WHITE BIOTECHNOLOGY

“Strategie per batteri in cerca di occupazione”

Nuove strategie di risanamento

Anna Rosa Sprocati

BIORISANAMENTO ��

Unica tecnologia in grado di trasformare completamente i contaminanti reimmettendo gli elementi nei cicli biogeochimici

•  NON SEMPRE POSSIBILE �

•  Richiede STUDI DI FATTIBILITA’ �

Albero decisionale per uno studio di fattibilità di bonifica biologica

Campionamenti di suolo

dal sito contaminato

CAMPO

Caratterizzazione chimica ed ecotossicologica.. Rilevamento delle specie botaniche eventualmente presenti nel sito

Test di vitalità della flora microbica. Test sulla presenza di attività metabolica, costitutiva o inducibile, per la trasformazione dei contaminanti presenti

negativo

Determinazione del potenziale di trasformazione dei contaminanti presenti

Aggiunta di microorganismi capaci di trasformare i metalli

LABORATORIO Aggiunta di specie botaniche accumulatrici di metalli

Determinazione dei fattori limitanti (es:, biodisponibilità dei metalli mediante la misura della loro mobilità.)

negativo

Necessità di supporto per l'incremento dell'attività microbica (es: pretrattamenti, crescita della biomassa microbica in bioreattori di laboratori) oppure Necessità di impiegare metodi alternativi

negativo

Ottimizzazione delle condizioni ambientali (es: T, pH, fattori di crescita, concentrazione dei contaminanti,)

negativo

Test ecotossicologici per la valutazione della tossicità finale

Esperimenti in condizioni reali su scala di microcosmi con diverse condizioni sperimentali

Test in condizioni reali su piccola scala

CAMPO Applicazione pratica

Possible ways to activate the natural �bioremediation potentials�

�

� Experimental activity�

�

RATIONAL �

• Microbial processes - responsible for the biodegradation of organic contaminants and for the transformation and detoxification of inorganic contaminants - are the driving forces behind natural attenuation.��•  Nevertheless the accumulation in the environment of highly toxic pollutants emphasises the fact that m.o., by themselves, are insufficient to protect the biosphere from the flux of the anthropogenic pollution.�

• They can be harnessed in “enhanced bioremediation technologies”.�

• Harnessing the natural degradation potentials present in the environmental matrices is the current challenge to be addressed by bioremediation research.�

�•  "niche adjustment",� by the inoculation of competent microorganisms into these systems�

(bioaugmentation) ���

Possible ways to activate these potentials �

•  changing physico-chemical parameters: pH, T, oxygen, electron donors or acceptors, nutrients, etc.�

(biostimulation, bioventing etc) ��

Offers a way to provide specific microbes in sufficient numbers to complete the biodegradation �

•  Natural attenuation �•  Biostimulation�•  Bioaugmentation�

Peculiarity of “bioremediation” is to restore an environmental matrix �(e.g. soil, sediment, water) preserving its quality and thus its functions.��

restore while preserving�

8

Lines of evidence recommended to demonstrate that bioremediation of a contaminated system has taken place :��

•  reduction in contaminant mass or concentration with time;� �•  indirect evidence of transformation provided by changes in hydrogeologic or

geochemical data (soil and groundwaters);��•  direct evidence of biodegradation provided by in situ or mesocosms or

microcosm studies;��•  evidence of drop in ecotoxicity �

Biostimulation/Bioaugmentation�controversy�

� Critical points:��•  Biostimulation introduces supplementar nutrients in the environment �

Addition of nutrients to a soil containing aged contaminations might negatively affect the indigenous microbial population adapted to low nutrient conditions �

(Margesin and Schinner, 1999 World J. Microbiol. Biotechnol. 15, 615–622) �

•  Bioaugmentation has to face problems of RAPID DECLINE/SURVIVAL of introduced microorganisms(microbiostasis)and DISPERSION�

� �

Hence�

Detailed site specific characterization studies are needed prior to deciding on the proper bioremediation method.�

�

“Black-box approach” single key criterion: degradation ability of strains

TO

“knowledge-based approach”

relative spatial and temporal abundance of potential source populations and their ability to tolerate the prevailing conditions in target habitats

FROM

Bioaugmentation controversy � Benefit & Failure�

•  Apparent semplicity�•  Failures (Goldstein, 1985, Stephenson and Stephenson 1992, Bouchez 2000, Vogel and Walter 2001, Wagner-

Dobler 2003) ��

• The interpretation of the results often suffers from a lack of ecological data about the fate and activity of the inoculated m.o. and about the relation of the indigenous microbial communities�

• The ecological background constitutes a major barrier in the successful of bioremedition performance �

• This is especially true for complex biotopes��

Most degradation potentials are ubiquitous but competent indigenous microbes are usually present in very small numbers �

FACTORS associated with Bioaugmentation ��•  Pollutants characteristics �

•  (concentration, bioavailability,toxicity ) �•  Physico-chemical environmental characteristics �

•  Reducing the microbial activity: temperature, humidity, ionic strength�•  Restricting the mass transfer of the contaminants to m.o.: clay and organic matter content. �

•  Microbial Ecology �•  energy flux, indigenous activity, predators, competitors�

•  Microbiology �•  co-substrates, genetics of relevant m.o., enzyme stability and activity�

•  Methodology�•  Strains selection, concentration and methods of the inoculation , inoculum etherogeneity�

Vogel T.M., Current Opinion in Biotechnology, Volume 7, Issue 3, June 1996, Pages 311-316 �

���

Bioaugmentation= Increase of microbial diversity����Increasing the metabolic capabilities of the microbiota present within an environmental matrix for a better removal of pollutants� �

How to interpret this biodiversity ?�

�WHAT AND HOW ?�

�•  Ecological studies should attempt to delineate the main energy fluxes and which group(s) of

species plays quantitative key roles in the system. ��

(Pareto's law, i.e. 20% of the species govern 80% of the energy flux of the ecosystem) �

•  Bioaugmentation should aim at the rearrangement of the group(s) of organisms dominantly involved in the overall energy flux so that specific catabolic traits necessary for the clean up of pollutants are part of that active group�

�

Winnie Dejonghe et al., 2001. Environmental Microbiology 3, 10: 649-657 ��

It is time to initiate more comprehensive approaches to find common rationales in bioremediation�

�

PROPOSED APPROACHES� TO ENHANCE �

PROCESS EFFICIENCY �1.  Terry J. Gentry 2004 Crit. Rev. in Environ. Science and Tech., 34, 447-494 �

•  Bioaugmentation with cells encapsulated in a carrier such as alginate; or naturally occurring capsules from earthworm eggs �•  Rhizosphere bioaugmentation�•  Phytoaugmentation�

2.  Singer A.C. et al., 2005. Trends in Biotechnology 23, 2: 74-77 �•  Coordinated research efforts on the exploitation of Heirloom species�•  In rhizo-directed strain selection �•  Priming �

3.  U. Welander, Soil and Sediment Contamination, 2005, 14: 281-291 �•  Cold adapted m.o might be adapted to other conditions prevalent at low temperature: low nutrient availability, low water

activity�

4.  S. Wuertz et al. 2004. Water Science & Technology Vol 49 No 11-12 pp 327–336 �•  Biofilm architecture: if certain spatial structures can be forced metabolic processes may be enhanced �

5.  S. Venkata Mohan et al., Rev. Environm. Sci. Biotech 2006 5:347-374 ) �•  Bacteria chemotaxis The molecular basis of this phenomenon is a fertile and useful area for future research,

particularly in regard to soil contaminated with PAHs. �

6.  Ian P. Thompson et al., Environmental Microbiology 7, 7: 909-915 �•  Inoculation of strains containing mobile genetic elements (MGE) might provide a mechanism for the introduction of

specific traits into microbial communities�

•  .��

•  Saïd El Fantroussi, Spiros N Agathos (2005). Current Opinion in Microbiology 8,3 : 268-275

•  Looking for microorganisms from the same ecological niche as the polluted environmental matrix.�

•  The strategy of using tailor-made consortia, which link functionally the in situ microbial community structure with the relevant chemical parameters, seems to be a promising avenue towards rational selection of effective inocula for bioremediation applications. �

�•  Watanabe K, et al., Environ Microbiol 2002,4:577-583.(activated sludge) �•  van der Gast CJ et al., Environ Microbiol 2004, 6:254-263(waste metal-working fluid) �•  Gentry TJ, Biodegradation 2004, 15:67-75 (activated soil) �•  Da Silva MLB, , Alvarez PJJ, Appl Environ Microbiol 2004, 70:4720-4726. (BTEX biodegradation following introduction of

methanogenic consortia).�

•  Lendvay JM, Environ Sci. Technol 2003, 37:1422-1431.(a chloroethene-contaminated aquifer) �

Saïd El Fantroussi, Spiros N Agathos (2005). Current Opinion in Microbiology 8( 3) : 268-275. �

EXPERIMENTAL��

•  Isolation of microbial communities native to co-contaminated matrices and selection of strains resistant to heavy metals �

•  Test for active (or inducible ) metabolism towards organic pollutants�

•  Tailored Microbial Formula: �Use of the strains in form of consortium for degradation of organic pollutants in the presence of heavy metals � � Use of PGP in association with plants�

Target Selected strategy �

•  Co-contamination ��Biodegradation of organic pollutants in the presence of heavy metals ��•  Heavy metals���

�serious limiting factor in bioremediation

technology�

Based on the use of comparatively ‘high-throughput’ methods �for molecular and physiological profiling �

• at community level �

•  at single component- system level �

• Polyphase approach �Classical Microbiology�

Molecular Biology ( r-DNA16S and 18S) �

Molecular Ecology (DGGE, t-RFLP) �

Globale Phenotype Analysis (BIOLOG TM system ) �

• Experimental systems for the Scale-up�

�Biometers �

Microcosms � Lysimeters�

METHODOLOGY �

�Proactive Development of �

Tailored Microbial Formula for �Strengthening Natural Bioremediation Capabilities �

����

22

Bagnoli (Napoli): �Disused metallurgic site �

Heavy Metals (mg/kg) OSS AGL LAM

Cr 240 210 215 Ni 54 29 80 Zn 214 353 177 Co 5,4 5,9 4,1 Cu 65 129 117 As 34 118 41 Cd 1 2 1 Pb 249 345 227 Hg 0,6 0,6 0,3

Total heavy metals 825,7 1192,5 899,7

Organics (mg/kg) PCBs 1,703 0,067 1,241 PAHs 1,270 0,382 5,167 Total

hydrocarbons (mg/kg)

4080 30 358

S.P. A.E. E.O.0

1000OSS

TO

XIC

UN

IT

MATRICESS.P. A.E. E.O.

0

10

90

100AGL

TO

XIC

UN

IT

MATRICES

S.P. A.E. E.O.0

5

10 LAM

TO

XIC

UN

IT

MATRICES

Attività respiratoria microbica

-20

0

20

40

60

80

100

120

0 50 100 150 200 250 300

tempo (ore)

Ossig

en

o c

on

su

mato

mg

/L

OSS AGL LAM

0

200

400

600

800

1000

1200

0 48 96 144 192 240 288 336 384

time(hs)

OpticalDensity590nm

OSS

AGL

LAM

0

200

400

600

800

1000

1200

0 48 96 144 192 240 288 336 384

time(hs)

OpticalDensity590nm

OSS

AGL

LAM

Microbial Community physiological profile ( Biolog ECO-plates)

23

BACTERIAL STRAINS ISOLATED FROM THE SITE OF BAGNOLI identified by r-DNA 16S full gene sequencing

Strain ID Strain ID Strain ID

AGL1 Stenotrophomonas sp. LAM1 Pseudomonas jessenii OSS1 Bacillus licheniformis

AGL2 Pseudomonas lutea LAM9 Pseudomonas resinovorans OSS2 Streptomyces sp.

AGL3 Agrobacterium tumefaciens LAM11 Arthrobacter sp. OSS3 Promicrospora sukumoe

AGL5 Arthrobacter sp. LAM18 Rhodococcus erythropolis OSS4 Bacillus megaterium

AGL6 Agrobacterium tumefaciens LAM19 Arthrobacter sp. OSS5 Bacillus subtilis

AGL7 Stenotrophomonas sp. LAM21 Acinetobacter calcoaceticus OSS8 Bacillus sp.

AGL9 Pseudomonas sp. LAM22 Arthrobacter sp. OSS19 Bacillus sp.

AGL10 Leucobacter komagatae LAM23 Exiguobacterium sp. OSS22 Bacillus megaterium

AGL12 Microbacterium sp. LAM29 Delftia tsuruhatensis OSS24 Bacillus simplex

AGL13 Pseudomonas putida LAM30 Bacillus cereus OSS25 Bacillus circulans

AGL14 Pseudomonas putida LAM33 Pseudomonas fluorescens OSS26 Rhodococcus sp.

AGL17 Acinetobacter calcoaceticus OSS27 Microbacterium sp.

OSS28 Rhodococcus sp.

OSS31 Paenibacillus polymixa

OSS32 Paenibacillus sp.

OSS33 Promicrospora sukumoe

OSS34 Streptomyces heteromorphus

OSS35 Bacillus sp.

OSS42 Bacillus subtilis

OSS45 Streptomyces levis

OSS47 Streptomyces ghanaensis

OF1 Gordonia polyisoprenivorans

24

MIC Pb

0

1

2

3

4

5

6

CH

34

E.c

oli

AG

L1A

GL2

AG

L3A

GL4

AG

L5A

GL6

AG

L7A

GL8

AG

L9A

GL1

0A

GL1

1A

GL1

2A

GL1

3A

GL1

4A

GL1

5A

GL1

6A

GL1

7A

GL1

8

LAM

1LA

M 2

LAM

3LA

M 4

LAM

5LA

M 6

LAM

8T

LAM

8F

LAM

9LA

M 1

0LA

M 1

1LA

M 1

2LA

M 1

3

LAM

14

LAM

15

LAM

17

LAM

18

LAM

20

LAM

21

LAM

22

LAM

23

LAM

24

LAM

26

LAM

27

LAM

28

LAM

29

LAM

30

LAM

31

LAM

32

LAM

33

LAM

34

OSS1

OSS 2

OSS 3

OSS 4

OSS 5

OSS 7

OSS 8

OSS 1

4O

SS 1

5O

SS 1

7O

SS 1

9O

SS 2

2O

SS 2

3O

SS 2

4O

SS 2

5O

SS 2

6O

SS 2

7O

SS 2

8O

SS 3

0O

SS 3

1O

SS 3

2O

SS 3

3O

SS 3

4O

SS 3

5O

SS 3

6O

SS 3

9 b

isO

SS 4

0O

SS 4

2O

SS 4

3O

SS 4

5O

SS 4

6O

SS 4

7O

SS 4

8O

SS 4

9

isolati

[mM]

MIC Cu

0

1

2

3

4

5

6

CH

34

E.c

oli

AG

L1

AG

L2

AG

L3

AG

L4

AG

L5

AG

L6

AG

L7

AG

L8

AG

L9

AG

L1

0A

GL1

1A

GL1

2A

GL1

3A

GL1

4A

GL1

5A

GL1

6A

GL1

7A

GL1

8

LA

M 1

LA

M 2

LA

M 3

LA

M 4

LA

M 5

LA

M 6

LA

M 8

TLA

M 8

FLA

M 9

LA

M 1

0LA

M 1

1LA

M 1

2LA

M 1

3

LA

M 1

4LA

M 1

5LA

M1

7LA

M1

8LA

M 2

0LA

M 2

1LA

M 2

2LA

M 2

3LA

M 2

4LA

M 2

6LA

M 2

7LA

M 2

8LA

M 2

9LA

M 3

0LA

M 3

1LA

M 3

2LA

M 3

3LA

M 3

4

OSS1

OSS 2

OSS 3

OSS 4

OSS 5

OSS 7

OSS 8

OSS 1

4O

SS 1

5O

SS 1

7O

SS 1

9O

SS 2

2O

SS 2

3O

SS 2

4O

SS 2

5O

SS 2

6O

SS 2

7O

SS 2

8O

SS 3

0O

SS 3

1O

SS 3

2O

SS 3

3O

SS 3

4O

SS 3

5O

SS 3

6O

SS 3

9 b

isO

SS 4

0O

SS 4

2O

SS 4

3O

SS 4

5O

SS 4

6O

SS 4

7O

SS 4

8O

SS 4

9

isolati

[mM]

MIC Cd

0

1

2

3

4

5

6

CH

34

E.c

oli

AG

L1

AG

L2

AG

L3

AG

L4

AG

L5

AG

L6

AG

L7

AG

L8

AG

L9

AG

L1

0A

GL1

1A

GL1

2A

GL1

3A

GL1

4A

GL1

5A

GL1

6A

GL1

7A

GL1

8

LA

M 1

LA

M 2

LA

M 3

LA

M 4

LA

M 5

LA

M 6

LA

M 8

TLA

M 8

FLA

M 9

LA

M 1

0LA

M 1

1LA

M 1

2LA

M 1

3

LA

M 1

4LA

M 1

5LA

M17

LA

M18

LA

M 2

0LA

M 2

1LA

M 2

2LA

M 2

3LA

M 2

4LA

M 2

6LA

M 2

7LA

M 2

8LA

M 2

9LA

M 3

0LA

M 3

1LA

M 3

2LA

M 3

3LA

M 3

4

OSS1

OSS 2

OSS 3

OSS 4

OSS 5

OSS 7

OSS 8

OSS 1

4O

SS 1

5O

SS 1

7O

SS 1

9O

SS 2

2O

SS 2

3O

SS 2

4O

SS 2

5O

SS 2

6O

SS 2

7O

SS 2

8O

SS 3

0O

SS 3

1O

SS 3

2O

SS 3

3O

SS 3

4O

SS 3

5O

SS 3

6O

SS 3

9 b

isO

SS 4

0O

SS 4

2O

SS 4

3O

SS 4

5O

SS 4

6O

SS 4

7O

SS 4

8O

SS 4

9

isolati

[mM]

MIC Ni

0

2

4

6

8

10

CH

34

E.c

oli

AG

L1

AG

L2

AG

L3

AG

L4

AG

L5

AG

L6

AG

L7

AG

L8

AG

L9

AG

L1

0A

GL1

1A

GL1

2A

GL1

3A

GL1

4A

GL1

5A

GL1

6A

GL1

7A

GL1

8

LA

M 1

LA

M 2

LA

M 3

LA

M 4

LA

M 5

LA

M 6

LA

M 8

TLA

M 8

FLA

M 9

LA

M 1

0LA

M 1

1LA

M 1

2LA

M 1

3

LA

M 1

4LA

M 1

5LA

M17

LA

M18

LA

M 2

0LA

M 2

1LA

M 2

2LA

M 2

3LA

M 2

4LA

M 2

6LA

M 2

7LA

M 2

8LA

M 2

9LA

M 3

0LA

M 3

1LA

M 3

2LA

M 3

3LA

M 3

4

OSS1

OSS 2

OSS 3

OSS 4

OSS 5

OSS 7

OSS 8

OSS 1

4O

SS 1

5O

SS 1

7O

SS 1

9O

SS 2

2O

SS 2

3O

SS 2

4O

SS 2

5O

SS 2

6O

SS 2

7O

SS 2

8O

SS 3

0O

SS 3

1O

SS 3

2O

SS 3

3O

SS 3

4O

SS 3

5O

SS 3

6O

SS 3

9 b

isO

SS 4

0O

SS 4

2O

SS 4

3O

SS 4

5O

SS 4

6O

SS 4

7O

SS 4

8O

SS 4

9

isolati

[mM]

MIC Zn

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

CH

34

E.c

oli

AG

L1A

GL2

AG

L3A

GL4

AG

L5A

GL6

AG

L7A

GL8

AG

L9A

GL1

0A

GL1

1A

GL1

2A

GL1

3A

GL1

4A

GL1

5A

GL1

6A

GL1

7A

GL1

8

LAM

1LA

M 2

LAM

3LA

M 4

LAM

5LA

M 6

LAM

8T

LAM

8F

LAM

9LA

M 1

0LA

M 1

1LA

M 1

2LA

M 1

3

LAM

14

LAM

15

LAM

17

LAM

18

LAM

20

LAM

21

LAM

22

LAM

23

LAM

24

LAM

26

LAM

27

LAM

28

LAM

29

LAM

30

LAM

31

LAM

32

LAM

33

LAM

34

OSS

1O

SS 2

OSS

3O

SS 4

OSS

5O

SS 7

OSS

8O

SS 1

4O

SS 1

5O

SS 1

7O

SS 1

9O

SS 2

2O

SS 2

3O

SS 2

4O

SS 2

5O

SS 2

6O

SS 2

7O

SS 2

8O

SS 3

0O

SS 3

1O

SS 3

2O

SS 3

3O

SS 3

4O

SS 3

5O

SS 3

6O

SS 3

9 b

isO

SS 4

0O

SS 4

2O

SS 4

3O

SS 4

5O

SS 4

6O

SS 4

7O

SS 4

8O

SS 4

9

isolati

[mM]

MIC Co

0

2

4

6

8

10

CH

34

E.c

oli

AG

L1

AG

L2

AG

L3

AG

L4

AG

L5

AG

L6

AG

L7

AG

L8

AG

L9

AG

L1

0A

GL1

1A

GL1

2A

GL1

3A

GL1

4A

GL1

5A

GL1

6A

GL1

7A

GL1

8

LA

M 1

LA

M 2

LA

M 3

LA

M 4

LA

M 5

LA

M 6

LA

M 8

TLA

M 8

FLA

M 9

LA

M 1

0LA

M 1

1LA

M 1

2LA

M 1

3

LA

M 1

4LA

M 1

5LA

M17

LA

M18

LA

M 2

0LA

M 2

1LA

M 2

2LA

M 2

3LA

M 2

4LA

M 2

6LA

M 2

7LA

M 2

8LA

M 2

9LA

M 3

0LA

M 3

1LA

M 3

2LA

M 3

3LA

M 3

4

OSS1

OSS 2

OSS 3

OSS 4

OSS 5

OSS 7

OSS 8

OSS 1

4O

SS 1

5O

SS 1

7O

SS 1

9O

SS 2

2O

SS 2

3O

SS 2

4O

SS 2

5O

SS 2

6O

SS 2

7O

SS 2

8O

SS 3

0O

SS 3

1O

SS 3

2O

SS 3

3O

SS 3

4O

SS 3

5O

SS 3

6O

SS 3

9 b

isO

SS 4

0O

SS 4

2O

SS 4

3O

SS 4

5O

SS 4

6O

SS 4

7O

SS 4

8O

SS 4

9

isolati

[mM]

Minimal Inhibition Concentration (MIC)

MIC Cr

0

0,5

1

1,5

2

CH

34E

.col

iA

GL1

AG

L2A

GL3

AG

L4A

GL5

AG

L6A

GL7

AG

L8A

GL9

AG

L10

AG

L11

AG

L12

AG

L13

AG

L14

AG

L15

AG

L16

AG

L17

AG

L18

LAM

1LA

M 2

LAM

3LA

M 4

LAM

5LA

M 6

LAM

8T

LAM

8F

LAM

9LA

M 1

0LA

M 1

1LA

M 1

2LA

M 1

3 LA

M 1

4LA

M 1

5LA

M17

LAM

18LA

M 2

0LA

M 2

1LA

M 2

2LA

M 2

3LA

M 2

4LA

M 2

6LA

M 2

7LA

M 2

8LA

M 2

9LA

M 3

0LA

M 3

1LA

M 3

2LA

M 3

3LA

M 3

4

OS

S1

OS

S 2

OS

S 3

OS

S 4

OS

S 5

OS

S 7

OS

S 8

OS

S 1

4O

SS

15

OS

S 1

7O

SS

19

OS

S 2

2O

SS

23

OS

S 2

4O

SS

25

OS

S 2

6O

SS

27

OS

S 2

8O

SS

30

OS

S 3

1O

SS

32

OS

S 3

3O

SS

34

OS

S 3

5O

SS

36

OS

S 3

9 bi

sO

SS

40

OS

S 4

2O

SS

43

OS

S 4

5O

SS

46

OS

S 4

7O

SS

48

OS

S 4

9

isolati

[mM]

Ralstonia metalidurans

Escherichia coli

Pb�

Cu �

Cd�

Co �

Zn�

Cr �

Ni�

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%

Pb Cu Cd Ni Zn Cr Co

AGLLAMOSS

Heavy metals Resistances distribution

Sprocati et al. in: Modern Multidisciplinary Applied Microbiology exploiting microbes and their interactions, Wiley-VCH:488-493 (2006).

Heavy metals distribution

0

50

100

150

200

250

300

350

400

mg

/Kg

Pb Cu Cd Ni Zn Cr Co

AGL LAM OSS

•  The distribution of heavy metals resistances among the native strains corresponds in large part to the distribution of heavy metals in the soil, mostly for Cr and Pb;

•  Cr and Pb resistances are not frequent in nature

These data suggest that :•  this microbial population is the

result of the selective pressure fostered by the heavy metals

•  it should be thus a stable population

•  this characteristic is a prerequisite to be a good candidate as inoculants for bioaugmentation

Biodegradation

• Selection of strains able to degrade PHAs, diesel, crude-oil

• Biosurfactants producers

Heavy metals resistances

(Pb, Cr,Cd, Zn, Mn, Co, Cu)

• 19 strains multiple resistances

• 50 strains show resistance (MIC ) similar to Ralstonia m. CH34

• 33 strains show resistance (MIC ) higher than Ralstonia m. CH34

ENEA-OSS

3 Microbial Communities (AGL-LAM -OSS)

Different Tailor-made Microbial Formula

TAILORING MICROBIAL FORMULA�

SOIL BIOREMEDIATION FEASIBILITY

DIESEL 1% (w/v) and heavy metals (mg/Kg)

Pseudomonas jessenii LAM1Pseudomonas resinovorans LAM9Arthrobacter sp. A3Z-18 LAM11 Rhodococcus sp. LAM18 Arthrobacter sp. A3Z-18LAM19 Arthrobacter sp. JCM 13 LAM22 Exiguobacterium sp. LAM23 Delftia sp. LFJ11-1, LAM29Bacillus sp. AH 540 LAM30Pseudomonas sp LAM33

ENEA-LAM

Degradation 75%42 days

Mn Zn Cr As Pb Cd Cu

1044 115 12 20 48 0,12 13,90

Abiotic control: soil+ m.o.+diesel+HgCl2Biotic control :soil +m.o.Treated:soil+m.o.+diesel

29

0

20

40

60

80

100

C12

C13

C14

C15

C16

C17

C18

C19

C20

i-C15

i-C16

i-C17

i-C18

prista

ne

phyt

ane

phen

antre

ne

rem

ov

al

eff

icie

nc

y (

%)

abiotic control 42 days treated 15 days treated 42 days

Biotic control Spiked soil

Time (days)

N° of fragments

Total area (FUx103)

N° of fragments

Total area (FU x103)

T0 21 360 21 360

T15 14 191 17 190

T42 10 180 31 277

T-RFLP data : raise in diversity of bacterial species

• Most of the inoculated strains have survived • The partial DO biodegradation and the subsequent availability of intermediate metabolic compounds allowed the development of a succession of the native microbial strains which played a role in the biodegradation of DO and phenantrene

ENEA-OSSBacillus,

Rhodococcus, Gordonia,

Microbacterium, Paenibacillus,

Promicromonospora, Streptomyces

ENEA-OSS

Control

RT: 8,00 - 55,00

10 15 20 25 30 35 40 45 50 55Time (min)

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

14000000

16000000

18000000

20000000

22000000

24000000

26000000

28000000

30000000

32000000

34000000

36000000

38000000

40000000

42000000

Intensity

fitanopristano

C14C15 C16

C18

C17

NL:4,25E7TIC MS ICIS greggio T0

RT: 8,00 - 55,00

10 15 20 25 30 35 40 45 50 55Time (min)

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

9000000

10000000

11000000

12000000

13000000

14000000

15000000

16000000

17000000

18000000

19000000

20000000

21000000

22000000

Intensity

fitano

pristano

NL:2,26E7TIC MS ICIS greggio Tmezzi

3 weeks

Iranian crude-oil 2%(w/v) in sea water

70% degradation

Scale-up

Biometers

Microcosms station ASTM E1197-87(2004)

Lysimeters in situ

TERRESTRIAL INTACT SOIL CORE MICROCOSM ���ASTM E1197-87(2004)

33

Seems fit to represent the soil ecosystem at both microbiological and biochemical scale since it preserves :

• The structural and functional integrity of the native ecosystem

• The spatial heterogeneity of biotic, physical and chemical factors of the native ecosystem

Bioaugmentation: Microbial Formula ENEA-LAM/OSS

LAM1 Pseudomonas jesseniiLAM9 Pseudomonas resinovoransLAM33 Pseudomonas sp. LAM18 Rhodococcus sp.LAM11 Arthrobacter sp. LAM19 Arthrobacter sp. LAM22 Arthrobacter sp. LAM23 Exiguobacterium sp. LAM29 Delftia sp. LAM30 Bacillus sp. OSS31 Paenibacillus polymixa OSS42 Bacillus subtilis

Experimental design

Over time 104 days

Treated: soil + MF+ DO+ HM

Controls: soilsoil + MFsoil + DO HMsoil + DO + MF

Experimental design�Start �

14th of July 2008�

End �

28th of October 2008�

Contamination:

Diesel: 1% w/vMetals: Pb (500 mg/Kg ) and Zn (1000 mg/Kg)

AIM : Evaluation of the consortium ENEA-LAM as bioaugmentation agent for co-contaminated soils

•  extent of Diesel-HC degradation•  capacity to degrade Diesel-HC in the presence of heavy metals

•  effect of M.O. on the mobility of heavy metals

•  effect on the ecotoxicity

PARAMETERS �

Chemical , Geochemical and Physical characterisation ��• pH, T, �• C and N content �• Soil granulometry and composition�• Diesel-HC Gas-mass analysis�• Heavy metals content and mobility��

Microbiological characterisation ��• Molecular (PCR-DGGE) and Physiological (Biolog system) profiling at community level �

• l Microbial Load�

• Isolation and identification of the culturable fraction�

• Lipase activity���

Ecotoxicology��• In progress�

�

0-10 10-20 0-55 >60

Deep total -C % (w/w)

organic- C % (w/w)

total -N % (w/w)

ORI 0-10 cm 2,42 1,96 0,2 ORI 10-20 cm 1,59 1,24 0,14 ORI 0-55 cm 2,01 1,67 0,19 ORI > 60 cm 0,72 0,57 0,06

Zn Pb Ni Cu Cr Mn Mg Ca Fe Na K

mg/Kg

mg/Kg

mg/Kg

mg/Kg

mg/Kg

% w/w

% w/w

% w/w

% w/w

% w/w

% w/w

ORI 0-10 144 28 27 44 55 1189 0,22 1,14 3,25 1,01 2,51 ORI 10-20 125 26 24 43 52 1240 0,19 1,03 3,23 1,05 2,37

ORI 10-55 114 18 21 31 45 1159 0,15 0,46 3,02 1,06 2,52 ORI > 60 124 30 25 45 54 1247 0,22 1,14 3,23 1,08 2,56

Values lim.

150 100 120 120 150

CRM TILL 1 117 <dl 38 49 80 1424 1,11 1,72 4,66 2,08 1,52 Cerified value 98 22 24 47 65 1420 1,29 1,94 5,30 2,01 1,84

ORIGINAL SOIL CHARACTERISATION

ORIGINAL SOIL depht cm 0-10 20-30 0-55 >60

ng/g d.w. ng/g d.w. ng/g d.w. ng/g d.w.

PCBs 9,7 7,9 5,0 4,8

PHAnaftalene 2,8 3,7 3,2 2,3acenaftilene 2,1 1,8 <0,1 <0,1acenaftene 0,8 <0,1 <0,1 <0,1fluorene 1,9 <0,1 <0,1 <0,1fenantrene 6,9 5,9 6,3 2,8antracene 0,8 0,5 0,4 0,1fluorantene 9,2 12,6 7,7 0,8pirene 7,7 10,8 6,7 0,5B(a)antracene 4,7 5,7 3,3 0,4Crisene 9,7 10,3 7,5 0,1B(b+kj+k)fluorantene 22,3 23,7 18,9 1,1B(a)pirene 9,8 11,4 8,4 0,3Indenopirene 10,2 9,6 8,5 0,4Db(ah)antracene 2,2 2,1 1,4 <0,1B(ghi)perilene 10,1 9,8 8,4 0,5

total PHAs 101,2 108,0 80,8 9,2

cm

L Streptomyces aurantiacogriseus A1 Streptomyces sp. A6 Streptomyces peucetius A7 Streptomyces sp. H Streptomyces sp. A8 Streptomyces setonensis

F Streptomyces phaeochromogenes E Micromonospora sp.

SL3 Nocardioides sp. A5 Aeromicrobium erythtreum

K Mycobacterium sp. G Nocardia sp.

X Gordonia sp. SL2 Rhodococcus erythropolis

LAM18 Rhodococcus erythropolis LAM19 Arhtrobacter sp. LAM22 Arhtrobacter sp.

U Microbacterium sp. W Microbacterium oxydans

A Brevibacillus brevis B Brevibacillus brevis

Y Paenibacillus sp.

SL8 Bacillus licheniformis D Bacillus megaterium

N Bacillus mycoides Q Bacillus cereus

OSS31 Paenibacillus polymixa LAM23 Exiguobacterium sp. OSS42 Bacillus subtilis

LAM30 Bacillus cereus T Porphyrobacter donghaensis

S Massilia sp. SL5 Duganella nigrescens

LAM29 Delftia tsuruhatensis A2 Stenotrophomonas sp.

A4 Pseudomonas sp. LAM9 Pseudomonas resinovorans LAM33 Pseudomonas fluorescens

LAM1 Pseudomonas jessenii Z Flavobacteriales bacterium

0.05

Actinobacteria Bacilli β-proteobacteria γ-proteobacteria Flavobacteria

TIME � 0�

T 0 CTR DM B DB DBM

Rhodococcus

Arthrobacter

Bacillus licheniformis

Bacillus cereus

Delftia

Survival of the �microbial formula�

104 �days �

Psedomonas

C17 / PRISTANE

C18 / PHITANE

DM 1 1,2

DB 1,2 1,5

DBM 1,8 2

Residual Diesel Hydrocarbons

0

25

50

75

100

C14

C15

C16

C17

prist

ano

C18

fita

no

C19

C20

C21

C22

C23

C24

UMC

%

DM time 0 DM 104 days

Layer 0-20 cm

Residual Diesel Hydrocarbons

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

C14

C15

C16

C17

prist

ano

C18

fita

no

C19

C20

C21

C22

C23

C24

UMC

%

DM 104 days DB 104 days DBM 104 days

Leachate 5 min/tot

Leachate 60 min/tot

% % DM t0 33 37 DM 104 days 34 35 DBM 104 days 40 40

Pinto V., Cremisini C., Atti del convegno EGU 2008, Vienna, 13-18 aprile 2008. �

Bioavailability of metals

Conclusions �

. �

• The tailor-made Microbial formula tested for Biodegradation of organic pollutants in the presence of heavy metals showed to survive and to be effective in biodegradation of diesel

• The native microbial communities developed in aged heavy metals pollutions can come to the rescue of co-contaminated environmental matrices.

• The strategy of using tailor-made consortia, which link functionally the in situ microbial community structure with relevant chemical parameters, seems to be a promising avenue towards a rational selection of effective inocula for bioremediation applications

• This way a serious limiting factor in bioremediation technology of co-contaminated matrices can find a solution.

. �

CONCLUSIONThe tailor-made Microbial formula tested for Biodegradation of organic pollutants in the presence of heavy metals showed to survive and to be effective in biodegradation of diesel

The native microbial communities developed in aged heavy metals pollutions can come to the rescue of co-contaminated environmental matrices.

The strategy of using tailor-made consortia, which link functionally the in situ microbial community structure with relevant chemical parameters, seems to be a promising avenue towards a rational selection of effective inocula for bioremediation applications

This way a serious limiting factor in bioremediation technology of co-contaminated matrices can find a solution.

Consortium ENEA-CAR Pseudomonas, Enterobacter, Pantoea, Bacillus, Acinetobacter, Comamonas, Staphylococcus, Shewanella

Biofilm on coal ESEM

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80

TIME (hours)

% r

esid

ue

4-cloro-3-metil-fenolo C27 polietossilati

Residue %

+ Cr (60 ppm)

Resistant to Cr VI (250 ppm)

TANNERY WASTEWATERS�

•  Isolation of microbial communities native to co-contaminated matrices and selection of strains resistant to heavy metals �

•  Test for active (or inducible ) metabolism towards organic pollutants�

•  Tailored Microbial Formula: �Use of the strains in form of consortium for degradation of organic pollutants in the presence of heavy metals � � Use of PGP in association with plants �

Target Selected strategy �

•  Co-contamination ��Biodegradation of organic pollutants in the presence of heavy metals ��•  Heavy metals���

�serious limiting factor in

bioremediation technology�

Using  MicroBes  for  the  REgula5on  of  heavy  metaL  mobiLity  at      ecosystem  and  landscape  scAle:  an  integra5ve  approach  for  soil      remedia5on  by  geobiological  processes    

       

h#p://www.umbrella.uni-­‐jena.de/cms/index.php    

FP7-­‐  THEME  3.1.2.  ENV.2008.3.1.2.1  :  Recovery  of  degraded  soil  resources  Coordinator:  Professor  Erika  Kothe,  FS  University  of  Jena,  Germany      

Grant  agreement  no.:  226870  2009-­‐2012  

• FSU Jena�• Forschungszentrum Dresden-Rossendorf ��

• ENEA - Casaccia�• University of Cagliari�• VIROTEC, SME �

• Bangor University�• Aberystwyth University�

• Lulea University of Technology�• Orebro Universitet �

• University of Bucharest �

• Jagiellonian University,Krakow �•  Kwazar, City Council of Chrzanó �

• University of Vienna�• AGES�

• University of Valladolid �

�Kopparberg, Sweden� Cwmystwyth, Wales�

Trzebionka, Poland�

Zlatna Rosia, Romania�

Ronnenburg, Germany, �

Ingurtosu, Sardinia�

Pb  and  Zinc  since  Bronze  age  

Cu,  Fe,Pb  and  Zn  sulphide  Since    13th  century  

Zn-­‐Pb  ores      20th  century  

Zn-­‐Pb  ores    During  18th  century  Hll  1968  

etherogeneous  ,  Cu  

Former  Russian  Uranium  mine  

• Il  suolo  può  essere  considerato  essenzialmente  come  una  risorsa  non  rinnovabile  dell'Unione  Europea,  per  un  totale  di  circa  400  milioni  di  e#ari.  

• Il  degrado  del  suolo  è  un  problema  acuto  in  Europa  e  il  costo  sHmato  potrebbe  ammontare  a  38  miliardi  di  euro  all'anno.    

• Nella    UE  la  superficie  di  suoli  influenza5  da  a^vità  minerarie  è  stata  s5mata  pari  allo  0,6%,  rispeao  a  una  media  mondiale  dello  0,2%.    

• La  bonifica  di  queste  aree  è  un  obie^vo  strategico  per  le  poli5che  europee.    

• Sono  richieste  tecnologie  prome#enH  su  scala  di  ecosistema  che  devono  garanHre  il  recupero  dell'uso  del  suolo,  con  un  impa#o  posiHvo  sui  sistemi  fluviali  a  valle,  comprese  le  vie  d'acqua  internazionali  (corsi  d'acqua  e  il  mare).    

PROBLEMATICA  

 Il  ripris5no  può  essere  oaenuto  aaraverso  l’a#enuazione  naturale,  che,  tuaavia,  è  estremamente  lenta.  In  realtà,  ambien(  contamina(  da  metalli  soffrono  in  generale  di  bassa  a2vità  microbica,  mo5vo  per  cui  il  biorisanamento  può  essere  difficile  da  implementare  nelle  ex-­‐miniere.   Le  possibilità  dei  microorganismi  di  accelerare  le  reazioni  chimiche  nell’ordine  di  106  dimostra  che  vi  è  un  enorme  potenziale  di  miglioramento  

Il  ruolo  che  possono  giocare  i  microrganismi  nella  fitoestrazione/stabilizzazione    dei  metalli  è  ancora  soaovalutato   Di  solito  la  bonifica  è  s5mata  solo  su  scala  di  sito,  mentre  il  rischio  per  altri  compar5  ambientali  (es:  acqua,  fauna  selva5ca)  si  verifica  sia  a  livello  di  sito  che  su  scala  di  ecosistema  tramite  dispersione  fluviale   I  parametri  geologici,  mineralogici  e  geomorfologici  che  influenzano  la  distribuzione  dei  metalli  sono  indaga5  a  livello  di  sito  o  di  bacini  limitrofi,  e  non  sono  correla5    all’impaao  che  gli  affluen5  possono  avere  a  valle,  sull'ambiente  cos5ero  e  marino.   Vi  è  una  mancanza  di  modelli  matema5ci  applicabili  a  livello  europeo  riguardo  il  risanamento  di  si5  contamina5  da  metalli.  

Carenze  delle  tecniche  a#uali  

OLTRE  LO  STATO  DELL’ARTE:    l’idea  di  Umbrella    

Individuare    appropriaH  ceppi  di  microrganismi  naHvi  di  siH  minerari  europei  e    uHlizzarli  in  combinazione  con  specie  botaniche  per  o^mizzare  processi  di    fito-­‐estrazione  o  di    fito-­‐stabilizzazione,     Messa  a  punto  di  metodologie  per  la  cara#erizzazione  del  rischio  geochimico  dovuto  alla  mobilità  dei  metalli,    integrando  a  livello  di  ecosistema,  per  valutare  l'efficienza  di  un    biorisanamento  migliorato  dall’uso  di  microrganismi  appositamente  seleziona5   Produzione  di  modelli  matemaHci  dell'ecosistema  chiave    e  dei  processi  rilevanH  per  la  valutazione  del  rischio  e  per  la  bonifica,  su  scala  di  ecosistema,    con  applicabilità  Europea.  

Fornire  agli  uten5  finali  “tool-­‐boxes”  per  tecniche  di  bonifica  in  situ  efficaci,  economiche  e  rispeaose  dell'ambiente,  basate  sulle  conoscenze  generali  delle  interazioni  piante-­‐microrganismi  :    

 

1.   microrganismi  e  piante    

2.    un  approccio  metodologico  

3.    modelli  predi^vi  

Obie^vi  

             

WP1  Microbiologia  

 • Cara#erizzazione  delle  comunità  microbiche  

• Sviluppo  di  consorzi  microbici  PGP    e  Micorrize  • Frazionamento  degli  isotopi  per  seguire  l'assorbimento  di  metalli  nei  sistemi  vivenH  

WP  2:    Botanica  

 • Regolazione  assorbimento  radicale  dei  metalli  e  trasferimento  nella  pianta  

• Mappatura  delle  comunità  botaniche  

• Speciazione  dei  metalli  nel  suolo  e  nelle  piante  

WP  3:    Geochimica  

 • Idrogeochimica  dei  siH  sperimentali                •   Ciclo  suolo-­‐pianta  dei  metalli    

•   Processi  di  mobilizzazione  eimmobilizzazione  dei  metalli  

• Mineralogia  dei  precipitaH    

• Biomineralizzazione  

WP 4: Modellazione • Produzione di modelli matematici biochimici/ecotossicologici

• Tool-box per decisori Per esplorare scenari di risanamento sulla protezione delle acque e della biodiversità a livello di bacino

WP 5-7: Trasferimento

• Campi sperimentali

• Linee-guida

   

WP  6—8        

Procedura per lo screening e la selezione di piante e consorzi microbici endemici per la realizzazione di un processo di fitorisanamento assistito

Phytoremediation strategiesBioaugmentation: use of Plant Growth-

Promoting Bacteria (PGPB)

Interactions between metals and microorganisms

Lebeau et al. (2008) Environmental pollution, 153, 497–522

  IT   POL   UK   GER   ROM   SW  

Microbial load (CFU/g soil-1)  

9 x106   3 x106   2,7 x107   1 x106   1 x107   1 x106  

N° of Colony morphotypes  

41   33   42   18   21   22  

N2 fixer (%)   90   82   76   78   62   50  

PO4 mobilizer (%)   44   64   48   42   50   34  

Siderophore producer (%)  

63   58   45   89   43   59  

Phytohormone producer (%)  

32   33   24   22   67   55  

Soil-extract (metal)resistant (%)  

54   91   62   72   67   64  

N2 fixing

PO4 mobilisation

Siderophores

Phytohormones

Metalt R

Ingurtosu Trzebionka Ystwyth

Wismut Zlatna Kopparberg

100%

IT   RO     GER   POL   SW   UK  

42 65 71 100 90 90

Diversità funzionale dei suoli di miniera

Diversità funzionale dei suoli minerari espressa come % di utilizzo dei substrati contenuti nelle ECOPlates Biolog

ITALY P

mobilisation N2 fixation

Siderophores IAA Heavy Metals tolerance

Ingurtosu Consortium Halo Growth halo

Halo zone

Pink-purple Ni Cd Cu Zn Pb

Phylogenetic affiliation based on 16S r-RNA sequence

16S Nucleotide seq GenBank accession

numbeR

PVK AzM ARA

CAS Na

DF+ Tryp+SR mM mM mM mM mM

UI2 Pseudomonas sp. Gammaproteobacteria BankIt1542646 UI2 JX133196 + + + + * + 20 5 5 20 10

UI3 Stenotrophomonas maltophilia Gammaproteobacteria

BankIt1542646 UI3 JX133197 - + + * +/- 10 2,5 2,5 20 5

UI4 Rhizobium sp. Alphaproteobacteria BankIt1542646 UI4 JX133198 - + + * ++ 10 2,5 2,5 10 10

UI6 Niabella sp. Sphingobacteria BankIt1542646 UI6 JX133200 - + + * + 10 2.5 2,5 10 10

UI7 Curtobacterium flaccumfaciens Actinobacteria

BankIt1542646 UI7 JX133199 + + + * +/- 10 2,5 5 10 10

UI9 Streptomyces ambofaciens Actinobacteria

BankIt1542646 UI9 JX133201 +/- + + + * + 2,5 2,5 1 20 10

UI18 Streptomyces sp. Actinobacteria BankIt1544494 UI18 JX171076 + + + * - 2,5 2,5 2,5 20 10

UI24 Planctibacter flavus Actinobacteria

BankIt1542646 UI24 JX133202 + + + * + 10 2,5 5 20 10

UI27 Niabella sp. Sphingobacteria sequence as UI6 - + + * + 20 5 5 20 10

UI28 Bacillus cereus Bacilli BankIt1542646 UI28 JX133203 + + ++ * + 30 10 5 20 10

!

Selezione dei consorzi promotori di crescita delle piante (PGP)

SPORE di AMF ISOLATE e IDENTIFICATE DALLE PIANTE DEL SITO DI INGURTOSU (Sardegna)

Trap cultures (Plant species)

AMF species

Cistus monspeliensis Glomus constrictumRanunculus bullatus Glomus sp.Festuca sp. Gennamari Not identifiedEuphorbia characias Not identifiedHelichrysum italicum Not identifiedRosmarinus officinalis Not identifiedPtilostemon casabonae Glomus irregulareFestuca sp. Not identifiedCarlina carymbosa Not identifiedTrifolium sp. Glomus fasciculatumHelichrysum sp. GENNAMARI

Not identified

Substratum from GENNAMARI

Glomus sp.Fonte: prof. Katarzyna Turnau, UNI Cracovia.

Fonte: prof. Irene Lichtscheidl. UNI Vienna.

Scelta delle piante

Fonte: Anja Grawunder UNI Jena

INGURTOSU

Percorsi di scarico identificati nel bacino idrografico di Ingurtosu, all’interno del quale si trova il sito sperimentale dove è in corso un’applicazione di fitorisanamento assistito con microrganismi. . Un simile modello è stato definito per ogni sito minerario di UMBRELLA (fonte: Giovanni De Giudici, rapporto scientifico UMBRELLA).

MOBILITA’ DEI METALLI PESANTI

SITO DI INGURTOSU

Fonte: G. DE Giudici UNI Cagliari

Integrando i dati é stato sviluppato un modello biogeochimico, riscrivendo il software CESAR- TRACER per poter eseguire l’integrazione tra scale crescenti, dalla scala di campo fino a livello di bacino, al fine di collegare le misure di bonifica locali con le loro conseguenze sul piano regionale.SITI: Ampoi river (Romania), Naracauli river (Sardinia), and Ystwyth river (Wales).

MODELLAZIONEper sviluppare uno scenario per futuri trattamenti di risanamento

Un modello concettuale per la bonifica su scala di bacino.

SERRA CAMPO

6 piante x 6 suoli+ consorzio nativo PGP

Sito di Ingurtosu: Euphorbia pythiusa + consorzio PGP nativo

Campo sperimentale

Campo sperimentale di Ingurtosu

Strain CODE

Phylogenetic affiliation based on r-RNA 16S sequence SIM%

GenBank accession number

P mobilisation N2 fixation Siderophores IAA MMSE

Heavy Metals tolerance Halo Growth halo Halo zone Pink-purple Ni Cd Cu Zn Pb PVK AzM ARA CAS Na DF+ Tryp+SR mM mM mM mM mM

UI2 Pseudomonas sp. 99 JX133196 + + + + * + + 20 5 5 20 10 UI3 Stenotrophomonas maltophilia 99 JX133197 - + + * +/- +/- 10 2,5 2,5 20 5 UI4 Rhizobium sp. 99 JX133198 - + + * ++ + 10 2,5 2,5 10 10 UI6 Niabella sp. 96 JX133200 - + + * + + 10 2.5 2,5 10 10 UI7 Curtobacterium flaccumfaciens 99 JX133199 + + + * +/- + 10 2,5 5 10 10 UI9 Streptomyces ambofaciens 98 JX133201 +/- + + + * + + 2,5 2,5 1 20 10 UI18 Streptomyces sp. 99 in progress + + + * - + 2,5 2,5 2,5 20,0 10,0 UI24 Plantibacter flavus 99 JX133202 + + + * + + 10 2,5 5 20 10 UI27 Niabella sp. 96 similar to UI6 - + + * + + 20 5 5 20 10 UI28 Bacillus cereus 100 JX133203 + + ++ * + + 30 10 5 20 10

Consorzio batterico UI con proprietà PGP ��

Rosmarinus officinalis , Ranunculus bullatus and Carlina corymbosa; in Asphodelus cerasiferus , Ptilostemon casabonae, Cistus salvifolius, Trifolium sp. and H. italicum

Micorrize arbusculari

 

BIOAUGMETATION �

FIELD TRIAL UMBRELLA �

DOPO INOCULO�

ATTIVITA’ MICROBICA DEL SUOLO �

START Ottobre 2011 ��

FIELD TRIAL UMBRELLA �

DOPO 5 MESI �����

E. pithyusa ha la capacità di assorbire MP (metallofita) nella parte aerea della pianta �

ATTIVITA’ METABOLICA DEL SUOLO �

ASSORBIMENTO DI METALLI PESANTI

CONCLUSIONI FIELD-TRIAL UMBRELLA E. pithyusa ha la capacità di assorbire MP (metallofita) nella parte

aerea della pianta

La presenza di Viromine™ha portato ad una riduzione della biodisponibilità per Zn e Cd con riduzione di assorbimento

L’introduzione di E. pithyusa migliora l’attività metabolica del suolo anche senza bioaugmentation

La presenza del consorzio UI migliora ulteriormente la qualità del suolo espandendo la diversità funzionale e specialmente la

affinità per gli essudati plantari

E. pithyusa + Consorzio UI sono compatibili e capaci di stabilire una associazione e possono agire come “tool box”

Strategie di fitorisanamento assistito da microrganismi promotori di crescita delle piante

Progetto SMERI “Sviluppo di MEtodologie per la progettazione di interventi di

bioRImedio”

0  

10  

20  

30  

40  

50  

60  

70  

Sopravvivenza  di  Euphorbia  p.  %  

0  

20  

40  

60  

80  

Percen

tage  

0  

100  

200  

300  

400  

500  

600  

700  

0   2   4   6   8   10   12   14   16   18   20  

AWCD

 (OD)  10  3  

incubaHon  Hme  in  Biolog  ECOPlates  (day)    

Bacteria  

VM  

VM+Myc    

VM+Bact  

Bact+  Myc  

Control  

Myc  

ATTIVITA’ METABOLICA DEL SUOLO �

�SMERI �

�Giugno 2014�

�

A distanza di 2 anni e mezzo i parametri permane un effetto positivo di una sola applicazione di bioaugmentation con il consorzio batterico UI

PROSPETTIVE

Associazione di piante: E.pythiusa+ Juncus maritimus

Bioaugmentation ion progress……………

Bioprospezione di siti minerari attraverso l’Europa per lo sviluppo di strategie di fitorisanamento

assistito da batteri-PGP

L'importanza  che  la  funzione  dei  microrganismi  riveste  a  livello  planetario    richiede  con  urgenza  che  le  nostre  conoscenze  siano  accresciute  insieme  alla  nostra  capacità  di  sfruaamento      

Pertanto,  ogni  occasione  di  bioprospezione  contribuisce  a  colmare  alcune  par5  nel  mosaico  della  biodiversità  microbica.    

Il  progeao  UMBRELLA  (Using  MicroBes  for  the  REgula5on  of  heavy  metaL  mobiLity  at  ecosystem  and  landscape  scAle:  an  integra5ve  approach  for  soil  remedia5on  by  geo-­‐bio-­‐logical  processes)  ha  offerto  l’occasione  per  la  ricerca  di  PGP  in  6  diversi  si5  minerari  distribui5  aaraverso  l’Europa.  

Un quadro completo di una attività bioprospezione comporterebbe una serie di diverse lenti di osservazione. In questo lavoro, bioprospezione è presentato dal prospettiva del progetto UMBRELLA  

 L’obie2vo  finale    

del  proge9o:  sviluppare  un  approccio  integrale  per  il  risanamento  di  suoli  influenza4  da  a5vità  minerarie  usando  microrganismi  in  associazione  con  le  piante.    

della  bioprospezione  stabilire  sei  consorzi  ba8erici,  uno  per  ogni  sito  di  prova,  oaenu5  raggruppando  i  migliori  baaeri  PGP  isola5  dal  suolo  na5vo,  da  impiegare  successivamente  come  agen4  di  bioaugmenta4on    in  prove  di  campo.    

Il  proge#o  ha  impa#ato  ambiH  disciplinari  correlaH,  ed    in  parHcolare  la  biodiversità.  Questa  parte  del  lavoro  descrive  la  frazione  col5vabile  della  biodiversità  microbica  na5va  di  sei  si5,  differen5  per  caraaeris5che    geografiche,  clima5che  e  geochimiche,  ma  simili    per  essere  sogge^  a  stress  cronico  da  metalli  pesan5    

Conservazione ex-situ

I microrganismi di questi biotopi hanno attuato strategie adattattive come risposta a condizioni di vita critiche (stress cronico), che li rendono potenziali candidati per lo sfruttamento biotecnologico e potrebbero rappresentare potenziali soluzioni per le stesse aree danneggiate.

Anche per questo motivo, tale biodiversità merita di essere preservata

Come chiaramente dichiarato nel testo della convenzione internazionale sulla diversità biologica, le collezioni ex situ di microrganismi derivanti da siti inquinati, così come dai vents delle profondità marine, da ambienti ad alta alcalinità, da deserti caldi e freddi, costituiscono una risorsa essenziale per il futuro, poiché la complessità dei microrganismi unicellulari (replica molto veloce e adattamento veloce), rendono difficile eseguire la loro conservazione in situ

Diversità  funzionale    dei  suoli      oaenuta  aaraverso  l’analisi  del  profilo  fisiologico  a  livello  di  comunità  (CLPP  -­‐  BIOLOG  Ecoplates™)        

Diversità  ba9erica    oaenuta  aaraverso  •   l’analisi  filogene5ca  eseguita  sulla  base  

delle  sequenze  parziali  del  gene  16S-­‐rRNA  dei  ceppi  isola(  

 •  L’analisi  metagenomica  del  DNA  totale  dei  

sei  suoli  (Illumina)  �

In relazione ai parametri geo-chimici del

substrato

Parametri  del  suolo  

BIODISPONIBILITA’  

DIVERSITA’  FUNZIONALE  DEL  SUOLO  ECOPlates  –BIOLOG  TM  

IT   RO     GER   POL   SW   UK  42% 65% 71  % 100  % 90  % 90  %

  IT   POL   UK   GER   ROM   SW  Microbial load (CFU/g soil-1)  

9 x106   3 x106   2,7 x107   1 x106   1 x107   1 x106  

N° of Colony morphotypes  

41   33   42   18   21   22  

N2 fixer (%)   90   82   76   78   62   50  

PO4 mobilizer (%)   44   64   48   42   50   34  

Siderophore producer (%)  

63   58   45   89   43   59  

Phytohormone producer (%)  

32   33   24   22   67   55  

Soil-extract (metal)resistant (%)  

54   91   62   72   67   64  

DIVERSITA’ DELLA PORZIONE COLTIVABILE

N2 fixing

PO4 mobilisation

Siderophores

Phytohormones

Metalt R

Ingurtosu Trzebionka Ystwyth

Wismut Zlatna Kopparberg

100%

La biodiversità coltivabile è stata analizzata a livello di phylum, classe e genere attraverso indici ecologici e analisi multivariata

p  IT c POL WAL< GER n ROM rSWE

Circa 200 morfotipi fc isolati66% Gram+

4 principali phyla47 generi99 specie

.

Fonte: Sprocati et al. Environ Sci Pollut Res (2014) 21:6824–6835

At species-level, Shannon’s index (alpha diversity) and Sørensen's Similarity (beta diversity) indicates the sites are indeed diverse.

L’analisi multivariata dei fattori chimici del suolo e della biodiversità individua per ciascun sito alcuni fattori chimici e alcune specie ben discriminanti

L’analisi multivariata sostiene l’ipotesi che la biodiversità coltivabile dei sei siti minerari presenta, a livello di phylum, una convergenza correlata a fattori del suolo piuttosto che a fattori geografici, mentre, a livello di specie, riflette una notevole caratterizzazione locale

L’analisi comparativa della biodioversità molecolare dei sei siti è in corso (Illumina)

Per il sito italiano di Ingurtosu è disponibile l’analisi molecolare della comunità microbica, ottenuta mediante una libreria clonale di rRNA16S, sia per Eubatteri che Archaea

ARCHAEA N Uncultured archaeon clone UMV3A164 52 Uncultured archaeon clone Elev_16S_arch_961 50 Uncultured archaeon clone TX1C10 46 Uncultured archaeon clone sw-A333 16S 11 Uncultured crenarchaeote clone REF_A_48 7 Unidentified archaeon 16S rRNA gene, clone 218 1 Uncultured archaeon clone Amb_16S_arch_1427 1 Uncultured archaeon clone YMar-C232 2 Uncultured archaeon clone YMar-F25 1 Uncultured archaeon clone Amb_16S_arch_1394 1 Uncultured crenarchaeon, clone FJQFA13 1 Unidentified archaeon clone REF_E_1 1

Total 174

!"#$%&$'()*+'#,+(-"*#%-"(

!./01234!"#$%&$'()*+'#,+(-"*#%-"(

5%(672387+'#,7932!"#$%&$'()*+'#,+(-"*#%-"(

:;2<2=!"#$%&$'()*+'#,+(-"*#%-"(

>?@1000*238!"#$%&$'()*#'("+'#,+(-&(

#%-"(*A5B7174C!"D)("&DED()*+'#,+(-"*238

'AF1*G("(H*#%-"(*I2C!"#$%&$'()*+'#,+(-"*#%-"(

1JK72387+'#,724IL!"#$%&$'()*+'#,+(-"*#%-"(

M.+'@<I0I*!"#$%&$'()*+'#,+(-"*#%-"(

M.+'@BIN!"#$%&$'()*+'#,+(-"*#%-"(

1JK72387+'#,72094!"#$%&$'()*#'("+'#,+(-"H

#%-"(*BOPB120!"D)("&DED()*+'#,+(-"

#%-"(*A5B7572

!"#$%&"'(")*+,-*'.+(-

/+0*,

1(+)*

2(''*)$'&"*3*)(-

4()*

5$*"&,

5+&%&0+(6$

/7$3&

/7)$"&

2*''*

EUBACTERIA N Environmental samples 130 Alfa 42 Delta 18 Gemmatimonadates 21 Beta 11 Ciano 4 Cloroflexi 8 Acido 15 Actino 6 Gamma 3 Total 258

INGURTOSU  SOIL  CLONE  LIBRARY  (rDNA16  S)    

GRAZIE PER L’ATTENZIONE �

Roma, Castel Sant’Angelo �