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Seminario de artículo de investigación, Biología Molecular 2014.
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Presentado por:
• María Gabriela Novoa
• Christian Ramírez Rodríguez
Histone acetylation may suppress
human glioma cell proliferation
when P21waf/Cip1 and gelsolin are
induced
Introduction
• The histone deacetylase inhibitors
(HDACs) have been widely
studied as anti-cancer drugs.
• The most studied drugs have been
NABT and Trichostatin A.
• 5 glioma cell lines, T98G, A172, U-
87 MG, U-118 MG and U-373 MG
were studied.
Introduction
• After treatment with NABT and trichostatin
A, the cells developed a fundamental
process to block cell proliferation in glioma.
• In some cell lines the apoptosis process
was essential, while in others it was more
significant expression of p21 and gelsolin
important in cell cycle control proteins.
• HDAC inhibitors suppress cell proliferation.
Stimulating apoptosis and decreasing the
synthesis of DNA.
Histone
• Simple, basic, small proteins.
(11000-21000 Da).
• Positively charged (rich in Arg
and Lys).
• Histones are five types: H1,
H2A, H2B, H3, H4.
Histone
• DNA and Histone: Nucleosome.
• Some post-translational modifications: acetylation,
methylation, phosphorylation, ribosylation.
Histone
Functions:
• Chromatin structural
organization.
• Phosphate groups
neutralized.
• Packing of DNA.
• Controlling replication and
transcription.
Glioma
• These tumors grow on
nerve tissue
(intraparenchymal).
• Diffusely, are not
delimited from the rest of
the parenchyma
(invasive).
Glioma
• Astrocytoma, Ependymoma, Oligodendroglioma.
• Are classified into 4 grades according to aggressiveness
and malignancy (Kernohan classification).
Glioma
• Brain edema.
• Blood-brain barrier damage.
• Necrosis.
• Epilepsy.
• Decreased intellectual capacity.
• Loss of strength and sensitivity.
• Loss of memory, vision, speech.
Characteristic:
Gelsolin
• Globular protein of 82 KDa. Protease activity.
• Six subdomains: S1-S5 each with five beta-sheetsand two alpha helices.
• Belongs to the superfamily of villin.
• Gelsolin fixed PIP, gelsolin is stimulated by anincrease in cytosolic calcium.
Gelsolin
Functions:
• Cap protein and can prevent
the loss and addition of G actin
molecules.
• In the presence of calcium,
promotes fragmentation of actin
filaments and prevents further
growth and disrupts the
cytoskeleton.
p21WAF/Cip1
• Is a protein that in humans is encoded by the CDKN1Agene located on chromosome 6 (6p21.2).
• p21 is a potent cyclin-dependent kinase inhibitor (CKI).
• Regulator of cell cycle progression at G1 and S phase.
• p21 can mediate cellular senescence.
• The expression of this gene is tightly controlled by thetumor suppressor protein p53.
p21WAF/Cip1
General AIM
• The general aim of the
research is to evaluate the
antiproliferative activity of
HDAC inhibitors (NaBT and
Trichostatin A) on 5 glioma cell
lines, T98G, A172, U-87 MG,
U-118 MG and U-373 MG.
With the examination of the
altered expressions in p21 and
gelsolin genes.
Materiales y métodos
Cultivo celular
• Las células son puestas en
medios de cultivo con varios
aditivos con el fin de
garantizar un buen crecimiento
y desarrollo de las células.
• Se añadieron inhibidores de la
HDCA.
Materiales y métodos
Cultivo celular
En esta investigación se utilizó para que las 5 líneas de
células de glioma maligno humano tengan un buen
medio para proliferar.
Materiales y métodos
Ensayo de proliferación celular
• En pocillos se siembran
cierta cantidad de células a
condiciones especificas
(tiempo, temperatura, entre
otros) para incubarlas, luego
se miden con
espectrofotometría.
Materiales y métodos
Ensayo de proliferación celular
• Se utilizó en esta investigación para comparar el
crecimiento de las células en un medio que contenía
inhibidores de la HDAC Vs las que estaban en SFB.
Materiales y métodos
Ensayo de fragmentación del DNA
• Se recolectan y sedimentan
las células, se lavan y se
resuspenden, luego se tratan
con un tampón de lisis
celular y luego se incuban.
• ADN se precipitó con etanol
y se resuspendió en agua
destilada.
Materiales y métodos
Ensayo de fragmentación del DNA
• Las células se sometieron a electroforesis en gel de
agarosa.
• El gel se tiñó con bromuro de etidio, y el DNA se visualizó
usando un Transilluminater UV.
Materiales y métodos
Ensayo de fragmentación del DNA
Se utilizó para separar el DNA
de las otras proteínas que
también son objeto en el
estudio.
Materiales y métodos
Análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo
• Basada en la utilización
de luz laser.
• En este procedimiento las
células se tratan y se
fijan. Luego se analizan
para detectar una
población celular entre
otras presentes en la
misma muestra.
Materiales y métodos
Análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo
Se utilizó para detectar líneas celulares específicas y
evaluar el ciclo celular.
Materiales y métodos
Aislamiento y fraccionamiento de histona
• Las histonas se precipitaron
con acetona.
• Se centrifugaron, secaron y
resuspendieron en agua
destilada.
Materiales y métodos
Aislamiento y fraccionamiento de histona
• Acetilación de histonas se
evaluó por histonas de
fraccionamiento en geles de
ácido / urea / poliacrilamida.
• Y luego se tiñeron los geles.
Materiales y métodos
SDS-PAGE y análisis de inmunotransferencia
• Las proteínas se separan por electroforesis por la
técnica SDS-PAGE, en una solución con SDS cargada
(-). Las proteínas se transfieren a un filtro y se incuban
con anticuerpos que reaccionan con la proteína de
interés.
Materiales y métodos
SDS-PAGE y análisis de inmunotransferencia
• Se utilizó para identificar
las diferentes proteínas
que son objeto de
estudio en esta
investigación .
Results
HDA, alteran las fases
del ciclo celular
Results
• Las células T98G, A172
y U118, indican que
sufrieron apoptosis.
• U-87 MG y U-373 MG, la
apoptosis fue menor.
Results
• Acetilación de Histonas Fracción en 4 H4
Results
Regulación en alta de p21
y gelsolin Análisis inmunoblot
Results
Expresión temporal del gen p21 y gelsolin en T98G
Discussion
Author Phrase Agree Desagree
Gibson et al., 1999 “ paradoxical effect of butyrate”
“The growth inhibition was apparent
in glioma cells by treatment with
both NaBT and TSA, but a
paradoxical effect was observed by
treatment with NaBT”
Hargreaves et al.,
1989, Stockhammer
et al., 1995,
Engelhard et al.,
1998
“ NaBT, phenyl acetate and phenyl
butyrate were not recognized as
HDAC inhibitors”
Author Phrase Agree Desagree
Harada et al.,
2000
“ Reported growth inhibition after
transfection of the p21 gene into
glioma cells”
Thompson et al.,
1998
“ Histone acetylation clearly must
alter expression of other genes
involved in cell growth, such as
c-MYC, c-MYB, and more”
Discussion
Conclussion
The HDAC inhibitors are a great idea to treat differents
types of cancer, due to number of actions that cause
like inhibit the cell proliferation and cell cycle, and
induce apoptosis.
Through HDAC inhibitors we can induce p53 protein
function, reducing the risk of developing cancer.
Conclussion
• We can achieve reduce the effects caused by
chemotherapy and radiotherapy with new drugs
alternatives, like HDAC inhibitors.
• We can conclude that acetylation of histone proteins,
play a crucial role in the regulation of cell growth and
activation of apoptosis or programmed cell death.
Referencias Bibliográficas
• Hideki Kamitani; Seijiro Taniura; Kenji Watanabe; Makoto
Sakamoto; Takashi Watanabe; Thomas Eling. “Histone
acetylation may suppress humanglioma cell proliferation
when p21WAF/Cip1and gelsolin are induced”. Neuro-
Oncology. Pp: 95 – 101.