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Ponencia presentada en el marco de las I Jornadas Científicas del Instituto de Investigación Sanitaria Aragón (8-9 noviembre, 2010. Zaragoza)
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Patología del ensamblaje de la cadena respiratoria mitocondrial: El Complejo III como centro del sistema
Zaragoza, 8 de noviembre de 2010
Erika Fernández-Vizarra BaileyErika Fernández-Vizarra Bailey
Unidad de Investigación Traslacional I+CS. HUMS
Sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS)
457
16
411 13
1 3
2
Subunidades estructuralesSubunidades estructurales
Proteínas codificadas en el DNA nuclear para la biogénesis del sistema
OXPHOS
Factores de replicación del mtDNAFactores de transcripción del mtDNAFactores de traducción mitocondrial + proteínas del ribosoma mtProteínas necesarias para el importeFactores de ensamblaje
Koopman et al. (2010) Antioxid Redox Signal 12, 1431-1470
Factores de ensamblaje asociados con enfermedad mitocondrial
CIA30/NDUFAF1B17.2L/NDUFAF2C3ORF60/NDUFAF3C60ORF66/NDUFAF4C8ORF38C20ORF7ACAD9
SDHAF1
BCS1L
SURF1COX10COX15SCO1SCO2LRPPRCTACO1
ATP12TMEM70
Estudios del ensamblaje del sistema OXPHOS en mamíferos
Lo que sabemos es fundamentalmente gracias al estudio de:� Los procesos en la levadura Saccharomyces
cerevisiae� Los casos patológicos
Estudios del ensamblaje del sistema OXPHOS en mamíferos
Se conoce con bastante detalle el proceso y los factores implicados en el ensamblaje del Complejo IVSe está estudiando activamente el ensamblaje del Complejo I
No se conoce demasiado del ensamblaje de los Complejos II, III y V en mamíferos
Ubiquinol:citocromo c oxidorreductasa (Complejo III)
BCS1L
MT-CYB
UQCRB UQCRQ
Estudio del ensamblaje del CIII
1. Determinar la incorporación de las subunidades estructurales
1. Subunidad codificada en el mtDNA (Cytb)2. Subunidades codificadas en el nDNA
2. Determinar los factores necesarios para el ensamblaje y su papel en el proceso
Subunidad codificada en el mtDNA
Traducción in organello y BNGE: Incubación de las mitocondrias aisladas en presencia de [35S]-L-Met and [35S]-L-Cys / electroforesis nativa
[35S]-L-Met
[35S]-L-Cys[35S]-L-Met
[35S]-L-Cys
[35S]-L-Cys
[35S]-L-Cys
[35S]-L-Met
CI
CV
CIII2
CIV
Blue Native (BN) Gel Electrophoresis
1ª dimensión nativa
CI
CV
CIII2
CIV
2ª dimensión: desnaturalizante
Blue Native (BN) Gel Electrophoresis
CI
CV
CIII2
CIV
1ª dimensión nativa 2ª dimensión: desnaturalizante
Blue Native (BN) Gel Electrophoresis
CI
CV
CIII2
CIV
Separación de las subunidades individuales
1ª dimensión nativa 2ª dimensión: desnaturalizante
Síntesis de proteína in organello.Experimentos de “pulso-caza”
La única subunidad del CIII codificada en el mtDNA
� Mt-Cyb se sintetiza en las mitocondriasaisladas de hígado de ratón y se incorporarápidamente al CIII dimérico (CIII2) maduro
1D native (DDM)
Pulse (45’ label)
2Dde
natu
ring
Chase 45’ Chase 90’
Chase 180’ Chase 270’ Chase 360’
CIII2CV CIV
ND5COICytb
COII/COIII
ND2ND1
ND3ATP6
ATP8
ND5COI
CytbCOII/COIII
ND2ND1
ND3ATP6
ATP8
CIII2CV CIV
Zara et al. (2009) Biochim. Biophys. Acta
1793, 89-96
Bcs1pCbp3pCbp4p
??
Ensamblaje del CIII en S. cerevisiae
Proteínas codificadas en el DNA nuclear
Importe in organello y BNGE: Incubación de las mitocondrias aisladas con los péptidos sintetizados in vitro / Electroforesis nativa
**
*
*
**
CI
CV
CIII2
CIV
Primera dimensión nativa
•Gradiente del gel: 5%→20% Uqcrc1
Cyc1
Uqcrfs1
Uqcrb
Uqcr11
Uqcrh
Uqcrq
Uqcrc2
CICV
CIII2
Uqcrc1
Primeradimensión nativa
/ Segundadimensión
desnaturalizante1D
2D
1D
2D
1D
2D
1D
2D
Uqcrc2
Uqcrfs1 Uqcrb
Cyc1 Uqcr11
SC CIII2SC CIII2
SC CIII2
SC CIII2
1D
2D
1D
2D
Resumen
Subunidades codificadas en el nDNA:� Todas las subunidades se han sintetizado
“in vitro” excepto Uqcr10 (Qcr9p en S.cerevisiae)
� Todas se importan “in vitro” excepto Uqcrh(Qcr6p en S. cerevisiae)
� Una vez importadas, algunas se incorporanal CIII2 en estas condiciones:
• Uqcrc2 (algo)• Uqcrfs1• Uqcrb• Uqcr11
Próximos pasos
Importe in vivo de las subunidades que no se han podido importar in vitro� Estudiar factores necesarios para su
importe/ensamblaje que no están en las mitocondrias aisladas
Determinar composición del complejo(s) en los que se encuentra BCS1L Estudiar la incorporación de las subunidades en casos patológicos� Células de ratón con Cytb mutado� Células humanas con mutaciones en BCS1L
• Si pudiera conseguir células de pacientes con mutaciones en MT-CYB y UQCRB y UQCRQ...
Agradecimientos
Unidad de Investigación Traslacional. I+CS. Hospital Universitario Miguel Servet.UATI Proteómica. I+CS.Universidad de Zaragoza y CNIC (Madrid): Grupo GENOXPHOS.Istituto Neurologico “C. Besta”. Milán (Italia): Dr. Massimo Zeviani.