Aminoácidos, péptidos y proteínas

Dra. Ana Sotelo

Proteínas I

Química Biológica

12 de agosto de 2013

Funciones de las proteínas

Proteínas estructurales: colágeno, queratina, elastina

Proteínas transportadoras: hemoglobina, citocromos

Proteínas de almacenamiento: ovoalbúmina, caseína

Proteínas motoras: actina, miosina

Enzimas

Hormonas

Proteínas protectoras: Anticuerpos; cascada de coagulación

Señalización intracelular: receptores, enzimas

No polares, con grupos R alifáticos

Polares, grupos R sin carga

Grupos R aromáticos

Grupos R cargados positivamente (aminoácidos básicos)

Grupos R cargados negativamente (aminoácidos ácidos)

Estructura general de los aminoácidos Repaso

Clasificación de los aminoácidos

Repaso

¿la Gly tiene actividad óptica?

¿Qué características particulares tiene la Pro en su estructura?

Aminoácidos no polares con grupo R alifático

Aminoácidos con grupo R aromático

Repaso

Los aminoácidos aromáticos absorben luz UV

Las proteínas tienen un máximo de absorbancia UV en 275-280 nm

La absortividad molar del Trp es 5 veces mayor que Tyr y 50 veces la de Phe

Conociendo la absortividad molar de una proteína particular, se puede

determinar su concentración por espectrofotometría: A = ε b c.

Propiedades de los aminoácidos aromáticos

aminoácidos básicos, cargados positivamente a pH neutro.

¿por qué no está cargada la His?

¿qué significa ε-NH2 de la lisina?

Repaso

1

2

3

4

5

6

con carga positiva

Aminoácidos con grupo R cargado

Repaso

¿cuáles son los grupos polares de estos aminoácidos?

la formación del puente disulfuro es una modificación postraduccional

Aminoácidos polares con grupo R

sin carga Unión de dos residuos de cisteína:

formación del puente disulfuro

cisteína

cistina cisteína

Los aminoácidos se identifican por un código

de tres letras o uno de una sola letra

Repaso

los aminoácidos habituales son 20

8 de ellos son esenciales para los humanos

Aminoácidos poco frecuentes

colágeno

miosina

protrombina

elastina

colágeno

miosina

protrombina

elastina

colágeno

miosina

protrombina

elastina

Algunos residuos se pueden modificar transitoriamente para alterar la función

de la proteína. La modificación más frecuente es la fosforilación (Tyr, Ser, Thr).

Los aminoácidos son anfolitos

Propiedades de los aminoácidos

Curva de titulación de la glicina

pI=(pK1+pK2)/2

Curva de titulación del glutamato

Los aminoácidos son anfolitos

Propiedades de los aminoácidos

pI 3.2

Curva de titulación de la histidina

pI 7.6

Propiedades de los aminoácidos

9- 10 ~ 2

Grupos ionizables de los aminoácidos

Propiedades de los aminoácidos

Formación del enlace peptídico

Repaso

la formación del enlace peptídico en una reacción de condensación

los aminoácidos que forman parte de un péptido se llaman residuos, para indicar

la pérdida de la molécula de agua

Péptidos Repaso

según la cantidad de residuos, los péptidos se denominan dipéptidos, tripéptidos,

tetrapéptidos, pentapéptidos, … oligopéptidos o polipéptidos

Indique la carga neta de la molécula a pH 3. Estime el pI del péptido

Ejercicio Titulación de péptidos

Niveles de organización de las proteínas

estructura

terciaria

estructura

secundaria

estructura

cuaternaria

estructura

primaria

estructura

función

Estructura primaria:

estructura covalente de proteínas

la secuencia de una proteína es el orden en que se presentan sus aminoácidos

cada proteína tiene una secuencia única

los sucesivos enlaces peptídicos definen la cadena principal o esqueleto peptídico

Estructura primaria:

estructura covalente de proteínas

Cada proteína tiene una secuencia única de aminoácidos (estructura primaria)

Si se altera la secuencia de aminoácidos

la función de la proteína puede cambiar

Cada proteína tiene una estructura 3D única que le confiere una función única

La estructura terciaria de la proteína está

condicionada por la secuencia de la misma

Conocer la estructura primaria

SECUENCIACIÓN DE PROTEÍNAS

secuencia de ADN

insulina

Homología de secuencia

Secuencia de aminoácidos del citocromo c

Las proteínas homólogas: presentan similitudes en secuencia de aa y estructura 3D comparten características estructurales y funcionales

Son miembros de una familia de proteínas

Amarillo: aa idénticos; azul: sustituciones conservativas;

sin colorear: sustituciones no conservativas

Alineamiento de secuencias de proteínas

Homología de secuencia

Proteína Hsp70: la introducción de un hueco (“gap”) en la secuencia de

B. subtilis permite un mejor alineamiento de residuos de aminoácidos

Secuencia de transportador ABC (ATP binding cassette) de tipo I

Secuencias consenso

Secuencia consenso se refiere a los aminoácidos (o bases) más frecuentes encontrados una posición determinada luego de comparar varias secuencias

Representación de secuencias consenso

Logotipos de secuencia

Árbol filogenético de proteínas

Homología de secuencia

comparar en cuánto difieren dos proteínas relacionadas permite establecer hace cuánto tiempo se separaron las especies

Secuenciación de proteínas

Estrategia para secuenciar una proteína

Tener a la proteína de interés pura

Determinar cuántas cadenas polipeptídicas componen la proteína:

si hay más de una, separarlas

Desnaturalizarla

Romper los puentes –S-S- y bloquear los grupos –SH

Determinar la composición en aminoácidos de cada cadena polipeptídica

Determinar los residuos amino y carboxilo terminal de cada cadena

Determinar de la secuencia de aminoácidos por reacción de Edman,

proteólisis específicas, ordenamiento de los fragmentos y superposición

Localizar los puentes disulfuro

Los procedimientos de purificación separan proteínas

teniendo en cuenta diferencias de:

Solubilidad (precipitación por salado)

Tamaño (diálisis, ultracentrifugación, cromatografía de

exclusión molecular, SDS-PAGE)

Carga eléctrica (intercambio iónico, electroforesis)

Polaridad (cromatografía en fase reversa, de adsorción)

Afinidad de unión (cromatografía de afinidad)

Purificación de proteínas

Seminario de proteínas Tener a la proteína de interés pura

Desnaturalización de las proteínas

Seminario de proteínas

Desnaturalizarla

La desnaturalización de las proteínas

implica la pérdida de la estructura

secundaria y terciaria, pero no la estructura

primaria se rompen uniones débiles

La proteína pierde su estructura y, por lo

tanto, su actividad

Uniones en las proteínas

Uniones covalentes:

- enlace peptídico

- puente disulfuro

Interacciones débiles:

- puente hidrógeno

- interacción electrostática

- interacción hidrofóbica

- fuerzas de van der Waals

Seminario de proteínas

Desnaturalizarla

Desnaturalización de las proteínas

Seminario de proteínas

Desnaturalizarla

Desnaturalizantes:

• ácidos y bases

• solventes orgánicos

• calor

• detergentes

• urea y cloruro de

guanidinio

urea

guanidinio

SDS

Ruptura de puentes disulfuro

Seminario de proteínas

Romper los puentes –S-S- y bloquear los grupos –SH

Puentes intercatenarios

Puentes intracatenarios Grupos accesibles

Grupos inaccesibles

Ruptura de puentes disulfuro

CH2I

C=O

O-

iodoacético

CH2I

C=O

NH2

iodoacetamida

ácido perfórmico

2-mercaptoetanol

ditiotreitol

Seminario de proteínas

oxidante

reductores

bloqueantes si se reducen los puentes disulfuro,

es necesario bloquearlos para evitar

que se vuelvan a formar

Composición en

aminoácidos

Determinar la composición en aminoácidos

de cada cadena polipeptídica

Para conocer la composición en

aminoácidos de una proteína es

necesario romper sus enlaces

peptídicos

HCl 6N, 110°C, 24h

Análisis cromatográfico de

aminoácidos

Determinar la composición en aminoácidos de cada cadena polipeptídica

Reacciones para la

determinación de aminoácidos

Reacción de la ninhidrina

Determinación del residuo N-terminal

Determinar los residuos amino y carboxilo terminal de cada cadena

DNFB:

dinitrofluorbenceno

Reactivo de Sanger

PITC:

fenilisotiocianato

Reactivo de Edman el cloruro de dansilo y

el cloruro de dabsilo

son más sensibles que

el DNFB

Determinación del residuo C-terminal

Hidrazinólisis Carboxipeptidasa

(ruptura en el lado amino del aa C-terminal)

Determinar los residuos amino y carboxilo terminal de cada cadena

Degradación de Edman

La automatización de este proceso se conoce como degradación secuencial de

Edman, se utiliza para establecer la secuencia de aminoácidos en una proteína

Determinar de la secuencia de aminoácidos por reacción de Edman,

proteólisis específicas, ordenamiento de los fragmentos y superposición

marcación

liberación

marcación

liberación

primera

vuelta

segunda

vuelta

Ruptura proteolítica de la cadena peptídica

Determinar de la secuencia de aminoácidos por reacción de Edman,

proteólisis específicas, ordenamiento de los fragmentos y superposición

Determinar de la secuencia de aminoácidos por reacción de Edman,

proteólisis específicas, ordenamiento de los fragmentos y superposición

Solapamiento de péptidos

Ejemplo

Esquema de secuenciación

Asignación de puentes disulfuro

Sólo los –SH libres

aparecen alquilados

- Alquilación

- Hidrólisis

- Reducción

- Alquilación

- Hidrólisis

Aparecen alquilados

los –SH libres y los SS

Sobre la proteína con enlaces SS intactos

Digestión con enzimas/rvos qcos

Separación de los fragmentos resultantes

A cada fragmento

insulina

Ejercicio

¿cómo hizo Sanger para secuenciar la

insulina?

¿y para asignar los puentes disulfuro?

Síntesis química de péptidos: síntesis en fase sólida

activador

bloqueante anclaje

acople

desbloqueo activación

Síntesis de péptidos en fase sólida

Efecto del rendimiento de cada paso sobre el

rendimiento general de la síntesis de péptidos