Seminário de enzimologia

Aproveitamento do resíduo de laranja para a produção de enzimas lignocelulolíticas por Pleurotus ostreatus (Jack:Fr)

Universidade Federal do Ceará Departamento de Tecnologia de Alimentos

Disciplina: Enzimologia e Tecnologia das FermentaçõesProfessora: Vanesca Frota

Ana Beatriz Bezerra MoraesAna Cláudia de Morais Lima Nascimento

Ana Karoline Ferreira LeiteHaysa Sales Rodrigues

Rayane Rodrigues Sinara Lemos de Paiva

1. Introdução

2.Objetivos

3. Materiais e Métodos

4. Resultados e Discussão

5. Considerações Finais

6. Etapas Futuras

7. Referências Bibliográficas

Sumário

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1. Introdução

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• Nos últimos anos, há um interesse crescente no uso de diversos resíduos agroindustriais;

• Produção de diversas moléculas: proteínas microbianas, ácidos orgânicos, etanol, enzimas e metabólitos secundários biologicamente ativos;

• Economicamente viável;

• Reduz os problemas ambientais.

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1. Introdução • A laranja está entre as frutas mais

produzidas e consumidas no mundo;

• A citricultura é uma das atividades agrícolas que mais vem se desenvolvendo na região noroeste do Paraná;

• 34% da produção é transformada em suco;

• Em grandes países produtores esta percentagem chega a 96%;

• O resíduo equivale a 50% do peso da fruta e tem uma umidade aproximada de 82%.

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1. Introdução • O resíduo de laranja é usado

principalmente como complemento para ração animal;

• Estes resíduos possuem utilização restrita;

• Grande quantidade de água e alto custo de secagem;

• Interesse das empresas em desenvolver mercado para bagaço cítrico úmido;

• Os resíduos de laranja podem ser utilizados na obtenção de fertilizantes orgânicos, pectina, óleos essenciais, compostos com atividade antioxidante e várias enzimas (pectinases e amilases).

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1. Introdução • Pleurotus spp.(Jack:Fr) Kumm.

(Pleurotaceae, Basidiomicetes) é um grupo de cogumelos com alto valor nutricional;

• São fungos causadores da podridão branca da madeira;

• Degradam a lignina, um polímero fenólico recalcitrante encontrado nos vegetais;

• Produzem enzimas lignocelulolíticas (lacases, Mn peroxidase e peroxidase versátil) .

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1. Introdução • Cultura em estado sólido;

• Possibilita a obtenção de elevadas atividades de enzimas, incluindo enzimas ligninolíticas;

• O crescimento do microrganismo pode ocorrer na superfície ou em todo o substrato;

• A escolha do substrato específico deve está relacionado ao custo e viabilidade;

• O cultivo em substratos lignocelulósicos fornece elementos à nutrição fungica.

2. Objetivos

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Neste trabalho foi proposto o uso de resíduos de laranja como substrato para a obtenção de enzimas hidrolíticas e oxidativas envolvidas na degradação de materiais lignocelulósicos, como: lacase (EC 1.10.3.2), manganês peroxidase (EC 1.11.1.14), xilanase (EC 3.2.1.8) e endo-1,4 glucanase (EC 3.2.1.4), por Pleurotus ostreatus cultivados em estado sólido.

3.1- Microorganismo

●Pleurotus ostreatus CCB2;

●Em laboratório, a espécie é mantida por repiques periódicos em ágar batata dextrose (BDA);

●Placas totalmente colonizadas, com até 2 semanas de idade;

●Discos com 10 mm de diâmetro;


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3.2 - Preparo dos resíduos de laranja

●Indústrias de suco da região de Maringá – PR;

●Secagem (estufa de ventilação forçada 35° C – peso constante) e moagem;

●Após a Secagem: os resíduos foram triturados em partículas com diâmetro médio de 4 mm;

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3.3 - Condições de cultivo

4g resíduo de laranja seco – (Erlenmeyer 250 mL);

Foi adicionado Solução mineral ao substrato – (umidades iniciais variando de 50 a 90%);

Os meios foram esterilizados em autoclave por 15 min. a 121 °C;

4 discos de 10 mm de diâmetro das culturas de P. ostreatus em BDA foram assepticamente transferidos para os frascos;

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3.3 - Condições de cultivo

As culturas foram mantidas em Temperaturas variáveis (20 – 35°C até 30 dias) na presença/ausência de luz;

As culturas interrompidas a cada cinco dias;

As massas miceliais foram retiradas com auxílio de uma espátula, lavadas com água destilada 2 vezes e secas em estufa a 60 °C até peso constante para determinação da biomassa.

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3.4 - Extração das enzimas

Retirada da biomassa enzimas foram extraídas adicionada 20 mL de água destilada substrato culturas remanescentes;

Mantidos a 8°C sob agitação/30min.;

Materiais sólidos separados por filtração (gaze);

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3.4 - Extração das enzimas

Filtrados foram centrifugados/10min; Os sobrenadantes límpidos foram utilizados

como fontes das enzimas.

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3.5 - Determinação das atividades enzimáticas

Lacase

- Substrato sirigaldazina - Mistura: 1,5mL tampão fosfato (100 mM; pH 6,5) 0,2mL de sirigaldazina (0,5 mM em solução etanólica) 0,1mL de filtrado da cultura

Oxidação após 5min e a 30ºC absorve em 525nm

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3.5 - Determinação das atividades enzimáticas

• Manganês peroxidase

- Oxidação: 10mM MnSO4 (30ºC) 50mM malonato de sódio Presença de 0,5 mM H2O2 e pH 4,5

O íon mangânico forma complexo com o malonato, o qual absorve 270nm

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3.5 - Determinação das atividades enzimáticas • Xilanase, amilase, pectinase e endoglucanase

- Açúcares redutores- Hidrólise dos substratos: Xilano Amido Pectina Carboximetilcelulose

• β-glicosidase e β-xilosidase - substratos sintéticos:p-nitrofenil-β-glicopiranosídeo p-nitrofenil-β-xilopiranosídeo

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3.6 - Outros métodos analíticos

Carboidratos solúveis totais- Método fenol sulfúrico (glicose)

Açúcares redutores- Método ácido 3,5 dinitrosalicílico (glicose)

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3.7- Análises estatísticas

• Teste ANOVA

• Teste Tukey (p<0,05)


Resultados e discussão

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4.1 - Efeito da umidade inicial no crescimento e na produção de enzimas por P. ostreatus

20 a 35 °Cnenhuma diferença foi observada no crescimento do fungo

Fungo cresceu melhor entre 25 e 30 °C

cultivos foram mantidos a 28 °C

e no escuro 21

● O desenvolvimento da biomassa fúngica foi fortemente afetada pela umidade do substrato. Analises visuais das culturas mostraram que o crescimento e desenvolvimento foram mais precoces quando Ui > 75% .

● Umidade adequada:Ui que permitiram completa colonização dos substratos até o 10º dia de cultivo, a 28 º C.

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● 75% < Ui < 80% da culturaO fungo cresceu de forma homogênea nas partículas do substrato sólido.

● Ui > 80% O crescimento deu-se pela formação de uma massa micelial espessa, acima do substrato. Tal massa micelial foi removida do substrato residual, permitindo a determinação da biomassa fúngica produzida.

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A produção de diversas enzimas oxidativas e hidrolíticas por P. ostreatus foi determinada após 10 dias de cultivo em cinco umidades iniciais distintas.

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Figura 1 - Efeito da umidade inicial na produção de enzimas oxidativas por P. ostreatus cultivado em resíduo de laranja. Os cultivos foram desenvolvidos a 28 °C por 10 dias

56,0 ± 4,3 U.g -1

6,50 ± 0,43 U.g -1

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Figura 4.2 - Efeito da umidade inicial na produção enzimas hidrolíticas por P. ostreatus cultivado em resíduo de laranja. Os cultivos foram desenvolvidos a 28 °C por 10 dias

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4.2 - Produção de biomassa e enzimas em cultivos com 85% de umidade inicial

A característica de crescimento micelial superficial em substrato com umidade inicial de 85% possibilitou a separação da biomassa do resíduo de laranja remanescente.

Valores de umidade superiores a 80%, o fungo se desenvolveu nas camadas mais superficiais do substrato. Desta forma, tal cultivo é mais propriamente considerado como cultura de superfície.

A concentração de biomassa fúngica na superfície das culturas permitiu que as mesmas fossem separadas do substrato, e o crescimento pode ser avaliado pela determinação direta da biomassa fúngica produzida (Figura 4.3).

.

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Figura 4.3 - Produção de enzimas e crescimento de P. ostreatus em cultivos utilizando resíduo de laranja com umidade inicial de 85%.

75 U.g -1

6,8 U.g -1 (?)

Máxima biomassa fúngica foi obtida após 20 dias de cultivo (90 ± 5,7 mg.g-1 de substrato seco), com um valor médio de 74 ± 5,6 mg.g-1 de substrato seco.

O fungo utiliza os açúcares redutores como fonte de carbono nos primeiros 5 dias. Após este período, quantidade desses açúcares permanece constante (hidrólise dos polissacarídeos no resíduo).

Máxima atividade de lacase (75 U.g-1 de substrato seco) foi obtida após 15 dias de cultivo, já o máximo de atividade Mn peroxidase (6,8 U.g-1 substrato seco) foi alcançado no 30º dia de cultivo.

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A produção das enzimas xilanase e endoglucanase pelo fungo, foi maior no 5º dia de cultivo, 0,65 ± 0,07 e 0,43 ± 0,05 U.mg-1 de substrato, respectivamente.

A produção de outras enzimas hidrolíticas, tais como: amilase e pectinase, foi baixa (valores inferiores a 0,2 U.g-1 de substrato seco).

A redução na quantidade de carboidratos totais solúveis nos meios de cultura (Figura 3), sugere que a pectina esteja sendo degradada. Apesar dos resultados não mostrarem uma efetiva produção de pectinases.

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O meio à base de resíduo de laranja proporcionou a obtenção de elevadas atividades de enzimas com grande potencial de uso industrial, especialmente lacase e manganês peroxidase.


5. Considerações finais Os resíduos de laranja gerados pela indústria de

sucos apresentam umidade superior a 80%;

O uso de resíduo de laranja serviu como um substrato adequado para o cultivo de P. ostreatus e produção das enzimas lacase e Mn peroxidase;

Altas atividades das enzimas foram produzidas em períodos relativamente curtos;

Níveis mais altos da Mn peroxidase foram detectados nos cultivos mais longos.

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6. Etapas futurasNovos experimentos devem ser realizados para

verificar se uma maior produção poderia ser obtida em cultivos com tempos de incubação superiores a 30 dias;

O aproveitamento dos resíduos de laranja com umidade inicial alta e sem a necessidade de secagem prévia, reduziriam ainda mais os custos de produção destas importantes enzimas.

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7. Referências bibliográficasAproveitamento do resíduo de laranja para a

produção de enzimaslignocelulolíticas por Pleurotus ostreatus (Jack:Fr)Ana Maria ALEXANDRINO, Haroldo Garcia de FARIA,

CristinaGiatti Marques de SOUZA, Rosane Marina PERALTA

Revista Ciência e Tecnologia de AlimentosRecebido para publicação em 1/8/2006 Aceito para publicação em 23/4/2007

Campinas, 27(2): 364-368, abr.-jun. 200734

BRIGADA!

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