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I MICROARRAY
E IL LORO UTILIZZO IN DIAGNOSTICA
Elisa MenegattiUniversità di Torino - Dipartimento di Medicina ed Oncologia Sperimentale
I microarray
Linea ordinata di elementi microscopici su di una superficie piana su cui sono immobilizzati acidi nucleici, proteine, cellule o tessuti capaci di riconoscere e legare molecole specifiche.
DNA microarray
Proteinmicroarray
Cellmicroarray
Tissuemicroarray
DNA microarray
DNA microarray (gene chip, DNA chip, o biochip) è costituito da una collezione sonde (DNA o oligonucleotidi) depositate in una posizione nota su un supporto a formare una microgriglia (da cui il nome microarray) che consente di identificarle in modo univoco.
Il supporto può essere di vetro, plastica o siliconico
100 - 1 million DNA probes in 1 cm2
Dimensioni degli spot da 15 a 350 micron
Principio: appaiamento delle basicomplementari
• espressione genica
• genotipizzazione
• valutazione di delezioni, duplicazioni, riarrangiamenti
• profilo di metilazione
• analisi di micro-RNA
Vengono utilizzati per:
• 2007 = 6517• 2006 = 6236• 2005 = 4406• 2004 = 3509• 2003 = 2421• 2002 = 1557• 2001 = 834• 2000 = 294
294834
1557
2421
3509
4406
62366517
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
1998 2000 2002 2004 2006 2008
Anni
N° c
itazi
oni P
ubM
ed
Una metodologia promettente…
Punti di forza• numero di informazioni disponibili con un’ unico esperimento• miniaturizzazione
• Produzione dell’ array• Marcatura del campione• Ibridazione• Rilevazione del segnale (scan, imaging)• Analisi dei dati
Fasi analitiche
1. PRODUZIONE DELL’ ARRAY
• Per deposizione (cDNA, oligonucleotidi)
• Fotolitografia (oligonucleotidi)
• Ink-jet technology (oligonucleotidi)
SPOTTED MICROARRAY
FOTOLITOGRAFIA
InkJet technology
Marcatura del campione
Ibridazione
Rilevazione del segnale (scan, imaging)
Analisi dei dati
Analisi dell’ immagine
1. Identificazione degli spot (automatica, semiautomatica, manuale)
2. Segmentazione: separa gli spots dal background. Histogram
3. Valutazione dell’ intensità: media o mediana dei pixels rilevati nello spot
4. Correzione del background
Normalizzazione, software dedicati
DIAGNOSTICA
• ANALISI DEI CNV (Copy Number Variants), •pazienti con ritardo mentale•pazienti con dismorfismi•Ricerca di delezioni, duplicazioni, riarrangiamenti
array CGH
• Analisi dei geni espressi
• RICERCA DI MUTAZIONI PUNTIFORMI
• GENOTIPIZZAZIONE (SNP array)• SEQUENZIAMENTO DIRETTO (su array)
SingleNucleotidePolymorphism
array
SNPs analizzabili con un unico assay:
da poche centinaia a 2,3 milioni (distanza minima
raggiungibile 1,5 kb)
Genome-wideassociation studies
SEQUENZIAMENTO DIRETTO
SEQUENZIAMENTO DIRETTOMETODO DI SANGER
ARRAY CON MUTAZIONI CONOSCIUTE
ARRAY SEQUENZIAMENTO
Invest Ophthalmol Vis Sci 2005;46:3355