Upload
fco-javier-alves-ferreira
View
173
Download
3
Embed Size (px)
Citation preview
INMUNOHISTOQUIMICADpto de Anatoma PatolgicaFco Javier Alves Ferreira
Definicininmuno-. (Del lat. immnis). (De inmune).1. elem. compos. Bioqum. y Med. Indica relacin con los mecanismos inmunitarios. Inmunologa, inmunoterapia.histo-.(Del gr. , tejido).1. elem. compos. Biol. Significa 'tejido orgnico'. Histologa, histocompatibilidad.qumico, ca.(del gr. , mezcla de lquidos ). 4. f. Ciencia que estudia la estructura, propiedades y transformaciones de la materia a partir de su composicin atmica.
ESTUDIO ANATOMOPATOLOGICOIHQBMMO
DefinicinEl elemento principal en esta tcnica es:ANTICUERPO
InmunoglobulinasProtenas.IgG, IgA, IgM, IgD, IgE.Dos cadenas pesadas y dos ligeras (kappa y lambda) (2:1).En ratones el 95% son kappa.En individuo la ms abundante: IgG.La primera en aparecer es la IgM (1 sem).En 2 sem predomina la IgG.
Dos tipos de IgIgG (150kD)IgM (900kD)Vida media: 3 semVida media: 4-6 das
Mtodos de visualizacin
Ac policlonalesReaccionan con varios epitopos de un antgeno.
Conejo.Cabra.Cerdo.Oveja.Caballo.Inyeccin de 10-200 g de AgIntradrmicamente o subcutneoIntraperitoneal
Ac MonoclonalesUn clon de clulas plasmticas.Ratones.Elevada homogeneidad.Sin Ac inespecficos.Fcil caracterizacin.Sin variabilidad.Especificidad: El eptopo del antgeno debe ser nico.
Afinidad del AcIntrnseca. Reside en la regin variable.A mayor especificidad mejor afinidad.Funcional.Tiempo requerido para alcanzar el equilibrio con el Ag tisular.El Ac que alcanza una meseta de mxima intensidad de tincin antes tiene ms afinidad funcional.
La unin Ag-Ac es reversible.Evitar altas concentraciones de sal, altas t y pH bajo.Evitar excesivos lavados.
Reactividad cruzadaActividad entre un Ac y dos o ms Ag o viceversa.Anti-lambda con varias Ig.CEA CEA, Ag de Grupo sanguneo y protenas tisulares.Experimental o accidentalmente se inducen cambios en uno o varios eptopos.Reaccin cruzada de Ac contra Ag humanos y de otras especies.
Titulacin del Acptima:La mayor dilucin de un anticuerpo que resulta en la mxima tincin especfica con el menor fondo.Policlonales:1:100 1:2000Monoclonales:1:10 1:1000
IntroduccinEs difcil pensar en una tcnica de mayor impacto en el campo de la AP, especialmente en el diagnstico.
Patologa quirrgica, hematopatologa, citopatologa.
Grfico1
10451996
16401997
15731998
16435556
20067445
19227620
19918116
22439660
240010880
Biopsias IHQ
Cristales
INMUNOHISTOQUIMICA
IHQ 96-05
AOBiopsias IHQCristales
19961045
19971640
19981573
199916435556
200020067445
200119227620
200219918116
200322439660
2004240010880
IHQ 96-05
&L&F&C&D &T&R&P/&N
Biopsias IHQ
Cristales
INMUNOHISTOQUIMICA
2005 mes a mes
BiopsiasCristales
Ene99420
Feb203769
Mar260887
Abr205897
May2151045
Jun156593
Jul169661
Ago1224
Sep
Oct
Nov
Dic
Total13076496
2004 mes a mes
BiopsiasCristales
Ene185983
Feb203848
Mar221882
Abr193749
May187814
Jun1101138
Jul158614
Ago840
Sep73312
Oct1050
Nov1840
Dic193810
Total152310880
Grfico-2000
2952122071831051019285796239241917141084322221111
Javier
Suarez
Nistal
Hardisson
Patron
Gutierrez
Contreras
Larrauri
Burgos
Picazo
Lopez-Barea
Viguer
Morales
Palacios
Rodriguez
Vicandi
Lopez
Pablo
Regadera
Aso
Sanchez
Cabezas
Tejerina
Bancalari
Cuevas
Isabel
Ortega
PATOLOGOS
N CASOS
INMUNO-2000 al da 19-Octubre
Grfico-1999
23918116713911010710098987346201211107655431111111111
Palacios
Nistal
Gamallo
Suarez
Gutierrez
Patron
Ferreira
Contreras
Larrauri
Burgos
Picazo
Lopez-Barea
Morales
Viguer
Lopez
Rodriguez
Vicandi
Alonso
Perez-Alonso
Tejerina
Bancalari
Arturo
Aso
Bustos
Pea
Hens
Jimenez
Martinez
Mies
Orozco
Sierra
PATOLOGOS
N CASOS
INMUNO-99
Inmuno-99-circular
167
239
5
1
1
3
73
1
98
1
100
110
1
1
98
10
20
1
1
12
181
1
107
5
46
7
1
139
4
6
11
INMUNO-99
inmuno-99-horizontal
167
239
5
1
1
3
73
1
98
1
100
110
1
1
98
10
20
1
1
12
181
1
107
5
46
7
1
139
4
6
11
DATOS INMUNO 99 Y 2000
!!!!!!!QUIZAS NO REALES!!!!!!!!
AO 1999AO 2000a 19-10-2000
PATOLOGOCASOSPATOLOGOCASOS
Gamallo167Javier2952981298
Palacios239Hardisson1834112822
Alonso5Aso21903570
Arturo1Bancalari11624648
Aso1Lopez-Barea3921851090
Bancalari3Vicandi101586948
Burgos73Burgos79547378
Bustos1Cabezas2548432
Contreras98Contreras92189162
Pea1Cuevas13010300
Ferreira100Gutierrez10161166
Gutierrez110Isabel11012120
Hens1Larrauri8561378
Jimenez1Lopez831442
Larrauri98Morales190150
Lopez10Nistal20731648
Lopez-Barea20Ortega10170
Martinez1Palacios170180
Mies1Patron1050190
Morales12Pablo4620120
Nistal181Picazo620210
Orozco1Regadera30220
Patron107Rodriguez140230
Perez-Alonso5Sanchez20240
Picazo46Suarez2120250
Rodriguez7Tejerina20260
Sierra1Viguer240270
Suarez13915710280
Tejerina40290
Vicandi60300
Viguer116122
1451
IHQ-patlogo99
IHQ-patlogo99
23918116713911010710098987346201211107655431111111111
Palacios
Nistal
Gamallo
Suarez
Gutierrez
Patron
Ferreira
Contreras
Larrauri
Burgos
Picazo
Lopez-Barea
Morales
Viguer
Lopez
Rodriguez
Vicandi
Alonso
Perez-Alonso
Tejerina
Bancalari
Arturo
Aso
Bustos
Pea
Hens
Jimenez
Martinez
Mies
Orozco
Sierra
PATOLOGOS
N CASOS
INMUNO-99
Elementos clavePatlogo.Tcnico.Mtodos y reactivos.Control de calidad.
Mtodos y reactivosAnticuerpos de calidad.Variedad de mtodos.Kits universales.Peroxidasa y diaminobencidina (DAB).No creas al fabricante hasta validar el anticuerpo en tu propio laboratorio.Se deben validar los ttulos de cada Ac en tu laboratorio.No existe: Ac prediluidos listos para su uso.
Control de calidadVariables pre-IHQComienza en la sala de tallado.2 mm de grosor.Garbage in-garbage out.Decalcificacin (CD43, Ki67, ER y PR).Formol (enmascaramiento antignico). No ms de 24 horas.
Control de calidadVariables pre-IHQDesenmascaramiento antignico.Digestin con proteasas. (tripsina, DNasa, proteinasa K, pepsina, pronasa, ficina HIER (Heat Induced Epitope Retrieval). Recuperacin antignica por calor.Shan-Rong Shi et al. 1991.J Histochem Cytochem 39:741-8.Microondas, estufas, olla a presin Por mecanismo desconocido (Ca2+).EDTA (quelante del calcio).
Control de calidadVariables pre-IHQDesenmascaramiento antignico.Tiempo.Temperatura.pH.No hay ninguna solucin ideal para todos los antgenos:0,1M buffer citrato (pH6).0,1M EDTA (pH8).0,5M Tris buffer (pH10).0,05M glicina-HCl buffer
Control de calidadVariables pre-IHQHIER con microondas.Cada microondas tiene su personalidad. (RT Miller).Cantidad de material dentro del aparato.Olla a presin:Calentamiento uniforme.No se produce ebullicin.Mayor t: 120C.Menor tiempo. (2-9 minutos).
Control de calidadVariables pre-IHQAutoclaves.Baos de agua caliente.Estufas.Ultrasonidos.Etc.
Control de calidadVariables pre-IHQSustitutos del formol.Preparados acuosos.Preparados alcohlicos.Evitar sobrefijacin en formol.Tiempo de espera en alcohol de 70%.Otros fijadores:B5. (Ganglio y MO; exelente morfologa)CD5, CD30, CD23 CD15, kappa, lambdaZenker.Bouin. (formol, acido pcrico y actico).CD5, CD10, Ciclina D1
Control de calidadVariables de inmunotincinNo existe un mtodo standard.Cada laboratorio es diferente.Mtodos de avidina-biotina son los ms usados:Cortes sobre cristales adhesivos.Desparafinar en xilol y rehidratar.Bloquear la peroxidasa endgena. Buffer.Incubar son suero Bloqueante.Buffer.Recuperacin antignica (calor o proteinasa).Buffer.Anticuerpo primario: incubar y lavar en buffer.Anticuerpo secundario: incubar y lavar en buffer.Complejo de deteccin: incubar y lavar en buffer.Reaccin con cromgeno.Contratincin, deshidratar, cubrir y ver.
Control de calidadVariables de inmunotincinAdhesin tisular:Se requiere mtodo de adhesin.Especialmente en tejidos mal fijados.Azul de Elmer, cromo-aluminio, L-lysina o silano.Secado de preparaciones:56-60C durante 1 hora (mejor toda la noche).Microondas:3-4 minutos.Desparafinizacin:Xilol.Omisin de secado y desparafinizacin: calentando las preparaciones en microondas en jarra de Coplin con buffer.
Control de calidadVariables de inmunotincinDes-Zenkerizacin:Para biopsias en B5 o Zenker.Siempre al final del proceso y antes de la contratincin (no antes de la aplicacin del anticuerpo primario).HIER o proteasa.Bloqueo de la peroxidasa endgena.Hemates o neutrfilos.0,3% H2O2 en PBS con 1% azida sdica a temperatura ambiente.Antes del anticuerpo primario. (o despus del 2)
Control de calidadVariables de inmunotincinSuero bloqueante.No en todos los laboratorios.Antes del primario o como diluyente.Suero de la misma especie que produce el Ac o casena.Bloqueo de la biotina endgena.Grnulos citoplsmicos (hgado, rin).HIER (calor) + biotina.0,05% PBS con avidina + 15 min en 0,05-0,2% de biotina en PBS.2 huevos blancos en 200 ml agua destilada.
Control de calidadVariables de inmunotincinDiluyentes de Ac.Buffer con agente estabilizante (BSA).0,05% Tris buffer con 15 mM azida sdica (Sigma S-8032).Buffer de lavado.PBS o TBS. (Tween20).Tween20 (0,2%) y agua destilada.
Control de calidadVariables de inmunotincinAnticuerpo primario.Muy importante.No existe el anticuerpo prediluido listo para su uso.Nunca creas al fabricante en las recomendaciones de dilucin del Ac primario.1:200 1:50.000Cada laboratorio debe determinar sus diluciones de trabajo antes de usarlo para diagnstico.
Control de calidadVariables de inmunotincinDilucin del anticuerpo.Es la principal razn de malos resultados.Identificar falsos positivos y negativos.Antes asegurar el mejor mtodo de recuperacin antignica.1:501:100 --1:200 -- 1:400 -- 1:800
Ej.: 1:2.000.000 para anti-lambda
Control de calidadVariables de inmunotincinDilucin del anticuerpo.Es importante asegurar que los casos negativos sean no reactivos.La mayora de laboratorios no emplean mucho trabajo en titular anticuerpos.Sandwich de tejidos (80 tumores).
Control de calidadVariables de inmunotincinPositivos verdaderos y falsos.Todo lo marrn no es real, ni con el fondo limpio.
Las clulas que contienen el antgeno son heterogneas.Fuerte tincin de membrana.Tincin del ncleo celular.
B5 o Zenker, cidos fuertes.Tincin nucleolar del CD20.Hgado o rin en sistemas avidina-biotina.
Control de calidadVariables de inmunotincinTiempos de incubacin.Temperatura.Refrigerador.37C.La ptima es 25C.Prdida de actividad.Estraptavidina-HRP.
Control de calidadVariables de inmunotincinIncubacin del secundario.Monoespecficos.Multi-link.Complejo de deteccin (ABC).Peroxidasa 4 veces ms sensible que la fosfatasa alcalina.Cromgeno.DAB.Buena tincin de color marrn.Montaje en medio estandar.No se destie con el tiempo.AEC (aminoetilcarbazol).Tincin de color rojo.Montaje en medio acuoso.
Control de calidadVariables post-inmunoSoluciones que mejoran la DAB.Sulfato de cobre.Tetrxido de osmio.Cloruro de cobalto.Contratincin.Hematoxilina (Harris, Gill).Azure B, Giemsa-Hematoxilina (melanina).
Tcnica de inmunohistoqumicaDesparafinar e hidratar en alcoholes decrecientes (100-90-80-70) hasta el agua destilada.Aadir el inhibidor de la peroxidasa endgena e incubar durante 10 minutos.Lavado en agua destilada.Las preparaciones se sumergen en EDTA (precalentado en el microondas) y se meten en la estufa a 150 grados durante 45 minutos: el EDTA se prepara con 800 ml. de agua destilada, 1,5 ml. de EDTA y 2 gotas de ClH; todo ello a pH de 8,2.Lavado en agua destilada.Lavado en buffer Tris a temperatura ambiente.Incubacin con el anticuerpo primario a la dilucin ptima (ver apartado de anticuerpos primarios) durante 30 minutos.Lavado en buffer Tris.Aplicar el anticuerpo secundario conjugado (polmero de Envision) durante 30 minutos.Lavado en buffer Tris.Aplicacin del cromgeno DAB durante 5 minutos: (1 ml. del sustrato nmero 5 del Kit y 1 gota del sustrato nmero 6 del kit).Lavado en buffer Tris.Lavado en agua destilada.Hematoxilina durante 5 minutosLavado en agua destilada.Paso por alcoholes crecientes para deshidratar (70-80-90-100).Xilol y montaje de las preparaciones
PolmerosEnvision (Dako).No usa avidina-biotina.No se necesita bloquear biotina endgena.Combina ac secundario con complejo de deteccin se ahorra un paso.Es caro.
PowerVision (Immunovision Tecnologies).
Variables post-inmunoNo basta con conocer el nombre del Ac.ENE: Enolasa Neuronal Especfica.Uno slo ve lo que conoce.Panel insuficiente. errores diagnsticos.
Control de calidadCon preparaciones multitejido.60-80 tumores diferentes.Para test de Ac nuevos.Montado en el fondo de la preparacin de un caso servira como control positivo.Vimentina como control tisular.Clulas estromales, endotelios.Dbil sobrefijacin con formol.Control negativo. (Igual recuperacin)Control positivo.
IHQ en citologaBloque celular. (lo mejor)Fijadas en alcohol.Evitar las secadas al aire.ThinPrep.(lisa los GR, lava protenas)Sin recuperacin antignica.
IHQ en citologaProblemasNo es necesaria recuperacin.Se ha visto mejorada con olla a presin.Especialmente muestras en seco.Algunas en alcohol: vimentina, CK7,RP.
Avances en IHQEnvision
Avances en IHQTechmate 500
Avances en IHQAutostainer
Murine variable regions bind specifically to CD20 on B cellsHuman kappa constant regionsHuman IgG1 Fc domain works in synergywith human effector mechanismsChimeric IgG1
Envision
INMUNOHISTOQUIMICA -IIDpto de Anatoma PatolgicaFco Javier Alves Ferreira
Paneles de IHQ
Paneles de IHQ
Paneles de IHQ
Paneles de IHQ
Paneles de IHQ
Neoplasias no hematolinfoides por patrn de crecimiento
Neoplasias no hematolinfoides por rgano o tejido de origen
Bsquedas en internet
Patrones de tincin:membrana (y Golgi)CD15
Patrones de tincin: nuclearMib-1
Patrones de tincin:ncleo y citoplasmaALK
Patrones de tincin: granularPerforina
Dos patrones de tincinCD5
Falso positivo: FondoCD20
Falso positivo: FondoIgE
Falso positivo: fondoS-100
Falso positivo: en clulas normalesEMAPlasmaticasClulas LH
Falso positivo: en clulas normalesCD15PMNClulas de Hodgkin
Falsos negativos por fijacinCD15FormolB5
Falso negativo: con control internocromogranina
Negativo verdadero:BCL-2
Artefactos en IHQEscamas crneasAE1/AE3Burbujas de aire