In Seok Song, Soon-Suk Kang, Eun-Soon Kim, Hyun-Min Park, Chul Young

Choi, Hungwon Tchah, Jae Yong Kim

Heat shock protein 27 phosphorylation is

involved in epithelial cell apoptosis as well as

epithelial migration during corneal epithelial

wound healing

Ana María Gutiérrez T.

Simón Hoyos P.

Medical students

III Semester

2014

INTRODUCTION

CHAPERONES

Was discovered like heat

shock protein.

Its synthesis increases

with the high temperature.

Required for appropriate

unfolding, transport,

folding and degradation of

proteins.

Prevent protein

aggregation before folding

ending.

Increases the folding

velocity.

APOPTOSIS

Programmed cell

death.

Normal, clean and

tidy process

Removed cells with

genetic damage,

infected or old.

Can be activated for

internal or external

stimulation.

CORNEA

Transparent front part of

the eye.

Covers the iris, pupil,

and anterior chamber.

Functions: protection,

transmission and refraction.

Has 5 layers:

• Corneal epithelium

• Bowman's layer

• Corneal stroma: 90%

• Descemet's membrane

• Corneal endothelium

HSP27

Is a chaperone of the sHsp group

ATP-independent chaperone

Functions:

• Chaperone activity

• Thermotolerance

• Inhibition of apoptosis

• Regulation of cell development

• Cell differentiation

• Implicated in architecture of the cytoskeleton

• Cell migration

• Cell survival

• Tumor progression.

INTEGRATION

HSP27 is a chaperone who protects in a

stress situation, inhibiting the apoptosis

and activating the cell migration in human

corneal epithelial cells

GENERAL OBJECTIVE

GENERAL OBJECTIVE

Found the exactly role of HSP27

phosphorylated for the wound healing on

human corneal epithelial cells by certain

series of molecular methods that

demonstrate specificity for the apoptosis

and migration process

MATERIALES Y

MÉTODOS

MATERIALES Y

MÉTODOS

LINEA CELULAR:• Es un cultivo celular

transferido o subcultivado

•Uniforme y homogéneo

•Podrá ser propagado,

transferido y almacenado

•De fácil manejo

En este estudio se usó

una línea celular de

células epiteliales de la

córnea humana

MATERIALES Y

MÉTODOS

WESTERN BLOT

•También llamado Inmunoblot

•Usada para

detectar proteínas específicas

en una muestra con la

interacción antígeno-anticuerpo

Pasos

1. Extracción y

solubilización de las

proteínas

2. Electroforesis en gel

(SDS-PAGE)

3. transferencia a

una membrana

absorbente

4. Detección de las

proteínas de la membrana

mediante el uso de anti-

cuerpos específicos

MATERIALES Y

MÉTODOS

WESTERN BLOT

Estudiar la presencia de

la proteína en el extracto

y analizar su cantidad

relativa respecto a otras

proteínas.

Para la visualización de

las bandas de interacción

antígeno-anticuerpo se

usó reactivos de

quimioluminiscencia

En el estudio se usó para

medir la expresión de

HSP27 después de le

lesión en las células

epiteliales de la córnea

humana

MATERIALES Y

MÉTODOS

TRANSFECCIÓN

Introducción de ADN

foráneo dentro del núcleo

de una célula eucariota

mediante plásmidos,

vectores víricos u otros

Se lleva a cabo al abrir

poros transitorios en la

membrana plasmática

para permitir paso de

material genético

En el estudio se usó para

introducir siRNAs-HSP27

específica y siRNAs de

control en las células

epiteliales de la córnea

humana, mediante

lipofección

MATERIALES Y

MÉTODOS

WESTERN BLOT DE TRASFECCIÓN

Este método se usó para

determinar el papel de

HSP27 en la

sobrevivencia celular.

MATERIALES Y

MÉTODOS

MIGRACIÓN CELULAR

Mecanismo por el cual la

célula se moviliza en

forma activa en

condiciones in vivo o in

vitro.

Utiliza como soporte

componentes de la

matriz extra celular, otras

células o sustratos no

biológicos.

Se da en la formación de

tejidos en el desarrollo

embrionario,

cicatrización y

la respuesta inmune.

En el estudio se midió

mediante fotografías en

puntos específicos para

cuantificar el número de

células en la migración de

las áreas lesionadas de las

células del epitelio cornea.

MATERIALES Y

MÉTODOS

MICROSCOPÍA CONFOCALTécnica de imagen

utilizada para incrementar

el contraste de las

fotografías, para

reconstruir imágenes en

tercera dimensión con una

resolución mayor.

En el estudio se usó

para analizar los

filamentos de actina y

su citoesqueleto.

MATERIALES Y

MÉTODOS

CITOMETRÍA DE FLUJO

Tecnología compleja, de

gran especificidad, que

permite analizar una

población celular.

Proporcionando gran

variedad de parámetros

como el recuento y

clasificación de células

según sus características

morfológicas

En el estudió se utilizó

este método para evaluar

la apoptosis celular.

MATERIALES Y

MÉTODOS

ENSAYO DE PROLIFERACIÓN CELULAR

La proliferación celular se

da en numerosos

procesos fisiológicos y

patológicos como el

crecimiento, la

cicatrización, la hipertrofia,

el desarrollo de tumores

La células en proceso de

proliferación pasan por

ciclo celular, durante el

cual las células se

replican y se dividen en

dos células hijas.

En el estudio de la

proliferación de las

células se midió mediante

densidad óptica, entre

mayor densidad, más

proliferación se había

dado.

RESULTADOS

EXPRESIÓN DE HSP27

LUEGO DE LA HERIDA

EFECTO DEL KNOCKDOWN EN

LA HSP27 EN HCEC LUEGO DE

LA HERIDA

Akt: marcador de supervivencia

celular

Bax: proteína proapoptótica.

MIGRACIÓN CELULAR LUEGO

DE LA HERIDA

INMUNOFLUORESCENCIA-

REORGANIZACIÓN DE LOS FILAMENTOS

DE ACTINA

CITOMETRÍA DE FLUJO

P.A

F.AC.N

Discussion

Jain

PhosphorylatedHSP27 has a role during theearly phase of

the cornealepithelial woundhealing process

Yes

Discussion

Shi and Isseroff

HSP27 can

protectcells

stabilizingactin

filaments

Yes

Discussion

Hedges and Kwon

Phosphorilationof HSP27 is

involved in themediation of cell

migration

Yes

Discussion

Garrido and

Mjahed

WhenHSP27 is

associatedwith stress blocks celldeath and promotessurvival

Yes

CONCLUSIONS

CONCLUSIONS

• HSP27 phosphorylated was increased

after scratch wounding, so this protein is

related with the first steps of epithelial

wound healing.

• It’s very important to improve every day in

the way to induce apoptosis, because it's a

form to fight with cancer.

CONCLUSIONS

• With this discovering, scientists can think in new ways to treat corneal problems and it can revolutionize ophthalmology.

• We can elucidate the importance of molecular biology in medicine, with this research we have an idea of the behavior of proteins involved in specific cellular functions.

MAPA

MAPA

BIBLIOGRAFÍA

•GOMEZ MARÍN,Jorge Enrique; GONZÁLEZ MARÍN, ángel; CASTAÑO

OSORIO, John Carlos; PATARROYO GUTIÉRREZ, Manuela Alfonso. 2011.

Biología molecular: principios y aplicaciones. Medellín, Colombia. Corporación

para investigaciones biológicas. Pág: 423-425,497.

•KARP, Gerald. 2009. Biología celular y molecular: Conceptos y experimentos.

Quinta edición. México D.F, Mexico. Mc Graw Hill. Pág: 139-140,155.

•MARTINEZ SÁNCHEZ, Lina Maria; VARGAS GRISALES, Natalia; TORO

MONTOYA, Andrés; PAMPLONA SIERRA, Ana Paulina; QUEVEDO ORREGO,

Esteban. 2012. Biología molecular. Séptima edición. Medellín, Colombia.Pág

138-140.

•In Seok Songa, Soon-Suk Kanga, Eun-Soon Kima, Hyun-Min Parka, Chul Young

Choib, Hungwon Tchaha, c,Jae Yong Kim. 2014. “Heat shock protein 27

phosphorylation is involved in epithelial cell apoptosis as well as epithelial

migration during corneal epithelial wound healing”. Experimental Eye Research.

Volume 118. pp: 36-41