Dr. Romain Desprat

• Projet INGESTEM

• Gouvernance et organisation : Comité de direction et personnels

• Objectifs de la plaforme de reprogrammation cellulaire

• Comité de direction et Platforme

• Type de collaboration et tarifs

• Charte de fonctionnement : - Engagements de l’utilisateurs

- Engagements de la platforme

- Objectifs de la plateforme

- Type de collaboration et tarifs

• iPS production application form 1.0

• Méthodologies proposées

• SNL cellules nourricières pour la culture des iPS et génération d’iPS

• Virus Sendai

• Tests de pluripotence

• Morphologie des colonies

• Analyse des Caryotypes

• RT-PCR Immunostaining et Teratoma

• Instabilité genomique dans les iPS

Sommaire

La disponibilité de cette base de données de cellules souches va permettre de réaliser des avancées significatives dans le domaine de la modélisation des maladies humaines et dans le domaine de la définition de nouveaux protocoles thérapeutiques.

INGESTEM va permettre à la France de passer du stade de la recherche au stade industriel dans le domaine des thérapies cellulaires liées aux cellules souches en développant une biobanque unique, en instaurant des normes de production cliniques, des standardisations au niveau des méthodes de reprogrammation, de modélisation de pathologies et de futurs protocoles de médecine régénératrice.

DESCRIPTION

APPORTS POUR LA SCIENCE

APPORTS POUR LE SYSTEME DE RECHERCHE

Infrastructures nationales en biologie et santé PROJET INGESTEM

1 Le projet INGESTEM propose de constituer une biobanque unique de cellules souches à vocation thérapeutique et de structurer cette filière autour d’un pôle industriel.

Plateforme de reprogrammation cellulaire SAFE-IPS ("la Plateforme") est une structure interne du département HU de Biothérapie du CHRU de Montpellier

2

3

Gouvernance et organisation Comité de Direction

• Réseau INGESTEM est coordonné par le Prof. Annelise Bennaceur-Griscelli.

• Directeur de l’IRB (Prof. B.Klein), responsable et représentant de la Plateforme au niveau du réseau INGESTEM.

• Deux responsables scientifiques désignés par le Directeur de l'IRB sur la base de leurs compétences médicales et/ou scientifiques (Prof. J. De Vos et Dr JM. Lemaitre) dans le domaine des cellules souches pour la durée du projet INGESTEM.

• Fournir un service de Reprogrammation, Amplification et qualification de cellules adultes en cellules souches induites pluripotentes iPS.

• Développer un programme de recherche et développement propre visant à rendre plus efficaces et plus sûres les techniques de reprogrammation cellulaires.

Objectifs de la plateforme de reprogrammation cellulaire

http://irb.montp.inserm.fr/en/index.php?page=Plateau&IdEquipe=12

Bernard KLEIN (Porteur du projet)

E-mail : bernard.klein@inserm.fr

Phone : 04 67 33 04 19

John DE VOS (responsable scientifique)

E-mail : john.devos@inserm.fr

Phone : 04 67 33 04 79

Jean-Marc LEMAITRE (responsable

scientifique)

E-mail : Jean-Marc.Lemaitre@igf.cnrs.fr

Phone : 04 67 33 04 73

Comité de direction :

Plateforme: Romain DESPRAT, Ingénieur responsable opérationel, romain.desprat@inserm.fr Fabienne BECKER, technicienne, fabienne.becker@inserm.fr Lydiane PICHARD , ingénieur, lydiane.pichard@inserm.fr

-Le comité de Direction effectue une veille technologique prospective afin de faire évoluer

la Plateforme et s’assure du financement de cette évolution.

-Les responsables scientifiques assurent l’organisation de la Plateforme et la supervision du personnel.

Envois du formulaire “iPS production application form 1.0” disponible sur le site web

SAFE iPS, à romain.desprat@inserm.fr

Signature du Contrat ET de la chartre de reprogrammation

Réception des cellules et vérification de la conformité des cellules

comme décrit dans le formulaire “iPS production application form 1.0”

Mise en place d’un planning de reprogrammation en réunion avec le

comité de direction

6 mois

2-Facs et Immunostainning des

marqueurs de la pluripotence

OCT4, NANOG, SSEA3, TRA-1-60

3-Une capacité de différenciation

in vivo attestée par la formation

de tératomes dans la souris

NOD-scid IL2Rgammanull (NSG)

1-Phénotype caractéristique en

microscopie optique

4-Caryotype de chacun clones

Mise en Place du Projet

Production et Qualification des iPS

Trois lignées indépendantes (trois clones) de cellules iPS

Les trois types de collaborations comprennent : •La reprogrammation, l'amplification et la qualification de cellules adultes en cellules souches pluripotentes. •La formation d'un collaborateur du demandeur pendant une durée de 15 jours ETP. •La conservation de quatre ampoules congelées de chaque lignée par la platforme.

Charte de fonctionnement

Chartre de fonctionnement

Responsabilités

Il est entendu entre la Plateforme et ses utilisateurs que celle-ci n'est soumise qu'à une obligation de moyens dans le cadre de ses activités. La Plateforme n'est pas responsable de l'emploi fait par les utilisateurs des résultats des prestations. Toute utilisation partielle ou inappropriée ou toute interprétation dépassant les résultats des prestations réalisées par la Plateforme ne saurait engager sa responsabilité. Si les cellules de départ proviennent patient Consentement écrit du patient et Comité de Protection des Personnes

iPS production application form 1.0 General information (part I)

Date of submission: Project Leader : Phone and e-mail: Institution: Other persons involved in the project : Name, phone an e-mail: ……………………………………………………………………….……………………………………………………………………….……………………………………………………………………….……………………………….. Cell information Name of person who will handle the iPS cell lines. Possible Conflicts of interest: NO/YES Cell type: Method of isolation/Origin : Sample(s) name and description: ……………………………………………………………………….………………………………………

Contact: Romain.desprat@inserm.fr

•Written and dated documentation that the cells are negative for bacteria. •Written and dated documentation that the cells are negative for mycoplasm. •Written and dated documentation that the cells are negative for the following viruses : HIV1, HIV2, HB, HCV. Passage number (please describe proliferation rate or doubling time): If frozen, number of viable cells frozen (>= 5 x 10E5 viable cells) Medium used to grow the cells (indicate the antibiotic and concentration used in the media):

iPS production application form 1.0 (part II)

If not possible, this can be

carried out by facility as a

service.

Contact: Romain.desprat@inserm.fr

(part III) Freezing media composition: Protocol to thaw the cells: Dated karyotype of the cells. If not possible, this can be carried out by the Chromostem facility as a service (please contact f-pellestor@chu-montpellier.fr). Mettre dans le site web le lien vers Franck. Preferred reprogramming method (check the box): Sendai virus Lentivirus Retrovirus

Contact: Romain.desprat@inserm.fr

J -2 J 27 J 0 J 13 colonies iPS

Adapted from: http://fr-fr.invitrogen.com/site/fr/fr/home/Products-and-Services/Applications/Stem-Cell-Research/Induced-Pluripotent-Stem-Cells/Sendai-Virus-Reprogramming/Easy-Reprogramming.html

Transfert colonies iPS

J -2 J 27 J 0 J 15 Colonies iPS

Virus Sendai

mRNA et Rétrovirus/Lentivirus non integratifs

J -2 J 27 J 0 J 13 Colonies iPS

Rétrovirus/Lentivirus (integratifs)

J 2

Méthodologies proposées

Protéines à venir prochainement

Virus Sendai

Invitrogen: sialic acid

MTA /Collaboration avec

SNL cellules nourricières pour la génération et la culture d’iPS

•Cellules souches embryonnaires ont besoin de “feeders”. •Lignée cellulaire immortalisée dérivée de fibroblastes murins STO transformée avec du LIF murin et les gènes de résistance à la néomicine (établis par le Dr. Allan Bradley (1)) . • Utilisable pour la culture des iPS murins et humains. • Doivent être bloque dans le cycle() avant l’ajout des cellules souches embryonnaires humaines.

1. McMahon, A.P. and Bradley, A. (1990) Cell 62:1073–1085.

Faster generation of hiPSCs by coupling high-titer lentivirus and column-based positive selection, Emily Dick, Elena Matsa, Lorraine E Young, David Darling &

Chris Denning, nature protocols | VOL.6 NO.6 | 2011 | 701

Production Virale

Plateforme de Vectorologie de Montpellier , Biocampus Montpellier - UMS3426 Courriel : vectorologie@biocampus.cnrs.fr Test de non replicativite et dosage p24.

optionel

Distinct Regulatory Networks Control Transition versus Maintenance of

Pluripotency, Cell stem cell, Volume 11, Issue 6, 7 December 2012, Pages 769–782

“A color gradient (yellow-orange-red) depicts

the three phases of reprogramming, with the

maturation-to-stabilization transition upon

transgene withdrawal marked as a dotted line.

Genes that enhance and suppress transition

only (yellow), maintenance only (brown), or

both processes (orange) are displayed as

nodes. Associations (gray edges) were

obtained using GeneMANIA, with edge weight

(thickness and darkness) reflecting confidence,

as indicated.”

•-OKSM Transgenes Suppress the Stabilization Phase

•-Successful Transition of Reprogramming Cells to Stabilization Requires late Maturation Phase

->RNA profiling and down-regulation of OKSM is a key aspect

Tests de pluripotence possible

Test de pluripotence But Qualité du contrôle pour démontrer la

pluripotence

Morphologie des colonies Vérifier que les iPS ont une morphologie similaire au

hES Faible

Immunostaining Marquage de la pluripotence:Oct4, Tra-1-60,Sox2, Tra-

1-80, Nanog et SSEA Moyen

RT-PCR Détecte le niveau et la qualité d'expression des genes

:Oct4, Tra-1-60,Sox2, Tra-1-80, Nanog et SSEA Moyen-Bon

Génération d'EB Capacité à se différencier dans les trois feuillets

embryonnaires (ecto,endo, mésoderme et disparition des marqueurs de la pluripotence)

Moyen-Bon

Microarray ou RNA-seq Comparaison avec hES Moyen-Bon

Teratoma formation Capacité à se différencier dans les trois feuillets

embryonnaires (ecto,endo, mésoderme ) IN VIVO Bon

Morphologie des colonies

Les cellules au centre de la colonie ont un ratio élevé noyaux /cytoplasme avec des nucleoli proeminent , elles sont rondes et trés dense . En comparaison avec les cellules au centre la colonie les cellules en peripherie montre une morphologie plus mesenchymateuse et par consequant un ratio noyaux /cytoplasme faible.

STEM CELLS Volume 27, Issue 11, 20 AUG 2009

Chromostem : Analyse du Caryotype (bande R et G sur metaphases)

f-pellestor@chu-montpellier.fr

Pour tout contrôle de la formule chromosomique (anomalie du nombre et de la structure, le pouvoir résolutif de cette technique ne permet cependant de détecter que les réarrangements chromosomiques de taille supérieure ou égale à 5 à 10 mégabases (Mb): -Avant et après la reprogrammation cellulaire -Lors de la dérivation et/ou amplification, -Avant le stockage des lignées

Préparation Biologique

requise Anomalie Détectable

Anomalie Non Détectable

Délai de rendu des résultats

Coût (TTC)

Culot cellulaire fixé

Anomalies chromosomique de nombre et mosaïque >10%, Anomalies

chromosomiques de structure de taille > 10 Mb (translocation,

inversion,délétions,duplications anneaux, marqueurs chromosomiques

Mosaïque faible (<10%),Anomalies

chromosomique de structure de taille

<10Mb

3 semaines 350 euros

Les conditions de culture classiques des cellules ES humaines in vitro

permettant le maintien de leur état indifférencié, induisent de façon

non négligeable des trisomies des chromosomes 12, 17 ou X [1,2].

L’hypothèse qui prévaut actuellement pour expliquer ce phénomène

est que l’amplification de certains gènes portés par ces chromosomes

confère un avantage sélectif aux cellules souches indifférenciées.

1.Baker DE, Harrison NJ, Maltby E, et al. Adaptation to culture of human embryonic stem

cells and oncogenesis in vivo. Nat Biotechnol 2007 ; 25 : 207-15.

2. Draper JS, Smith K, Gokhale P, et al. Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in

cultured human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 2004 ; 22 : 2253-4.

Améliorations des conditions de culture et de reprogrammation

X-Vivo Biospherix ( culture des cellules en milieux

athmospherique controler 100% du temps)

Efficient induction of transgene-free humain iPS using a vector based on sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome By Noemi FUSAKI, Hiroshi BAN, Akiyo NISHIYAMA, Koichi

SAEKI and Mamoru HASEGAWA, Efficient induction of transgene-free humain iPS using a vector based on sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome

Immunocytochimie et facs

•Les Primers/amorces de RT-PCR seront choisis afin de mesurer les niveaux d’expression des genes sur-exprimes utilises lors de la reprogrammation et de leurs niveaux endogenes.

RT-PCR

Alkaline Phosphatase (AP) Marquage sur cellules vivantes

(sans perte des cellules)

Alkaline Phosphatase (AP) Marquage classique après fixation

“Gold standard” Teratoma

-Création d’un test permettant de définir une signature protéomique. (Potentielle collaboration avec la Plate-forme Régionale de Protéomique Clinique, Pr. S. Lehmann).

-Création d’une “custome chip” d’analyse d’expression (coding et non coding) et CNV/SNP. (Chip affymetrix sur les genes définissant l’état fibroblastique et iPS. En collaboration

avec la Plateforme Régionale de Puces ADN très haute densité,IRB, V Pantesco).

Futurs projets afin d’offrir aux utilisateurs de la plateforme des protocoles pre-établis permettant une meilleure

caratérisation de leurs iPS

Instabilité génomique dans les iPS

Cell Death and Differentiation (2011) 18, 745–753

Création d’un “custom chips” d’analyse d’expression et CNV/SNP (Affymetrix sur les genes définissant l’état fibroblastique et iPS. En Collaboration avec la Plateforme Régionale de Puces ADN très haute densité, V Pantesco)

Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency, 3 MARCH 2011 , VOL 471 , NATURE , 59

Matérials à venir prochainement :

X-Vivo Biospherix,….

Projets dans à mettre en place : •Production de beta-FGF sur Montpellier: Permettant une diminution des coûts associes aux milieux -> plus d’utilisateurs •Production de proteines (oct4,KLF, Sox…) pour faire des iPS : Permettant d’avoir des iPS sans integration genomique des vecteurs d’expression permettant des potentielles applications cliniques futures

•Création de « custom chips » afin d’analyser l’expression et les changements de CNV/SNP : Sur les genes définissant l’état fibroblastique et iPS. En collaboration avec la Plateforme Régionale de Puces ADN très haute densité, Pr B.Klein

Journal club Stem cell IRB: qiang.bai@inserm.fr Stem cells news mailing list : john.devos@inserm.fr

•Production de 6 virus sendai permettant l’expression transitoire des six facteurs : Oct4, Klf, Sox2, Myc, Lin28 Nanog, (La Plateforme de Vectorologie de Montpellier )

•Création d’un blog/site web (plus de flexibilité) et/ou en utilisant un system déjà existant (INGESTEM), permettant un partage plus fluide des protocols et publications, photo des cellules, questions associées à la culture des iPS…. •Collaboration avec ReproCell afin de créer des ateliers ou période d’apprentissage sponsorise par ReproCell et Ozyme pour les milieux

Journal club Stem cell IRB: qiang.bai@inserm.fr Stem cells news mailing list : john.devos@inserm.fr

Un contrat de collaboration académique: Le coût représente la moitié des dépenses engendrées par la prestation. Coût national INGESTEM. Le partenaire académique utilise les cellules comme il le souhaite sur un plan académique, mais si il engage un partenariat privé, la plateforme Safe-iPS sera associée dans la valorisation. Un contrat de collaboration avec compagnie privée : la plateforme Safe-iPS sera co-propriétaire des lignées obtenues. Un contrat avec prestation complète pour compagnie privée. les lignées iPS obtenues sont la propriété exclusive de l'utilisateur.

Service Tarif

Collaboration académique 20 000 € TTC

Collaboration privée 40 000 € TTC

Collaboration privée complète 140 000 € TTC

Trois contrats et tarifs la plateforme doit s’autofinancer dans 3 ans

Ces collaborations peuvent être mises en place lors de l’écriture des demandes de

financement : ERC, ANR, INCA, ARC, Ligue …