình thủy phân, các enzyme có trong tế bào không chỉ thủy phân các chất ở thành tế bào mà cả những chất có trong tế bào, thậm chí enzyme cũng bị phá hủy. Phương pháp này hiện không được sử dụng nhiều trong công nghiệp.


2.2.2.3. Các phương pháp cô đặc

Dung dịch enzyme thô thường chứa lượng enzyme không nhiều. Để xử lý mọt khối lớn dung dịch enzyme phải tốn ít nhiều công sức chi phí cho xử lý này rất cao. Mặt khác lượng enzyme có trong dịch enzyme thô quá ít, hoạt tính enzyme không cao. Chính vì thế phải cô đặc dung dịch enzyme nhằm mục đích:

� Làm tăng hoạt tính của enzyme � Làm giảm chi phí và công sức cho việc xử lý sau này � Tăng khả năng bảo quản enzyme � Giảm chi phí vận chuyển, bảo quản � Tăng hiệu suất tác động của enzyme đối với cơ chất

Để đạt được mục đích đó, người ta tiến hành cô đặc enzyme bằng phương pháp sau:

Phương pháp nhiệt: sử dụng nhiệt để cô đặc enzyme thường khó khăn vì enzyme là protein rất nhạy cảm với nhiệt độ. Quá trình cô đặc nhiệt là quá trình làm bốc hơi nước, làm cho lượng nước trong dung dịch giảm đi, hàm lượng enzyme trong dung dịch sẽ tăng lên, hoạt tính enzyme cũng tăng cao. Tuy nhiên phải chú ý đến điều kiện nhiệt độ để khống chế nó trong một khoảng cho phép thì hoạt tính enzyme mới được bảo toàn.

Phương pháp kết tủa: enzyme là một phức hợp protein có khả năng kết tủa với một số dung môi

� Kết tủa bằng muối: muối nồng độ cao có thể tác dụng với phân tử nước bao quanh protein enzyme và làm chuyển hóa điện tích, làm thay đổi tính hòa tan của enzyme. Trong công nghiệp thường sử dụng muối ammonium sulfate. Nhiệt độ tiến hành kết tủa: 35 – 40oC, nồng độ muốn: 20 – 80%

� Kết tủa bằng dung môi hữu cơ: dung môi hữu cơ có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng hòa tan của enzyme, ảnh hưởng solvat hóa của phân tử nước xung quanh phân tử enzyme bị thay đổi, tương tác giữa các phân tử enzyme sẽ tăng lên. Trong công nghiệp sản xuất enzyme người ta thường sử dụng ethanol và acetone để kết tủa enzyme. Nhiệt độ kết tủa: 3 – 10oC, tỷ lệ và nồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme được xác định bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch enzyme.

� Kết tủa enzyme ở điểm đẳng điện: protein là chất lưỡng cực. Mức độ hòa tan của enzyme phụ thuộc vào pH. Kết tủa enzyme ở điểm đẳng điện thường thực hiện ở quy mô nhỏ. Thời gian tạo điểm đẳng điện và thời gian lưu để tạo kết tủa bền vững thường làm thay đổi hoạt tính enzyme.

Phương pháp siêu lọc: là phương pháp sử dụng màng lọc có lỗ lọc siêu nhỏ. Được sử dụng rộng rãi để thu nhận các chất có khối lượng phân tử trong khoảng 1000 – 300.000Da. Người ta thường sử dụng cellulose acetate và các polymer hữu cơ như: poly sulfone, polyvinylidene và polypropylene làm nguyên liệu màng lọc.

2.2.2.4. Các phương pháp tinh sạch enzyme

Có 3 phương pháp tinh sạch enzyme chính:

� Phương pháp kết tinh � Phương pháp điện di � Phương pháp sắc ký

� Sắc ký lọc gel � Sắc ký trao đổi ion � Sắc kí ái lực

2.2.2.5. Tạo sản phẩm enzyme

Sau khi được làm sạch, người ta tiến hành thực hiện giai đoạn cuối cùng là tạo sản phẩm, đóng bao. Chế phẩm enzyme có thể được tạo thành các loại sản phẩm sau: enzyme dạng dung dịch, enzyme dạng huyền phù, enzyme dạng bột khô, enzyme dạng viên nhỏ

Enzyme dạng dung dịch hay ở dạng huyền phù: có nhược điểm là rất khó bảo quản. do đó người ta thường đưa chúng vào dung dịch các chất bảo quản. mặt khác khi sử dụng người ta cũng phải giữ nó trong điều kiện nhiệt độ nhất định, không được bảo quản ở nhiệt độ cao

Enzyme ở dạng bột khô hoặc ở dạng viên nhỏ: thường dễ dàng bảo quản và khả năng bảo quản rất lâu. ngoài ra, các chế phẩm enzyme này thường dễ vận chuyển.


3. ENZYME CỐ ĐỊNH

3.1. Chuyển hóa sinh học

Quá trình chuyển hóa sinh học là quá trình vật chất trong tự nhiên được sinh vật chuyển từ dạng này sang dạng khác thông qua hoạt động sống của tế bào. Hoạt động sống của tế bào là quá trình trao đổi chất giữa bên ngoài và bên trong tế bào thông qua hoạt động của enzyme và của tế bào.

Nhờ hoạt động xúc tác của enzyme tạo cho tế bào sinh vật và cơ thể sinh vật như một hệ thống mở. Ở đó năng lượng chứa trong vật chất luôn luôn được biến đổi, luôn luôn được trao đổi giữa bên trong và bên ngoài cơ thể.

Toàn bộ chuyển hóa sinh học được thực hiện bởi 4 quá trình sau:

� Quá trình hoạt động của enzyme ngoại bào (enzyme tự do) � Quá trình hoạt động của các vi sinh vật trong quá trình lên men. � Quá trình hoạt động của tế bào cố định � Quá trình chuyển hóa của enzyme cố định

3.1.1. Chuyển hóa vật chất do enzyme tự do hay enzyme hòa tan

Enzyme tự do hay enzyme được tách khỏi tế bào, chúng có khả năng hòa tan trong môi trường nước và thực hiện các phản ứng ngoài tế bào sinh vật. Những enzyme này còn được gọi là enzyme ngoại bào. Các enzyme này đóng vai trò rất quan trọng trong sự chuyển hóa vật chất ngoài thiên nhiên và cả trong sản xuất và đời sống. Tuy nhiên, khi sử dụng các enzyme này, các nhà khoa học cũng cho thấy chúng có những nhược điểm sau:

� Trong quá trình tham gia phản ứng, các loại enzyme này thường lẫn vào sản phẩm. Việc tách sản phẩm cuối ra khỏi enzyme hòa tan là một công việc rất khó khăn và đòi hỏi chi phí không nhỏ. Nhiều sản phẩm của quá trình thủy phân đòi hỏi không được chứa tạp chất và các thành phần khác như enzyme. Ví dụ như trong sản xuất glucose sử dụng trong y học phải tuyệt đối sạch cả về phương diện hóa học và về sinh học.

� Sau phản ứng, nếu tách được enzyme ra khỏi phản ứng để thực hiện các phản ứng tiếp theo, enzyme sẽ không giữ được hoạt tính như hoạt tính ban đầu, như vậy việc tái sử dụng enzyme sẽ không có hiệu quả, trong nhiều trường hợp enzyme này không sử dụng được nữa.

Các enzyme hòa tan thường kém bền nhiệt, acid, kiềm, dung môi hữu cơ hay một số ion kim loại nặng. Do đó, việc sử dụng các biện pháp bảo vệ chúng trong phản ứng là điều rất cần thiết

3.1.2. Chuyển hóa vật chất bằng enzyme không hòa tan

Enzyme không hòa tan hay enzyme cố định được hiểu theo cả nghĩa hẹp và nghĩa rộng

Theo nghĩa hẹp: enzyme không hòa tan là những enzyme được đưa vào những pha riêng rẽ, pha này được tách riêng với pha dung dịch tự do. Pha enzyme không hòa tan trong nước và được gắn với những polimer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn

Theo nghĩa rộng: các chất xúc tác cố định là các enzyme, tế bào ở trạng thái sống ở trạng thái cho phép sử dụng lại. Như vậy, theo nghĩa rộng enzyme không hòa tan bao gồm cả enzyme được cố định vào một chất mang, bao gồm cả enzyme có trong cơ thể sống được cố định trong các bình phản ứng sinh học có gắn kết một chất mang cho phép ta sử dụng nhiều lần.

Enzyme không hòa tan hay còn gọi là enzyme cố định thường là những enzyme hòa tan được gắn vào một chất mang bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Nhờ quá trình này mà enzyme từ trạng thái hòa tan chuyển sang dạng không hòa tan. khi chuyển từ trạng thái hòa tan sang trạng thái không hòa tan, enzyme không hòa tan có những ưu điểm sau:

� Enzyme không hòa tan có thể được sử dụng nhiều lần, hoạt tính của enzyme không hòa tan ít bị thay đổi trong những lần tái sử dụng. Đặc điểm này của enzyme không hòa tan có ý nghĩa rất lớn trong kỹ thuật, nhờ đó ta có thể tái sử dụng nhiều lần và sẽ làm giảm chi phí cho việc sản xuất enzyme. Đây là ưu điểm lớn nhất của việc thu nhận và ứng dụng enzyme không hòa tan.

� Enzyme không hòa tan không lẫn vào sản phẩm cuối của phản ứng enzyme, do đó chúng ta không phải chi phí cho việc tách enzyme ra khỏi sản phẩm. Sản phẩm cuối thu được sẽ coi như sản phẩm tương đối sạch.


Từ 2 đặc điểm trên cho thấy sử dụng enzyme không hòa tan có ý nghĩa kinh tế hơn sử dụng enzyme hòa tan nhiều lần.

3.1.3. Chuyển hóa vật chất do các quá trình lên men

Quá trình lên men là quá trình chuyển hóa sinh học được thực hiện bởi các tế bào vi sinh vật sống tự do. Lên men là quá trình chuyển hóa vật chất đặc trưng cho riêng vi sinh vật. Các quá trình lên men là tập hợp rất nhiều các quá trình enzyme. Ở đó, toàn bộ các phản ứng xảy ra trong tế bào theo một trật tự được quyết định bởi hệ thống gen có trong nucleic acid.

Khác với enzyme ngoài tế bào, quá trình lên men thường xảy ra phức tạp hơn, các cơ chất ở ngoài tế bào phải thẩm thấu được vào trong tế bào. Tại đây sẽ tạo ra các sản phẩm bậc một (sinh khối), sản phẩm bậc hai (sản phẩm trao đổi chất). Quá trình tạo ra các sản phẩm trên chỉ được thực hiện trong tế bào sống. Nếu tế bào chết thì các quá trình chuyển hóa lại mang ý nghĩa khác. Đó là quá trình thủy phân bởi enzyme ngoại bào.

Quá trình chuyển hóa sinh học này xảy ra thường xuyên, liên tục trong thiên nhiên và đã được loài người ứng dụng vào sản xuất hàng ngàn năm nay như sản xuất rượu, bia, nước giải khát, phomai, tương, chao, nước mắm và phát triển mạnh trong công nghệ lên men hiện đại như amino acid, kháng sinh, các chất kích thích tăng trưởng.

3.1.4. Chuyển hóa vật chất do tế bào cố định

Tế bào cố định là tế bào vi sinh vật được gắn vào một chất mang. Các chất mang và vi sinh vật gắn vào đó được đưa vào bình phản ứng sinh học (bioreactor). Cơ chất được đưa vào từ đỉnh của bình phản ứng sinh học và sản phẩm được lấy ra ở đáy bình phản ứng sinh học. Quá trình này được thực hiện liên tục.

Tế bào cố định được ứng dụng rộng rãi, đem lại hiệu quả kinh tế rất rõ rệt

3.2. Đặc điểm của enzyme cố định

Khi gắn enzyme hòa tan vào một số chất mang, enzyme này có những đặc điểm khác hẳn enzyme hòa tan.

� Hoạt tính của enzyme không hòa tan thường nhỏ hơn hoạt tính riêng của enzyme hòa tan cùng loại. Sở dĩ có sự thay đổi về hoạt tính riêng của enzyme không hòa tan là do những nguyên nhân sau: a) Do ảnh hưởng điện tích của chất mang. Khi gắn enzyme vào chất mang có điện tích khác với điện

tích của enzyme, cấu trúc không gian của enzyme có sự thay đổi ở mức độ nhất định. Vì sự thay đổi cấu trúc không gian của enzyme nên sự tương tác của enzyme và cơ chất chậm lại, phản ứng sẽ xảy ra yếu hơn. Mức độ giảm hoạt tính của enzyme phụ thuộc vào mức độ thay đổi cấu trúc không gian của enzyme khi ta gắn chúng vào chất mang.

b) Do enzyme bị nhốt vào một gel. Khi ta nhốt một enzyme vào một gel nào đó, gel sẽ bao lấy phân tử enzyme tạo thành một vật cản đối với cơ chất của enzyme. Do đó, sự tiếp xúc giữa trung tâm hoạt động của enzyme với cơ chất gặp khó khăn hơn so với sự tiếp xúc giữa cơ chất với enzyme tự do

� Enzyme không hòa tan hoàn toàn tuân theo định luật Michaelis – menten. Tuy nhiên, trong phản ứng giữa cơ chất với enzyme khong hòa tan có những sai khác nhất định: a) Có thể xảy ra hiện tượng cạnh tranh cơ chất với enzyme và chất mang b) Hiện tượng cản trở sự khuếch tán cơ chất và các sản phẩm của phản ứng làm giảm giảm tốc độ

phản ứng � Enzyme không hòa tan có tính bền nhiệt hơn enzyme hòa tan cùng loại vì chúng được bảo vệ bởi chất

mang � Enzyme không hòa tan có xu hướng chuyển dịch pH tối ưu sang kiềm hoặc acid so với pH tối ưu của

enzyme hòa tan chứ không trùng với pH tối ưu của enzyme hòa tan cùng loại � Enzyme không hòa tan có khả năng bảo quản tốt hơn enzyme hòa tan cùng loại � Ta có thể tái sử dụng enzyme không hòa tan nhiều lần. Trong khi đó enzyme hòa tan chỉ có thể sử

dụng một lần. Đặc điềm này rất có ý nghĩa về kinh tế khi ta tiến hành các phản ứng theo quy mô công nghiệp

3.3. Phương pháp tạo enzyme cố định

3.3.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme cố định

Khi gắn lên chất mang, enzyme bị giới hạn trong một phạm vi môi trường xác định, cấu tạo không gian của phân tử có thể bị thay đổi, do đó làm biến đổi một số tính chất của enzyme ban đầu (enzyme hòa tan).


Enzyme có thể thay đổi về pH, nhiệt độ hoạt động, cũng như các giá trị của hằng số Michaelis – menten và tính chất đặc hiệu, tuy nhiên những thay đổi này còn phụ thuộc nhiều vào bản chất hóa học của chất mang. Nói chung enzyme cố định thường bền với các tác nhân biến tính hơn, nhưng hoạt độ riêng thường thấp hơn enzyme hòa tan.

Một trong những nguyên nhân làm giảm hoạt tính của enzyme cố định là tương tác protein – protein giữa các phân tử enzyme đã được liên kết. Trong mọi trường hợp đều thấy hoạt độ riêng của chế phẩm bị giảm đi cùng với sự tăng lượng enzyme được kết hợp vào trên một đơn vị trọng lượng của chất mang.

Nhìn chung, các enzyme cố định vẫn giữ được tính đặc hiệu của mình. Thêm vào đó, nhờ liên kết với chất mang mà chúng có độ bền vững lớn đối với tác động khác nhau.

a) Hoạt tính của enzyme không tan phụ thuộc vào bản chất và tính chất hóa học của chất mang

Các tính chất lý học của chất mang như tính hòa tan, tính bền vững cơ học, độ trương, điện tích, tính háo nước và kị nước… đều có ảnh hưởng nhất định đến lượng enzyme được liên kết, tính bền và hoạt tính sinh học của dẫn xuất enzyme cố định. Bản chất hóa học của chất mang cũng có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tạo thành dẫn xuất enzyme, và tới khả năng chất mang hấp phụ không đặc trưng các chất từ môi trường phản ứng.

Dẫn xuất enzyme không tan thường có tính bền nhiệt cao so với enzyme tan do kết quả của sự định vị enzyme tạo nên. Chất mang cũng có tác dụng hạn chế sự biến tính của enzyme trong các dung môi có khả năng làm đứt mối liên kết hydrogen và liên kết kị nước.

Khi enzyme được giới hạn trong phạm vi môi trường xác định, sẽ xảy ra nhiều kiểu tương tác khác nhau của chất mang polymer lên môi trường vi mô bao xung quanh phân tử enzyme cố định.

� Thứ nhất: polymer nhờ vào những tính chất lý hóa học đặc trưng sẽ kéo tới bề mặt của enzyme (hoặc đẩy khỏi enzyme) cơ chất, sản phẩm của phản ứng và các phân tử khác, điều này làm tăng (hay giảm) nồng độ của những chất này trong môi trường vi mô ở sát enzyme.

� Thứ hai: bản thân chất mang polymer ngăn cản sự khuếch tán tự do của các phân tử theo hướng tới enzyme cũng như đi khỏi enzyme, từ đó ảnh hưởng đến hiệu quả xúc tác của enzyme. b) Hoạt tính của enzyme không tan phụ thuộc vào sự khuếch tán của cơ chất, sản phẩm và các

phân tử khác

Tốc độ khuếch tán của cơ chất, sản phẩm và các chất khác phụ thuộc vào các yếu tố:

� Kích thước lỗ gel của chất mang polymer � Trọng lượng phân tử của cơ chất � Sự chênh lệch nồng độ giữa vùng môi trường vi mô xung quanh enzyme và dung dịch tự do

Những hạn chế về mặt khuếch tán cũng có ý nghĩa đáng kể trong quá trình sử dụng hệ thống enzyme cố định. Đường kính lỗ của chất mang polymer và trọng lượng phân tử của cơ chất đóng vai trò hàng đầu. Song những hạn chế khuếch tán không chỉ đơn giản như vậy bởi vì còn có sự khác biệt nồng độ giữa vùng môi trường xung quanh enzyme và dung dịch tự do. Hoạt tính xúc tác của enzyme dẫn tới sự thay đổi nồng độ của cơ chất và sản phẩm phản ứng ở vùng môi trường vi mô xung enzyme. Điều này làm xuất hiện gradient nồng độ của cơ chất và sản phẩm của dung dịch và chất mang chứa enzyme cố định. Sự xuất hiện của gradient nồng độ nói trên được giải thích bởi tốc độ khuếch tán thấp các phân tử trong gel và hoạt tính xúc tác cao của enzyme

Những giới hạn khuếch tán có thể được thể hiện ở hai dạng: hàng rào khuếch tán bên ngoài và bên trong. Rào khuếch tán bên ngoài xuất hiện là do có sự tồn tại của lớp mỏng dung môi không pha trộn bao xung quanh hạt polymer. Các chất khuếch tán vào lớp này nhờ có sự kết hợp của khuếch tán phân tử thụ động và sự đối lưu. Độ dày của lớp này phụ thuộc vào tốc độ khuấy trộn của dung môi xung quanh các hạt chứa enzyme cố định. Việc gia tăng tốc độ pha trộn sẽ làm giảm rào khuếch tán bên ngoài, vì vậy trong bất kì quy trình công nghệ nào, tốc độ khuấy đảo đóng vai trò hết sức quan trọng.

Rào khuếch tán bên trong là sự giới hạn khuếch tán tự do ở bên trong chất mang polymer do chính chất mang gây ra. Trong giới hạn của hạt polymer chỉ có sự khuếch tán phân tử thụ động không bị ảnh hưởng bởi tốc độ pha trộn. Rào khuếch tán bên trong sẽ biểu hiện rõ ràng hơn nếu như enzyme được cố định bằng cách đưa nó vào trong chất mang polymer chứ không phải gắn nó vào bề mặt của chất mang.


c) Ảnh hưởng của pH lên enzyme không hòa tan

Điện tích của chất mang có ảnh hưởng đáng kể lên pH tối ưu của enzyme cố định. pH tối ưu của enzyme cố định có thể dịch chuyển về phía pH kiềm hay pH acid so với pH tối ưu của enzyme hòa tan. Sự dịch chuyển pH tối ưu là do ảnh hưởng của trường tĩnh điện của chất mang tạo nên. Sự có mặt của trường tĩnh điện mạnh dẫn tới nồng độ H+ gần chất mang và trong dung dịch khác nhau. Khi lực ion thấp thì nồng độ H+ gần chất mang điện tích âm cao hơn, còn gần chất mang điện tích dương thấp hơn trong dung dịch. Kết quả là pH tối ưu của enzyme liên kết đồng hóa trị với chất mang có điện tích âm sẽ chuyển dịch sang phía pH kiềm so với enzyme hòa tan, ngược lại nếu enzyme liên kết đồng hóa trị với chất mang mang điện tích dương thì pH tối ưu sẽ chuyển dịch sang phía pH acid. Còn khi lực ion lớn điện tích của chất mang được làm trung hòa bởi các ion trái dấu và pH tối ưu của enzyme cố định gần giống như của enzyme hòa tan.

3.3.2. Phương pháp cố định enzyme

3.3.2.1. Chất mang dùng để cố định enzyme

Mục đích cuối cùng của việc cố định enzyme là gắn được enzyme vào một chất mang nào đó để ta có thể thực hiện phản ứng enzyme nhiều lần. Công việc này cần thực hiện những bước sau:

� Chọn chất mang phù hợp với enzyme cần gắn vào nó � Hoạt hóa chất mang cho khả năng gắn enzyme tốt hơn � Tiến hành các kỹ thuật phù hợp để gắn enzyme vào chất mang

Yêu cầu của một chất mang lý tưởng:

� một chất mang lý tưởng sử dụng trong cố định enzyme điều trước hết là cần phải rẻ. Điều này có liên quan đến hiệu quả kinh tế của quy trình công nghệ, đặc biệt có ý nghĩa khi quy trình đó ứng dụng ở quy mô công nghiệp

� Chất mang phải có tính chất cơ lý bền vững, ổn định. Nhờ đó mà chất mang mới chịu được các điều kiện của môi trường như khuấy trộn, áp lực trong các quy trình sản xuất

� Về mặt hóa học, chất mang phải bền vững, không tan trong môi trường phản ứng. Chất mang không được làm mất hoạt tính enzyme. Chất mang không gây ra những phản ứng hấp phụ không đặc hiệu.

� Chất mang phải có tính kháng khuẩn cao, bền vững với sự tấn công của vi sinh vật. � Chất mang phải có độ trương tốt, có diện tích bề mặt tiếp xúc lớn. Tính chất này của chất mang vừa

làm tăng khả năng cố định enzyme vừa tăng khả năng tiếp xúc của cơ chất với enzyme, nhờ đó làm tăng hoạt tính của enzyme cố định và số lần tái sử dụng

� Chất mang có thể có cấu trúc lỗ xốp, siêu lỗ, có thể ở dạng hạt, dạng màng, dạng phim mỏng…

Tất cả các chất mang dùng trong cố định enzyme được chia làm hai nhóm: chất mang polymer hữu cơ, chất mang vô cơ

� Chất mang là polymer hữu cơ: polymer tổng hợp (polyacrylamide, polyester, polyvinylalcohol…) và polymer tự nhiên (polysaccharide: cellulose, agarose, dextran, sephadex và các dẫn xuất của chúng, alginate, carrageenan, chitin, chitosan…; protein: gelatin, keratin, albumin…)

� Chất mang vô cơ: sợi bông thủy tinh, silicum oxide, alluminium oxide, mangesium oxide…

3.3.2.2. Phương pháp cố định enzyme

Trong tế bào sinh vật tồn tại sẵn cả enzyme dạng hòa tan và cả enzyme không hòa tan. Muốn thực hiện được các phương pháp tạo enzyme không hòa tan ta phải tách và thu nhận được enzyme từ tế bào vsv.

Phương pháp nhốt enzyme: có 2 phương pháp:

� Nhốt enzyme trong gel: nhốt enzyme trong gel là phương pháp dựa trên cơ sở tạo ra một màng bọc hay một polymer. Các chất tham gia phản ứng và sản phẩm của phản ứng có thể thẩm thấu vào trong hoặc ra ngoài thông qua mang bao bọc này và enzyem sẽ được giữ nguyên trong khuôn gel đó.

Cách thực hiện: enzyme được trộn vào trong một polymer. Sau đó tiến hành các quá trình trùng hợp với sự có mặt của một hay nhiều tác nhân khâu mạch, tạo ra phức chelate. Khi đó enzyme sẽ được bao bọc trong khoảng không của gel mới tạo thành. Polymer được sử dụng ở đây là acrylamide

� Nhốt enzyme trong hệ sợi: Phương pháp nhốt enzyme trong hệ sợi có khả năng xúc tác phản ứng tốt hơn phương pháp nhốt enzyme trong gel. Các sợi sử dụng để nhốt enzyme thường là những sợi nhân


tạo. Các loại sợi này có độ bền với acid, kiềm, các loại ion và các dung môi hữu cơ hòa tan. Cellulose acetate thường được sử dụng nhiều hơn cả

� Phương pháp tạo vi nang nhốt enzyme: các vi nang được tạo ra để nhốt enzyme thường có kích thước 1 – 100µm. Các vi nang có tính chất là cho các cơ chất và sản phẩm phản ứng qua lại tự do.

Phương pháp này có ưu điểm là enzyme được nhốt trong đó khá bền với mọi tác động bên ngoài và sử dụng được nhiều lần.

Phương pháp tạo liên kết enzyme với chất mang:

Đây là những phương pháp không phải nhốt enzyme vào một chất mang mà gắn enzyme vào chất mang. Như vậy, không phải tất cả các vật liệu đều có thể sử dụng làm chất mang mà chúng phải có tính chất đặc biệt mới gắn enzyme được vào chất mang. Tính chất đặc biệt này:

� Chất mang phải bền với acid, kiềm � Chất mang pahri gắn được với enzyme theo những cơ chế nhất định � Chất mang không được tham gia phản ứng với cơ chất

Tùy theo tính chất của chất mang, người ta thực hiện gắn enzyme vào chất mang theo những cơ chế sau:

� Phương pháp hấp phụ: nhờ khả năng hấp phụ của nguyên liệu làm chất mang, enzyme sẽ được gắn vào bề mặt của chất mang. Khả năng hấp phụ của chất mang càng cao, enzyme càng được gắn nhiều vào chất mang. Do đó, khả năng tái sử dụng enzyme cố định càng cao. Trong thực tế người ta thường sử dụng các chất có khả năng hấp phụ cao như: cellulose, agarose, chitin, polyacrylamide, nylon, nhựa trao đổi ion, silicagel, thủy tinh….

� Phương pháp tạo liên kết ion: dựa vào khả năng tạo liên kết ion giữa chất mang và enzyme người ta gắn enzyme vào chất mang. Liên kết ion thường không bền bằng sự hấp phụ của enzyme đối với chất mang. Chất mang thường sử dụng: DEAE-sephadex

� Phương pháp tạo liên kết kim loại: người ta làm tăng hoạt tính bề mặt của chất mang bằng những hợp chất kim loại. Từ đó các enzyme sẽ gắn chặt hơn vào các chất mang. Những chất mang thường được hoạt hóa bề mặt bằng kim loại: cellulose, gelatin, bông thủy tinh, nylon, nhôm, silicagel…

� Phương pháp tạo liên kết đồng hóa trị: dựa trên nguyên tắc của sự tương tác đồng hóa trị giữa phân tử enzyme và chất mang. Các chất mang này phải là những chất không được tan trong nước. Phương pháp này được ứng dụng rất rộng trong quy mô công nghiệp.

3.4. Ứng dụng của enzyme cố định

Ngày nay, có một vài quy trình công nghiệp ở quy mô lớn đang hoạt động mà có sử dụng enzyme cố định. Ví dụ điển hình là quá trình sản xuất fructose siro từ tinh bột bắp và quá trình sản xuất L-amino acid từ hỗn hợp L và D-amino acid. Enzyme cố định penicillin acylase cũng được sử dụng rộng rãi trong quá trình sản xuất penicillin bán tổng hợp.


3.4.1. Sản xuất fructose nhờ enzyme glucose isomerase

D-glucose không thể được thay thế trực tiếp từ đường sucrose bởi vì glucose ít ngọt hơn. Hơn nữa, tinh thể glucose trong dung dịch đậm đặc có thể làm cho quá trình khó thực hiện hơn. Để loại bỏ những trở ngại này người ta chuyển đổi từ dạng đồng phân glucose sang fructose, sử dụng enzyme glucose isomerase.

Hệ số cân bằng của phản ứng này ở 50oC gần bằng 1, gia trị này không thay đổi lớn theo nhiệt độ bởi vì ước lượng nhiệt của phản ứng này là 1kcal/mol. Kết quả là sản phẩm có chứa glucose và frucose theo tỷ lệ 1:1. Hỗn hợp này ngọt hơn so với glucose đơn lẻ và rất phù hợp để thay thế đường trong nhiều ứng dụng như sản xuất nước giải khát, thực phẩm và làm bánh kẹo. Sở dĩ sản phẩm cuối ngọt hơn là do có chứa nhiều fructose.

Enzyme ngoại bào glucose isomerase được tạo ra bởi nhiều vi sinh vật, cụ thể là Arthobacter và Streptomyces sp. Nhu cầu phá vỡ tế bào mà không phá hủy enzyme làm cho glucose isomerase co giá thành cao hơn so với các enzyme thủy giải ngoại bào khác. Hơn nữa, glucose isomerase rất nhạt cảm với một số tác nhân kìm hãm. Cả hai yếu tố này cho thấy duy trì enzyme ở dạng cố định dưới những điều kiện phản ứng được kiểm soát tốt là một biện pháp cần được thực hiện. Người ta đã cố định glucose isomerase dưới dạng kết hợp với collagen, bông hay một vài loại tác nhân gắn kết khác.

Hình 3.1. Sơ đồ sản xuất fructose siro từ tinh bột bắp sử dụng enzyme glucose isomerase cố định

Có nhiều công đoạn tách lọc và xử lý giữa quá trình đường hóa và đồng phân hóa phải thỏa mãn các điều kiện cơ bản của enzyme học: để tối ưu hóa độ ổn định nhiệt của α-amylase được sử dụng trong giai đoạn hóa lỏng (nhiệt độ của giai đoạn này vào khoảng 105oC) thì cần sử dụng ion canxi. Mặt khác, nhưng ion này ức chế glucose isomerase, và chúng được loại bỏ nhờ quá trình trao đổi ion trước khi dung dịch đường dextrose được cho vào thiết bị thực hiện phản ứng isomer hóa.


3.4.2. Sản xuất L-amino acid nhờ enzyme aminoacylase cố định

Nhu cầu sử dụng L-amino acid trong thực phẩm và y học gia tăng nhanh chóng. L-amino acid đã được tiến hành nghiên cứu sản xuất từ công nghệ vi sinh vật hay bằng phương pháp tổng hợp hóa học. Các amino acid được tổng hợp bằng phương pháp hóa học thường gặp một số bất lợi do tạo ra cả dạng đồng phân D-amino acid, dạng đồng phân này không có giá trị dinh dưỡng. Do đó, trong quá trình sản xuất người ta mong muốn chỉ thu được dạng đồng phân L trong sản phẩm cuối.

Nguyên lý chung của phản ứng chuyển hóa Dl-amino acid thành dạng L-amino acid dưới sự xúc tác bởi enzyme aminoacylase:

Phản ứng xảy ra trong một thiết bị dạng cột có chứa enzyme aminoacylase cố định. L-amino acid mong muốn được tách ra khỏi dạng acyl D-amino acid dựa trên sự khác biệt về độ hòa tan. Sau đó D-acylamino acid được racemic hóa thành dạng DL-amino acid để tiếp tục quay trở lại lò phản ứng có chứa enzyme aminoacylase cố định.

Hình 3.2. Sơ đồ sản xuất L-amino acid sử dụng amino acylase của công ty Taabe Seiyaku, Nhật Bản

Hiện nay, loại aminoacylase gắn với DEAE-Sephadex bằng liên kết ion được chọn sử dụng bởi vì nó có hoạt tính cao, dễ dàng chuẩn bị, có khả năng tái sinh và ổn định.

4. THU NHẬN ENZYME

4.1. Chọn nguồn nguyên liệu

Enzyme là những chất xúc tác sinh học, có nhiều trong cơ thể sống. Việc điều chế chúng bằng phương pháp hóa học với số lượng lớn là việc làm rất khó khăn và đầy tốn kém nếu không muốn nói là điều không tưởng, nên người ta thường thu nhận chúng từ các nguồn sinh học. Mặc dù enzyme có trong tất cả các cơ quan, mô của động vật thực vật cũng như trong tế bào vi sinh vật, song việc tách enzyme đáp ứng yêu cầu về mặt kinh tế chỉ có thể tiến hành khi nguyên liệu có chứa một lượng lớn enzyme cũng như cho phép thu được enzyme với hiệu suất cao và dễ dàng tinh chế chúng. Việc phân bố của enzyme trong tế bào cũng không đồng đều, trong một loại tế bào cũng có thể có nhiều enzyme này song không có enzyme khác. Lượng enzyme lại thay đổi tùy theo giai đoạn sinh trưởng phát triển của sinh vật và tùy theo loài nên chúng ta phải chọn nguồn nguyên liệu thích hợp cho việc chiết rút và tinh chế enzyme. Có ba nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản:


� Các mô và cơ quan động vật � Mô và cơ quan thực vật � Tế bào vi sinh vật.

Các mô và cơ quan động vật

Trong tất cả các nguyên liệu có nguồn gốc động vật thì tuyến tuỵ, màng nhầy dạ dày, tim... dùng để tách enzyme rất thuận lợi. Dịch tuỵ tạng có chứa amylase, lipase, protease, ribonuclease và một số enzyme khác.

Từ ngăn tư của dạ dày bê nghé người ta có thể thu nhận chế phẩm renin để làm đông sữa trong sản xuất fomat. Người ta cũng sản xuất pepsin từ dạ dày động vật. Nhưng khác với pepsin, renin có khả năng đông tụ sữa cao mà không thủy phân sâu sắc casein. Renin là chế phẩm enzyme có giá trị lớn trong công nghiệp.

Mô và cơ quan thực vật

Ở thực vật: thông thường enzyme hay có mặt ở các cơ quan dự trữ như hạt, củ, quả. Cơ quan dự trữ giàu chất gì thì nhiều enzyme chuyển hóa chất ấy. Ví dụ trong hạt cây thầu dầu có nhiều lipase, trong hạt đậu tương có nhiều enzyme urease.

Thóc nảy mầm chứa nhiều α - amylase, ở củ khoai lang lại có nhiều β - amylase. Người ta đã thu được một số chế phẩm enzyme thủy phân như papain, bromelain, fixin từ thực vật bậc cao.

Papain thu được từ mẫu nhựa đu đủ xanh, bromelain thu được từ các bộ phận (lá, thân, quả) cây dứa, còn fixin được tách từ dịch ép thân và lá cây Ficus.

Qua các nguồn nguyên liệu động, thực vật chính có thể từ đó chiết xuất các chế phẩm enzyme, chúng ta thấy rằng hai nguồn nguyên liệu này không thể dùng để sản xuất các chế phẩm enzyme với quy mô lớn bởi các nhược điểm sau đây:

� Chu kỳ sinh trưởng của chúng dài � Nguồn nguyên liệu này không cải tạo được. � Nhiều nguyên liệu dùng làm thực phẩm (dùng để ăn) không thể dùng làm nguyên liệu để sản xuất với

quy mô lớn các chế phẩm enzyme nhằm thoả mãn các nhu cầu của nền kinh tế quốc dân.

Dùng vi sinh vật làm nguồn nguyên liệu để sản xuất các chế phẩm enzyme có nhiều ưu điểm nổi bật và có tính chất độc đáo vượt xa so với nguồn nguyên liệu từ động vật, thực vật, cũng như sẽ khắc phục được mọi khó khăn và hạn chế ở trên.

Tế bào vi sinh vật

Trước hết vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với số lượng lớn. Đây cũng là nguồn nguyên liệu mà con người chủ động tạo ra được. Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn (từ 16 - 100 giờ) vì vậy có thể nuôi cấy hàng trăm lần trong năm.

Enzyme vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các sinh vật khác. Vì vậy chỉ cần một lượng nhỏ enzyme có thể chuyển hóa một lượng lớn cơ chất. Số liệu tính toán cho biết, trong vòng 24 giờ, vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một lượng thức ăn gấp 30 - 40 lần so với trọng lượng cơ thể chúng. Trong khi đó, hệ enzyme của con lợn trên 50 kg chỉ có thể chuyển hóa được vài kg thức ăn trong ngày.

Hệ enzyme vi sinh vật vô cùng phong phú. Vi sinh vật có khả năng tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau, trong đó có những enzyme ở động, thực vật không tổng hợp được. Ví dụ cellulase, raxemase...Phần lớn các thức ăn để nuôi vi sinh vật lại dễ kiếm và giá rẻ. Nhiều vi sinh vật cho enzyme thường có khả năng phát triển trên các môi trường đơn giản, giá rẻ, dễ kiếm như các phế liệu của các ngành sản xuất. Hơn nữa, có thể dùng những nguyên liệu không phải thực phẩm, những dung dịch muối vô cơ để nuôi vi sinh vật. Vì vậy dùng vi sinh vật làm nguồn thu enzyme sẽ mang lại giá thành rẻ, thời gian nhanh và hiệu quả kinh tế cao.

Vi sinh vật sinh sản phát triển với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ, kích thước bé, nhưng tỷ lệ enzyme trong tế bào tương đối lớn nên quy trình sản xuất chế phẩm enzyme khá dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao. Lượng enzyme có thể được sản xuất ra trong một thời gian ngắn. Đối với một số trường hợp có thể dùng 100% sinh khối vi sinh vật làm nguồn enzyme.


Vi sinh vật rất nhạy cảm đối với tác động của môi trường, thành phần dinh dưỡng nuôi chúng cũng như một số tác nhân lý hóa, cơ học khác. Do đó có thể thay đổi những điều kiện nuôi cấy để chọn giống tạo những chủng đột biến cho ta hàm lượng enzyme đáng kể với hoạt tính xúc tác cao. Có thể nói rằng, nhờ nguồn enzyme vi sinh vật, người ta có thể điều khiển sự tổng hợp enzyme dễ dàng hơn các nguồn nguyên liệu khác để tăng lượng enzyme được tổng hợp hoặc tổng hợp định hướng enzyme.

Tuy vậy trong quá trình chọn nguồn nguyên liệu từ vi sinh vật, cần lưu ý một số vi sinh vật có khả năng sinh độc tố để có biện pháp xử lý thích hợp. Nói chung các vi sinh vật muốn được sử dụng làm nguồn nguyên liệu tách enzyme cần phải thoả mãn các điều kiện sau:

� Khả năng tổng hợp enzyme mạnh trong một thời gian ngắn. � Dễ tách enzyme và không sinh độc tố.

Có một điều lí thú là: trong điều kiện bình thường, vi sinh vật chỉ tổng hợp ra một lượng enzyme vừa đủ cho hoạt động sinh lý cơ thể của chúng (thường được gọi là sự tổng hợp enzyme "bản thể"). Nếu khi tăng hàm lượng một số chất hoặc thêm một số chất mới vào môi trường nuôi cấy, đặc biệt là cơ chất của enzyme, thì sự tổng hợp enzyme tương ứng tăng lên một cách đáng kể, khác thường có khi còn tổng hợp enzyme mới: hiện tượng trên gọi là sự cảm ứng sinh tổng hợp enzyme. Chất gây nên sự cảm ứng sinh tổng hợp gọi là chất cảm ứng. Sự tổng hợp một lượng đáng kể enzyme gọi là siêu tổng hợp enzyme.

Để thu được nguồn enzyme dồi dào từ vi sinh vật, cần phải nuôi cấy chúng. Có hai phương pháp nuôi cấy vi sinh vật để thu enzyme: phương pháp nuôi cấy bề mặt và phương pháp nuôi cấy bề sâu hay là phương pháp nổi và phương pháp chìm.

Trong phương pháp nuôi cấy bề mặt, người ta cho vi sinh vật phát triển và bao phủ trên bề mặt các hoạt chất dinh dưỡng rắn, đã được làm ẩm, dùng làm môi trường (cám gạo, cám nếp, cám mì, bắp xay nhỏ...). Để môi trường xốp người ta trộn thêm một lượng nhỏ mạt cưa... Sau khi nuôi đủ thời gian để vi sinh vật tổng hợp enzyme môi trường được sấy nhẹ, nghiền nhỏ. Chế phẩm thu được ở dạng rắn - thô. Muốn có chế phẩm tinh khiết phải qua giai đoạn tách và tinh chế enzyme.

Khác với phương pháp nuôi cấy bề mặt, trong phương pháp nuôi cấy bề sâu người ta cho vi sinh vật phát triển trong môi trường lỏng. Nguyên liệu chính và phổ biến là dịch đường glucose, fructose, maltose, saccharose... dịch thủy phân cellulose, tinh bột... Nguồn nitơ hữu cơ thường dùng là nước chiết bắp, chiết malt, dịch tự phân nấm men. Cần chọn pH phù hợp với chủng vi sinh vật và sự tổng hợp enzyme theo mong muốn. Sau khi nuôi, ta thu được canh trường lỏng - dạng thô.

Để làm tăng lượng enzyme ở vi sinh vật chúng ta cần chú ý tuyển lựa và chọn giống các chủng vi sinh vật có hoạt tính enzyme cao, tổng hợp được enzyme cần thiết và với số lượng nhiều. Các chủng được phân lập theo phương pháp thông thường chỉ tổng hợp một lượng nhỏ enzyme (enzyme bản thể), do đó cần tiến hành gây đột biến bằng các phương pháp sinh học, lý, hóa học... để tạo chủng có khả năng siêu tổng hợp enzyme. Vi sinh vật sau khi được tuyển chọn, cần được nhân giống và nuôi trong điều kiện tối ưu để chúng sinh trưởng tốt, tổng hợp nhiều enzyme.

Ngoài ra cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Trong thành phần môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme.

Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện tượng cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì chất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm toả của chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho không bị cản trở. Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp.

Ví dụ: Muốn tách α - amylase ở nấm mốc (Asp.Oryzae), người ta cho vào môi trường nuôi cấy tinh bột, maltose, isomaltose, oligosaccharid... có chứa liên kết α - 1,6 glucozid. Muốn tách pectinase ở Asp.Niger, người ta cho thêm vào môi trường pectin. Đối với hemicellulase thì chất cảm ứng là hemicellulose; còn đối với proteinase chất cảm ứng có hiệu lực là protein, bột đậu nành, lông, sừng nghiền nhỏ (ở Actinomyces fradiae). Chất cảm ứng cũng có thể là những chất giống cơ chất và những sản phẩm thủy phân của chúng. Ví dụ: thay cho protein thì peptid và thay cho tinh bột thì erithrodextrin đều có tác dụng cảm ứng.

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đối với môi trường nuôi cấy. Nhiệt độ nuôi cấy thông thường từ 25 – 30oC. Trị số pH ban đầu của môi trường (chủ yếu ở môi trường nước) cũng có thể gây ảnh hưởng nào đó đến sự

CÔNG NGHỆ ENZYME

tạo thành enzyme, nhưng khi đó cvật. Thông thường đối với α - amylase, pH tcho hoạt động của nó (pH = 4,7 -pH tối ưu cho sự sinh tổng hợp và cho hothiết cho việc sinh tổng hợp enzyme. Vì vvào, còn ở môi trường bề sâu (môi trưnày cực kỳ quan trọng). Độ ẩm cthành phần môi trường bề mặt.

Một điều cần nói thêm nữa là enzyme thư(intracellular), nhưng nó cũng có thbào (extracellular). Enzyme vi sinh v

4.2. Thu nhận enzyme

Quy trình thu nhận enzyme từ ngu

Quy trình thu nhận enzyme từ vi sinh v

o thành enzyme, nhưng khi đó cũng cần tính đến khả năng biến đổi nhanh chóng chamylase, pH tối ưu cho sự sinh tổng hợp (pH = 7

- 4,9). Các enzyme đường hóa khác của nấm mốp và cho hoạt động là chung nhau (4,5 - 5,0). Độ

p enzyme. Vì vậy ở môi trường bề mặt người ta thường thêm chsâu (môi trường dịch thể) , thì người ta thường lắc (nếu enzyme c

m cũng rất quan trọng (chỉ có tác dụng ở nuôi cấy b

a là enzyme thường chứa ở các tế bào sinh vật gọi là cũng có thể được các sinh vật tiết ra môi trường sống. Đó là các enzyme ngoài t

bào (extracellular). Enzyme vi sinh vật thường chiết là enzyme ngoại bào.

nguồn thực vật và động vật

vi sinh vật

Nguyên liệu thực vật/động vật

Nghiền

Trích ly

Lọc

Kết tủa

Tinh sạch enzyme

Canh trường lên men vi sinh vật

Phân ly lỏng/rắn

Canh trường

Lọc

Kết tủa

Tinh sạch enzyme

31

i nhanh chóng chỉ số đó bởi vi sinh p (pH = 7 - 8) khác với pH tối ưu

ốc như glucoamylase thì ộ thông khí cũng rất cần

ng thêm chất xốp như trấu u enzyme cần lắc thì việc y bề mặt), phụ thuộc vào

i là các enzyme trong tế bào ng. Đó là các enzyme ngoài tế


5. ỨNG DỤNG CỦA ENZYME

5.1. Tình hình ứng dụng enzyme trong công nghiệp trên thế giới

Từ khi phát hiện ra enzyme và khả năng chuyển hóa của enzyme, loài người đã tăng nhanh quá trình sản xuất và ứng dụng enzyme trong công nghiệp. Số lượng enzyme phát hiện ngày càng nhiều và số lượng enzyme được ứng dụng vào công nghiệp cũng ngày càng nhiều.

Bảng 5.1. Mức độ ứng dụng của một số enzyme quan trọng hiện nay trên thế giới [2]

STT Loại enzyme Tỷ lệ ứng dụng (%) 1 Enzyme protease

• Trypsine • Rennet • Protease acid • Protease trung tính • Protease kiềm yếu • Protease kiềm mạnh

59 3

10 3

12 6

25

2 Carbohydrase • Pectinase • Isomerase • Cellulase • α-amylase • β-amylase

28 3 6 1

13 13

3 Lipase 3 4 Các enzyme khác ứng dụng trong

y học và trong phân tích 10

Qua bảng trên ta thấy các enzyme thuộc nhóm protease hiện đang được ứng dụng nhiều nhất. Trong đó, enzyme protease kiềm được ứng dụng nhiều nhất. Trong đó, protein kiềm được ứng dụng trong chất tẩy rửa với số lượng lớn nhất so với các loại enzyme khác.

Trong số enzyme được sản xuất và ứng dụng trên thế giới, các nước Châu Âu sản xuất và bán ra thị trường thế giới số lượng nhiều nhất.

Bảng 5.2. Thị trường enzyme ở Châu Âu [2]

STT Loại enzyme Giá trị buôn bán enzyme (triệu

USD) 1 Carbohydrase 83,2 2 Protease 187,2 3 Lipase 31,6 4 Pectinase 41,6 5 Những loại enzyme đặc biệt 20,8 6 Các loại enzyme khác 41,6

(Nguồn: Frost và Sullian, 1992)

Riêng trong công nghệ thực phẩm, lượng enzyme được tiêu thụ nhiều nhất. Số lượng enzyme được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm chủ yếu ở các nước Châu Mỹ, Châu Âu.


Bảng 5.3. Thị trường enzyme trong công nghiệp thực phẩm, thức ăn gia súc trên thế giới [2]

STT Lĩnh vực công nghiệp và enzyme Giá trị buôn bán enzyme (triệu

USD) 1 Chuyển hóa tinh bột

• Amylo glucosidase • α-amylase • Glucose isomerase • Enzyme nấm sợi • Pullulanase • β-amylase

140 55 40 20 5 3 1

2 Công nghiệp sữa • Rennet động vật • Rennet vi sinh vật • Lipase-esterase • Lysozyme

110 75 20 8 6

3 Rượu, bia, nước giải khát • Pectinase • Papain • β-glucanase • Cellulase – Hemicellulase • α-amylase • Amyloglucosidase • Glucose oxidase

46 10 8 4

3 – 4 2 – 3 1 – 2 0,5

4 Cồn • α-amylase • Amyloglucosidase • Pullulanase • β-glucanase • Cellulase – Hemicellulase

32

5 Công nghiệp bánh kẹo • Amylase nấm sợi • α-amylase • Protease • Cellulase – Hemicellulase

15 10 – 12

1 – 2 1 – 2 1 – 2

6 Thực phẩm hỗn hợp • Invertase • Lipase • Bromelin • Glucoseoxidase

15 8 2

3 – 4 1 – 2

7 Thức ăn gia súc • β-glucanase • Cellulase – Hemicellulase • α-amylase • Glucoseoxidase • Protease vi khuẩn

8 3 – 4 2 – 3 < 1

< 0,5 < 0,5

(Nguồn: A.Wiseman, 1998)

Ở Việt Nam, công nghệ enzyme chưa phát triển. Các nghiên cứu có đề cập đến hầu hết các loại enzyme của động vật, thực vật và vi sinh vật, nhưng chưa có enzyme nào được sản xuất theo quy mô công nghiệp, Việt Nam vẫn hoàn toàn phụ thuộc vào nguồn enzyme từ nước ngoài. Trong đó, các loại enzyme đang được sử dụng nhiều ở Việt Nam là các loại enzyme của hãng NOVO của Đan Mạch. Vì vậy, việc hiểu biết, nghiên cứu, phát triển sản xuất enzyme tại Việt Nam là rất cần thiết.


5.2. Ứng dụng trong y học

Enzyme có một vị trí quan trọng trong y học. Đặc biệt là các phương pháp định lượng và định tính enzyme trong hóa học lâm sàng và phòng thí nghiệm chẩn đoán. Do đó, hiện nay trong y học đã xuất hiện lãnh vực mới gọi là chẩn đoán enzyme, có nhiệm vụ:

� Phân tích xác định nồng độ cơ chất như glucose, ure, cholesterol… với sự hỗ trợ của enzyme. � Xác định hoạt tính xúc tác của enzyme trong mẫu sinh vật. � Xác định nồng độ cơ chất với sự hỗ trợ của thuốc thử enzyme đánh dấu.

Dùng enzyme để định lượng các chất, phục vụ công việc xét nghiệm chẩn đoán bệnh, ví dụ dùng để kiểm tra glucose nước tiểu rất nhạy.

� − �� + ��

�� − �� − � − �� + ��

Urease để định lượng ure…

Dùng enzyme làm thuốc ví dụ protease làm thuốc tắc nghẽn tim mạch, tiêu mủ vết thương, làm thông đường hô hấp, chống viêm, làm thuốc tăng tiêu hóa protein, thành phần của các loại thuốc dùng trong da liễu và mỹ phẩm…

Trong y học các protease cũng được dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy vi sinh vật sản xuất ra kháng sinh, chất kháng độc… Ngoài ra người ta còn dùng enzyme protease để cô đặc và tinh chế các huyết thanh kháng độc để chữa bệnh.

Amylase được sử dụng phối hợp với coenzyme A, cytocrom C, ATP, carboxylase để chế thuốc điều trị bệnh tim mạch, bệnh thần kinh, phối hợp với enzyme thủy phân để chữa bệnh thiếu enzyme tiêu hóa.

5.3. Ứng dụng trong hóa học

Cho đến nay, việc ứng dụng enzyme trong hóa học là do enzyme có cảm ứng cao đối với nhiệt độ, pH và những thay đổi khác của môi trường.

Một trong những ứng dụng chế phẩm enzyme đáng được chú ý nhất trong thời gian gần đây là dùng chất mang để gắn phức enzyme xúc tác cho phản ứng nhiều bước. Ví dụ tổng hợp glutathion, acid béo, alcaloid, sản xuất hormone…Cũng bằng cách tạo phức, người ta gắn vi sinh vật để sử dụng trong công nghệ xử lý nước thải, sản xuất alcohol, amino acid…

Trong nghiên cứu cấu trúc hóa học, người ta cũng sử dụng enzyme, ví dụ dùng protease để nghiên cứu cấu trúc protein, dùng endonuclease để nghiên cứu cấu trúc nucleic acid …

Dùng làm thuốc thử trong hóa phân tích.

5.4. Ứng dụng trong công nghiệp

Việc sử dụng enzyme trong công nghiệp là đa dạng, phong phú và đã đạt được nhiều kết quả to lớn. Thử nhìn thống kê sơ bộ sau đây về các lãnh vực đã dùng protease ta có thể thấy được sự đa dạng: công nghiệp thịt, công nghiệp chế biến cá,công nghiệp chế biến sữa, công nghiệp bánh mì, bánh kẹo, công nghiệp bia, công nghiệp sản xuất sữa khô và bột trứng, công nghiệp hương phẩm và mỹ phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp da, công nghiệp phim ảnh, công nghiệp y học…Với amylase, đã được dùng trong sản xuất bánh mì, công nghiệp bánh kẹo, công nghiệp rượu, sản xuất bia, sản xuất mật,glucose, sản xuất các sản phẩm rau, chế biến thức ăn cho trẻ con, sản xuất các mặt hàng từ quả, sản xuất nước ngọt, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy….

5.4.1. Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

Protease với công nghiệp thực phẩm: Việc sử dụng trong chế biến làm mềm thịt là ứng dụng có tính truyền thống. Nhân dân ta từ rất lâu đã dùng thơm để nấu canh thịt bò; dùng rau sống là chuối chát, vả kết hợp thức ăn nhiều thịt; đu đủ trong chống táo bón…mà thực chất là sử dụng papain, bromelain, fixin. Người Nga còn dùng protease từ hạt đậu tương nẫy mầm để làm mềm thịt.

Ngoài khả năng phân giải để làm mềm thịt, tạo thức ăn dễ tiêu hóa, công nghệ sản xuất các loại dịch thủy phân giàu protein đã được áp dụng một cách có hiệu quả tính năng của protease.

Enzyme là một công cụ để chế biến các phế liệu của công nghiệp thực phẩm thành thức ăn cho người và vật nuôi.


Người ta còn khai thác tính đông tụ như của renin, pepsin vào công nghiệp thực phẩm như trong sản xuất phomat.

Pectinase với công nghiệp thực phẩm: Pectinase đã được dùng trong một số ngành công nghiệp thực phẩm sau:

� Sản xuất rượu vang. � Sản xuất nước quả và nước uống không có rượu. � Sản xuất các mặt hàng từ quả: quả cô đặc, mứt. � Sản xuất nước giải khát. � Sản xuất cà phê.

Chế phẩm pectinase được sử dụng trong sản xuất nước quả từ các nguyên liệu quả nghiền hay để làm trong nước quả ép. Bởi vì khi có pectin thì khối quả nghiền sẽ có trạng thái keo, do đó khi ép dịch quả không thóat ra được. Nhờ pectinase mà nước quả trong suốt, dễ lọc, hiệu suất tăng.

Pectinase còn góp phần chiết rút các chất màu, tanin và các chất hòa tan khác, do đó làm tăng chất lượng của thành phẩm.

Những nghiên cứu khi ép nho có xử lý bằng pectinase không những làm tăng hiệu suất mà còn làm tăng màu sắc.Trong sản xuất mứt nhừ, mứt đông… nhờ pectinase mà dịch quả có nồng độ đậm đặc hơn.

Cellulase với công nghiệp thực phẩm: Cellulose là thành phần cơ bản của tế bào thực vật, vì vậy nó có mặt trong mọi loại rau quả cũng như trong các nguyên liệu,phế liệu của các ngành trồng trọt và lâm nghiệp.

Nhưng người và động vật không có khả năng phân giải cellulose. Nó chỉ có giá trị làm tăng tiêu hóa, nhưng với lượng lớn nó trở nên vô ích hay cản trở tiêu hóa.

Chế phẩm cellulase thường dùng để:

� Tăng chất lượng thực phẩm và thức ăn gia súc. � Tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật.

Ứng dụng trước tiên của cellulase đối với chế biến thực phẩm là dùng nó để tăng độ hấp thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thực phẩm thực vật. Đặc biệt là đối với thức ăn cho trẻ con và nói chung chất lượng thực phẩm được tăng lên.

Một số nước đã dùng cellulase để xử lý các loại rau quả như bắp cải, hành, cà rốt, khoai tây, táo và lương thực như gạo. Người ta còn xử lý cả chè, các loại tảo biển…

Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase trong đó có cellulase, thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều kiện tốt cho tác động của protease và đường hóa.

Trong sản xuất agar-agar, tác dụng của chế phẩm cellulase sẽ làm tăng chất lượng agar-agar hơn so với phương pháp dùng acid để phá vở thành tế bào. Đặt biệt là việc sử dụng chế phẩm cellulase để tận thu các phế liệu thực vật đem thủy phân, dùng làm thức ăn gia súc và công nghệ lên men.

Những ứng dụng của cellulase trong công nghiệp thực phẩm đã có kết quả rất tốt. Tuy nhiên hạn chế lớn nhất là rất khó thu được chế phẩm có cellulase hoạt độ cao.

Amylase với công nghiệp thực phẩm: Chế phẩm amylase đã được dùng phổ biến trong một số lãnh vực của công nghiệp thực phẩm như sản xuất bánh mì, glucose, rượu , bia...

Trong sản xuất bánh mì, chế phẩm amylase đã làm thay đổi hoàn tòan chất lượng của bánh mì cả hương vị, màu sắc, độ xốp...Chế phẩm amylase sạch cho chất lượng bánh mì tốt hơn ở dạng phức hợp với protease.

Trong sản xuất bánh kẹo người ta thường dùng maltose là sản phẩm thủy phân tinh bột bằng amylase và glucose bằng glucoamylase. Chính glucoamylase, là yếu tố làm tăng hiệu suất trong sản xuất rượu.

Trong sản xuất bia, viêc sử dụng amylase có trong các hạt nẩy mầm thay thế malt đã góp phần đáng kể trong việc giảm giá thành.


5.4.2. Ứng dụng trong công nghiệp dệt

Trong công nghiệp dệt, chế phẩm amylase được dùng để rũ hồ vải trước khi tẩy trắng và nhuộm. Amylase có tác dụng làm vải mềm, có khả năng nhúng ướt, tẩy trắng và bắt màu tôt. Rũ hồ bằng enzyme không những nhanh, không hại vải, độ mao dẫn tốt mà còn đảm bảo vệ sinh, do đó tăng được năng suất lao động.

Trong sản xuất tơ tằm, người ta dùng protease để làm sạch sợi tơ. Với công đoạn xử lý bằng enzyme sau khi xử lý bằng dung dịch xà phòng sẽ giúp lụa có tính đàn hồi tốt, bắt màu đồng đều và dễ trang trí trên lụa.

5.4.3. Ứng dụng trong công nghiệp thuộc da

Trong công nghiệp da, enzyme protease được dùng để làm mềm da, làm sạch da, rút ngắn thời gian, tránh ô nhiễm môi trường. Việc xử lý đã được tiến hành bằng cách ngâm da trong dung dịch enzyme, hay phết dịch enzyme lên bề mặt da. Enzyme sẽ tách các chất nhờn và làm đứt một số liên kết trong phân tử collagen làm cho da mềm hơn.

Thực tế cho thấy khi xử lý da bằng chế phẩm protease từ vi sinh vật có thể rút ngắn thời gian làm mềm và tách lông xuống nhiều lần. Điều quan trọng là chất lượng lông tốt hơn khi cắt. So với phương pháp hóa học thì việc xử lý bằng enzyme có số lượng lông tăng 20-30%. Lông không cần xử lý thêm sau khi ngâm trong dịch enzyme.

5.5. Ứng dụng trong nông nghiệp

Có thể sử dụng các loại chế phẩm enzyme khác nhau để chuyển hóa các phế liệu, đặc biệt là các phế liệu nông nghiệp cải tạo đất phục vụ nông nghiệp.

Ở Nhật hằng năm đã sản xuất hàng vạn tấn chế phẩm cellulase các loại để dùng trong nông nghiệp. Có chế phẩm chứa cả cellulase, hemicellulase, protease và amylase.

Công nghệ này khá phổ biến ở nhiều quốc gia. Ở nước ta việc dùng enzyme vi sinh vật góp phần trong sản xuất phân hữu cơ đang được khai thác để thay thế cho phân hóa học.

Tóm lại, có thể nói rằng, việc nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm enzyme ngày càng được chú trọng ở các lĩnh vực khác nhau. Trong 20 năm cuối thế kỷ XX và các năm dầu của thế kỷ XXI các enzyme khác nhau đã được ứng dụng. Ở Việt Nam bước đầu đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng các enzyme trong chế biến nông sản, thực phẩm, nhất là trong lĩnh vực sản xuất bia, rượu, chế biến tinh bột (Viện công nghiệp thực phẩm, Viện công nghệ sinh học – công nghệ thực phẩm, Đại học Bách khoa Hà Nội…). Việc nghiên cứu các enzyme phục vụ nông nghiệp, công nghiệp cũng được quan tâm và có các kết quả đáng khích lệ. Ví dụ, chế phẩm enzyme mới ra đời phục vụ nông nghiệp E2001 có tác dụng tăng độ phì nhiêu đất, tăng năng suất cây trồng. Đã có các nghiên cứu ứng dụng protease trong sản xuất rượu bia, rút ngắn thời kỳ lên men cũng như sản xuất nước mắm ngắn ngày bằng công nghệ enzyme protease. Enzyme amylase cũng được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trong sản xuất đường bột, maltodextrin, nha glucose, siro, glucose – fructose ở quy mô công nghiệp.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Hóa sinh công nghiệp, Lê Ngọc Tú, NXB KH-KT-HN, 2002.

[2] Công nghệ enzyme, Nguyễn Đức Lượng, NXB ĐHQG TPHCM, 2004.

[3] Enzyme in food technology, Robert J. Whitehurst Barry A. Law, Sheffield Academic Press, 2002

[4] Proteins in food processing, R. Y. Yada, Woodhead Publishing Limited and CRC Press LLC, 2004

Science

Bai giang cong nghe enzyme