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UNIVERSIDADE DA CORUÑA
Biomarcadores Proteicos: Las plataformas de arrays de proteínas
Grupo de Proteómica
ProteoRed, PRB2-ISCIII INIBIC
Hospital Universitario de A Coruña
Lucía María Lourido Salas
Características:
• Muy sensible Bajo consumo de muestra
• No requiere la separación o depleción de proteínas abundantes Rapidez y automatización
Arrays de proteínas Introducción
Definición: soportes miniaturizados para monitorizar cientos de proteínas simultáneamente
2) Funcionales
Proteínas Lípidos/Carbohidratos
Fármacos
Proteínas
Proteínas Anticuerpos
1) Analíticos
DNA
Antígenos
Anticuerpos
Muestra
Antígenos
Muestra Muestra
Perfiles proteicos/diagnóstico Interacciones proteicas
Arrays de proteínas para la búsqueda de biomarcadores
Introducción
Proteínas Número de muestras/ensayo
Proteínas Número de muestras/ensayo
Formato plano:
Formato de esferas:
Antígenos Anticuerpos
Proteínas Autoanticuerpos
Proyectos
1
• Buscar autoanticuerpos en sueros de pacientes con artrosis
con potencial valor diagnóstico de la enfermedad.
2
• Identificar un panel de proteínas en suero que permitan
diagnosticar a los pacientes artrósicos.
Introducción
Human Protein Atlas- Proyecto Proteoma Humano
Selección del antígeno Clonaje Producción de fragmentos
bacteria
1. Generación
de fragmentos proteicos
Purificación de los fragmentos
Inmunización Anticuerpo (Ab) Purificación del Ab
2. Generación
del anticuerpo
Inmunofluorescencia Western blot Inmunohistoquímica Arrays de fragmentos
3.Validación
1
• Buscar autoanticuerpos en sueros de pacientes con artrosis
con potencial valor diagnóstico de la enfermedad.
2
• Identificar un panel de proteínas en suero que permitan
diagnosticar a los pacientes artrósicos.
Proyectos Proyectos
Identificación de autoanticuerpos en OA
Identificación de autoanticuerpos en OA
Diferentes arrays de antígenos
cDN
A
Nucleic Acid Programmable Protein Array (NAPPA)
α-tag
α-tag
Proteina expresada
cDN
A
Dirigida
No Dirigida
Arrays de fragmentos proteicos
Expresión in vitro
3840 fragmentos proteicos 80 proteínas completas
Suero con autoanticuerpos
Arrays planos
Arrays en esferas
Muestras
21 SANOS
OA
AR
Identificación de autoanticuerpos en OA
Flujo de trabajo de los arrays de fragmentos proteicos Identificación de autoanticuerpos en OA
1) Cribado
3840 fragmentos proteicos
Leyenda:
Fragmentos proteicos
Suero con anticuerpos
2) Verificación
232 fragmentos proteicos
Pocillo 1
Pocillo 1
Pocillo 1
Spot1 Spot3840
Spot1 Spot3840
Spot1 Spot3840
Anticuerpo Anti-IgG humana marcado
Análisis: - IF> IFM+10x MAD - Test exacto de Fisher (p<0.05)
Expresión in vitro
de la proteína de
interés
Nucleic Acid Programmable Protein Array (NAPPA)
Labaer et al 2008
Etiqueta (GST)
Anti-GST DNA
Identificación de autoanticuerpos en OA
80 proteínas completas
Labaer et al 2008
Identificación de autoanticuerpos en OA
3) Purificación 4) Secuenciación
Construcción del NAPPA
1) Selección 2) Cultivo 7) Printing
07/02/2013
C) -IgG humana –Cy3
B) Añadir suero
tag
tag
tag
tag
IgG humana
IgG humana
A) Expresión
α-tag
cDN
A
α-tag
cDN
A
Proteina expresada
IVTT
D) Análisis
Flujo de trabajo de los NAPPA
Array
Identificación de autoanticuerpos en OA
80 proteínas
Análisis:
-Normalización inter e intra array
- IF > background -Wilcoxon test (p< 0.05)
Resultados- Reactividad
Identificación de autoanticuerpos en OA
Array de fragmentos proteicos NAPPA
Resultados- arrays de fragmentos proteicos Identificación de autoanticuerpos en OA
07/02/2013
• HOXD3 y LEPREL2 sólo mostraron reactividad en OA e IFRG15 sólo en individuos sanos.
• KCNJ6 mostró mayor
reactividad en OA que en AR.
• CCDC85C, KCNB2, and
ZNF784, menor reactividad en OA que en AR.
Resultados- NAPPA
Identificación de autoanticuerpos en OA
• LEP, IGFBP6 and IGFBP4 presentaron mayor reactividad en OA que en muestras AR.
• CHST14, CD44, LEP y PCOLCE presentaron mayor reactividad en OA que en individuos sanos.
Muestras
Ab
s 4
50
nm
ELISA CHST14
Conclusiones
- Utilizando dos estrategias diferentes de arrays de antígenos, se han encontrado
autoanticuerpos en el suero de pacientes con artrosis con potencial valor diagnóstico de
la enfermedad.
- Los niveles de inmunorrreactividad frente a HOXD3, LEPREL2, CHST14, CD44, LEP y
PCOLCE están incrementados en pacientes artrósicos con respecto a controles sanos.
- La inmunorreactividad frente KCNJ6, IGFBP4, IGFBP6 y LEP está incrementada en
pacientes artrósicos con respecto a pacientes con artritis reumatoide, mientras que la
inmunorreactividad para los antígenos CCDC85C, KCNB2 y ZNF784 está disminuida.
1
• Buscar autoanticuerpos en sueros de pacientes con artrosis
con potencial valor diagnóstico de la enfermedad.
2
• Identificar un panel de proteínas en suero que permitan
diagnosticar a los pacientes artrósicos.
Proyectos Proyectos
Identificación de potenciales marcadores séricos en OA
Descubrimiento
LC-MS/MS (cartílago, líquido sinovial, bibliografía)
Gran número de proteínas identificadas
Pocas muestras analizadas
Arrays de anticuerpos en suspensión
Proteínas seleccionadas
Mayor número de muestras analizadas
Verificación
Suero
Validación de proteínas en suero
Muestras
Identificación de potenciales marcadores séricos en OA
Cribado Control K/L2 K/L3 K/L4 AR APs
Número de pacientes
96 118 112 58 288 288
Verificación Control K/L2 K/L3 K/L4 AR APs
Número de pacientes
92 43 31 122 192 192
OA=288
OA=196
Muestras
Primera cohorte: N= 960
Segunda cohorte: N= 672
Flujo de trabajo
Identificación de potenciales marcadores séricos en OA
Distribución
Marcaje con biotina
C) Creación del array E) Cuantificación
SAPE
A) Muestras
Biotina B) Marcaje
D) Incubación
SAPE: estreptavidina-ficoeritrina
Análisis
• Modelo de regresión lineal (edad, sexo, BMI) p<0.05
Estudio
Diseño del array
960 muestras 672 muestras
Proteínas candidatas
Proteínas validadas
174 anticuerpos
78 proteínas diana
106 anticuerpos
46 proteínas diana
I. Fase de cribado II. Fase de verificación
288 OA
96 Controles
288 AR 288 APs
196 OA
92 Controles
192 AR 192 APs
OA vs AR OA vs APs
OA vs Ctrl
4 26
10
4
2
OA vs AR OA vs APs
OA vs Ctrl
13 15
1
3
2
3
Diseño del array
Identificación de potenciales marcadores séricos en OA
Identificación de potenciales marcadores séricos en OA
Resultados: Diagnóstico de artrosis de rodilla
Identificación de potenciales marcadores séricos en OA
Cribado
Verificación
Panel para diagnóstico de OA
Resultados: Diagnóstico de artrosis de rodilla
Resultados: Severidad radiográfica en OA (grado K/L) C
RIB
AD
O
VER
IFIC
AC
IÓN
APOA1, GC e ITIH1 posibles marcadores de OA radiográfica
Objetivo 4: Identificación de potenciales marcadores séricos en OA
* p<0.05
Resultados: Severidad radiográfica en OA (grado K/L)
S100A6 marcador de severidad radiográfica en OA
Objetivo 4: Identificación de potenciales marcadores séricos en OA
* p<0.05
CR
IBA
DO
V
ERIF
ICA
CIÓ
N
13
3
1
2
15 3
C3
GC S100A6
ITIH1
APOA1
LEP
OA vs AR OA vs APs
OA vs Controles sanos
Identificación de potenciales marcadores séricos en OA
Resultados: Comparación OA, AR y APs
Identificación de potenciales marcadores séricos en OA
OA vs AR OA vs APs
* * * *
* p<0.05
Resultados: C3 distingue pacientes OA, AR y APs
C3 potencial marcador específico de OA
Conclusiones
- De todas las proteínas del panel, sólo la S100A6 está aumentada en todos los grados K/L
radiográficos con respecto a los controles sanos, por lo que esta proteína podría ser
indicadora del daño radiográfico de la artrosis de rodilla.
- De todas las proteínas del panel, sólo la proteína C3 permite diferenciar los pacientes
artrósicos de los controles sanos y de las dos enfermedades reumáticas (artritis
reumatoide y artritis psoriásica) analizadas, indicando el potencial de esta proteína como
biomarcador específico para el diagnóstico de la artrosis de rodilla.
- Se ha identificado un panel de 6 proteínas formado por APOA1, GC, ITIH1, S100A6 y C3,
cuyos niveles en suero permiten diferenciar pacientes con artrosis radiográfica de rodilla
de controles sanos.
Proteomics Group ProteoRed-PRB2/ISCIII
Cristina Ruiz-Romero Dr. Francisco J.
Blanco
Rheumatology Division INIBIC-Hospital Universitario de A
Coruña
Valentina Calamia
Patricia Fernández-
Puente
Beatriz Rocha
María Camacho
Nancy M. Parra
Lucía González
Dr. Peter Nilsson
Dr. Jochen Swenck
Dr. Frauke Henjes
Dr. Burcu Ayoglu
Cecilia Hëlltrom
Gracias por vuestra atención!