Upload
caio-maximino
View
748
Download
2
Tags:
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Ethanol-modulated camouflage response screen in zebrafish uncovers a novel role for cAMP and ERK signaling in behavioral sensitivity to ethanol
Citation preview
Caio MaximinoLaboratório de Neurociências e Comportamento
Laboratório de Neuroendocrinologia
A resposta aguda ao álcool segue uma curva de Yerkes-Dodson
A resposta aguda ao álcool segue uma curva de Yerkes-Dodson
Dose
Ati
vid
ad
e
A resposta aguda ao álcool segue uma curva de Yerkes-Dodson
A resposta aguda ao álcool segue uma curva de Yerkes-Dodson
© 2
00
2 A
meri
can
Colleg
e o
f N
eu
rop
sych
op
harm
aco
log
y
A resposta aguda ao álcool implica em ansiólise e
hiperlocomoção
A resposta aguda ao álcool implica em ansiólise e
hiperlocomoção
A resposta aguda ao álcool implica em ansiólise e
hiperlocomoção
A resposta aguda ao álcool implica em ansiólise e
hiperlocomoção• Animais adultos.
• Distribuição vertical eliciada pela novidade.
• Exposição aguda ou crônica (0.3% v.v.).
• Medidas: Latência, freqüência e duração das transições à porção superior do aquário, movimentos erráticos (“ansiedade”); distância total percorrida e velocidade média (“atividade”)
A resposta aguda ao álcool implica em ansiólise e
hiperlocomoção
A resposta aguda ao álcool implica em ansiólise e
hiperlocomoção
© 2
009 E
lsevi
er
Ltd
.
A resposta aguda ao álcool implica em ansiólise e
hiperlocomoção
A resposta aguda ao álcool implica em ansiólise e
hiperlocomoção
A resposta aguda ao álcool implica em ansiólise e
hiperlocomoção
A resposta aguda ao álcool implica em ansiólise e
hiperlocomoção• Animais adultos.
• Exposição a um modelo de predador.
• Exposição aguda (0.25-1.0% v.v.) ou crônica (0.25% v.v. por 2 semanas).
• Medidas: distância em relação ao modelo (“ansiedade”), distância total percorrida (“atividade”).
A resposta aguda ao álcool implica em ansiólise e
hiperlocomoção
A resposta aguda ao álcool implica em ansiólise e
hiperlocomoção
© 2
006 E
lsevie
r Ltd
.
A resposta aguda ao álcool implica em ansiólise e
hiperlocomoção
A resposta aguda ao álcool implica em ansiólise e
hiperlocomoção
© 2
006 E
lsevie
r Ltd
.
Um efeito similar pode ser observado em larvas (6 d.p.f.)
Um efeito similar pode ser observado em larvas (6 d.p.f.)
Um efeito similar pode ser observado em larvas (6 d.p.f.)
Um efeito similar pode ser observado em larvas (6 d.p.f.)• Larvas (6 d.p.f.).
• Locomoção em campo aberto.
• Exposição aguda (1-4% v.v.).
• Medida: atividade locomotora no claro e no escuro.
Um efeito similar pode ser observado em larvas (6 d.p.f.)
Um efeito similar pode ser observado em larvas (6 d.p.f.)
© 2
009 E
lsevie
r Ltd
.
A resposta aguda ao álcool é altamente similar em diferentes
espécies
A resposta aguda ao álcool é altamente similar em diferentes
espécies• A Drosophila mutante cheapdate sugere
que a sinalização por AMPc é necessária para suprimir a sensibilidade comportamental ao álcool (Moore et al 1998).
• Camundongos knocked-out dos genes que codificam as isoformas 1 ou 8 da adenilato ciclase apresentam maior sedação em resposta ao álcool (Maas et al. 2005).
Adenilato ciclase 5Adenilato ciclase 5 Su
nah
ara
e T
au
ssig, “Iso
form
s of m
am
malia
n a
den
ylyl cyclase
: M
ultip
licities o
f sign
alin
g” ©
20
02
NP
G L
td.
ERK/MAPKERK/MAPK
Fre
e e
t al., “S
ynap
tic tran
smissio
n: In
trace
llula
r sign
alin
g” ©
20
07
Joh
n W
iley &
Son
s
MÉTODOS & RESULTADOSMÉTODOS & RESULTADOS
Ethanol-modulated camouflage response screen in zebrafish uncovers a novel role for cAMP and ERK signaling in behavioral sensitivity to ethanol
SujeitosSujeitos
• Larvas (6 d. p. f.) da cepa AB.
• Larvas fan (background AB x Tübingen).
• DNA genômico extraído de 20 larvas AB e 20 larvas fan, e ampliado com PCR e primers para D. rerio.
Genotipagem da mutação fanGenotipagem da mutação fan
• Painel de 2976 embriões fan.
• Mutação nonsense no primeiro éxon do gene para AC5.
• Hibridização in situ indica que a AC5 é expressa no cérebro de larvas AB normais.
fan induz produção de AMPc em células HEK293
fan induz produção de AMPc em células HEK293
Detecção de fosfo-ERKDetecção de fosfo-ERK
• Anticorpo anti-ERK fosforilada em diluição 1:1000.
• Análise de secções do cérebro de larvas AB normais e mutantes.
• Tratamento com PD98059 (inibidor da MEK), 0 ou 50 μM.
Ensaios para captação e metabolismo do etanol
Ensaios para captação e metabolismo do etanol
• Imersão de 120 larvas (AB ou fan) em etanol 3% v.v.
• Retirada de 40 larvas após 4, 10 ou 16 min.
• Larvas homogeneizadas em 500 μL de Tris-HCl 50 mM; homogenatos centrifugados a 14000 rpm (4° C por 20 min.)
• Kit de ensaio de etanol (Diagnostic Chemicals Ltd.)
Ensaios comportamentaisEnsaios comportamentais
• Resposta pigmentar: Exposição a luz ambiente por ~20 min.; medida de saturação dos melanócitos.
• Atividade locomotora: velocidade instantânea de deslocamento em campo aberto (5 x 4 x 2 cm).
Atividade locomotoraAtividade locomotora
Atividade locomotoraAtividade locomotora