UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
INSTITUTO DE NUTRIÇÃO JOSUÉ DE CASTRO
DA UVA AO SUCO: ANÁLISES SENSORIAL, DE COMPOSTOS BIOATIVOS E DE CAPACIDADE ANTIOXIDANTE E ESTABILIDADE
MICROBIOLÓGICA
Maria Lúcia Mendes Lopes
RIO DE JANEIRO
2014
MARIA LÚCIA MENDES LOPES
Da Uva ao Suco: Análises Sensorial, de Compostos Bioativos e de Capacidade Antioxidante e Estabilidade Microbiológica
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Nutrição (PPGN), do Instituto de
Nutrição Josué de Castro da Universidade
Federal do Rio de Janeiro, como parte dos
requisitos necessários à obtenção do título de
doutor em Ciências Nutricionais.
Orientadores: Vera Lúcia Valente Mesquita
Eliane Fialho de Oliveira
Rio de Janeiro
Outubro, 2014
Lopes, Maria Lúcia Mendes.
Da uva ao suco: análise sensorial, de compostos bioativos e de capacidade antioxidante e estabilidade microbiológica / Lopes, Maria Lúcia Mendes.– Rio de Janeiro: INJC, 2014.
xvi 122f. : il.; 31 cm.
Orientadores: Vera Lúcia Valente Mesquita e Eliane Fialho de Oliveira.
Tese (doutorado) -- UFRJ INJC- Programa de Pós-graduação em
Nutrição, 2014.
Referências bibliográficas: f. 69-83.
1. Vitis - microbiologia. 2. Compostos fenólicos. 3. Microbiologia de
alimentos. 4. Antioxidantes. 5. Sucos. 6. Biotecnologia Vegetal - Tese. I.
Mesquita, Vera Lúcia Valente. II. Oliveira, Eliane Fialho de. III. Universidade
Federal do Rio de Janeiro, INJC - Programa de Pós-graduação em
Nutrição. III. Título.
MARIA LÚCIA MENDES LOPES
Da Uva ao Suco: Análises Sensorial, de Compostos Bioativos e de
Capacidade Antioxidante e Estabilidade Microbiológica
Tese submetida ao corpo docente do
Programa de Pós-Graduação em Nutrição
(PPGN), do Instituto de Nutrição Josué de
Castro da Universidade Federal do Rio de
Janeiro, como parte dos requisitos
necessários para a obtenção do título de
doutor em ciências nutricionais.
Examinada por:
Mariana Costa Monteiro Prof. Adjunto do Instituto de Nutrição Josué de Castro - UFRJ
Prof. Antônio Jorge Ribeiro da Silva Prof. Titular do Instituto de Pesquisas de Produtos Naturais - UFRJ
Profª Nancy dos Santos Barbi Prof. Adjunto da Faculdade de Farmácia - UFRJ
Profª Anna Paola Trindade Rocha Pierucci Prof. Associado do Instituto de Nutrição Josué de Castro - UFRJ
Profª Cristiana Pedrosa Melo Porto Prof. Associado do Instituto de Nutrição Josué de Castro - UFRJ
Rio de Janeiro, RJ - Brasil
Outubro, 2014
Dedico este trabalho à minha mãe (in memoriam) e ao meu pai. Palavras não são suficientes, nem necessárias, para expressar minha gratidão a eles.
AGRADECIMENTOS A Deus por esta e todas as oportunidades.
Às professoras Vera Lúcia Valente Mesquita e Eliane Fialho, minha profunda gratidão pela orientação, por compartilharem comigo seu conhecimento e sua experiência, pela amizade, inspiração, generosidade e pelo grande exemplo.
Aos professores Marco Miguel e Antônio Jorge, por disponibilizarem seus laboratórios, compartilharem seu conhecimento e pelas valiosas contribuições ao trabalho. E ainda ao professor Marco, por assumir as atividades do nosso projeto de extensão, evitando a interrupção das mesmas durante meu afastamento.
I want to express my gratitude to Dr. Schwartz and his group, for having accepted me at their lab, enabling the accomplishment of my project.
Às professoras Cristiana Pedrosa e Adriana Farah, que assumiram atividades didáticas, antes sob minha responsabilidade, apoiando e viabilizando meu afastamento. Ao professor Fabiano Vinagre e Larissa Vieira pela colaboração nas atividades didáticas da disciplina.
À professora Débora Foguel pelas valiosas contribuições desde a fase inicial do projeto e qualificação deste trabalho.
À professora Mariana Costa Monteiro pela cuidadosa revisão da tese e pelas sugestões e críticas construtivas, e aos professores Cristiana Pedrosa, Anna Paola, Nancy Barbi, Antônio Jorge, Maria das Graças e Rosa Luchese por aceitarem o convite para fazerem parte da banca.
Aos amigos do grupo de pesquisa: Christiane, Flávia, Eliza, Yasmin, Kim, Paola, Denise, Marcelo, Ana Luisa, Renatinha, Luciana, Paula Costa, Paula Pedrote, Julia, Carol, Mabel, Beatriz Simbras, Fabiana e Iris, que acompanharam este trabalho, pelo apoio, pela descontração, pelos cafés filosóficos, pela companhia... Sem vocês o trabalho seria mais árduo.
À Sally e ao Mark e sua família, à Fabíola, à Manoela e ao Jean pela amizade, agradável convivência, deliciosas conversas e total apoio, que ajudaram a amenizar a saudade de casa.
Aos amigos e familiares pelo incentivo e por entenderem minhas ausências em momentos tão importantes...
Ao Higino e à Gabriela, pelo apoio, incentivo, compreensão, cuidado e carinho.
À Universidade Federal do Rio de Janeiro e ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição do Instituto de Nutrição Josué de Castro, pela oportunidade de ter realizado um curso de excelência. À FAPERJ pelo auxílio financeiro ao projeto, ao CNPq pelas bolsas de iniciação científica e a CAPES pela bolsa de doutorado sanduíche.
RESUMO
LOPES, Maria Lúcia Mendes. Da Uva ao Suco: Análises Sensorial, de Compostos Bioativos e de Capacidade Antioxidante e Estabilidade Microbiológica. 2014. 138 f. Tese (Doutorado em Ciências Nutricionais) - Instituto de Nutrição Josué de Castro, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2014.
As uvas são ricas em compostos fenólicos, que oferecem benefícios à saúde.
As variedades Isabel e Concord estão entre as mais utilizadas na produção de suco
no Brasil. Essa produção, quando realizada na própria propriedade rural ou em
cooperativas, representa alternativa para geração de renda para os produtores. O
processamento da uva pode causar alteração dos compostos bioativos e da
capacidade antioxidante no produto. O objetivo deste trabalho foi avaliar o teor de
compostos fenólicos totais, teor e perfil de antocianinas, capacidade antioxidante,
características físico-químicas e parâmetros colorimétricos dos produtos de uvas
de diferentes variedades e o efeito da extração de suco de uva sobre esses
parâmetros. Sucos de uva Isabel obtidos por diferentes métodos de extração foram
avaliados quanto aos teores de compostos fenólicos, antocianinas totais,
capacidade antioxidante, características físico-químicas e cor. A aceitabilidade
sensorial e estabilidade química e microbiológica dos sucos preparados por
extração a vapor também foram avaliadas. Em uvas da variedade Isabel, sua casca
e polpa, no suco obtido por extração a vapor e no resíduo obtido após a extração
do suco foram investigados o teor e o perfil de antocianinas, o teor de compostos
fenólicos e a capacidade antioxidante. Sucos de uva Concord orgânico e
convencional foram avaliados quanto aos parâmetros colorimétricos, capacidade
antioxidante e compostos fenólicos. Foi, também, verificado o efeito da alta pressão
hidrostática (APH) em uvas sobre o teor de compostos fenólicos no suco extraído a
vapor e no resíduo. O suco extraído a vapor apresentou maior teor de compostos
fenólicos solúveis, antocianinas e capacidade antioxidante, quando comparado aos
sucos preparados por outros métodos. O prolongamento do processo de extração
por 5h reduziu o teor de sólidos solúveis e acidez, assim como o teor de
antocianinas, enquanto o teor de compostos fenólicos solúveis e a capacidade
antioxidante aumentaram, especialmente entre a primeira e a segunda hora de
extração. Embora o suco extraído a vapor tenha se mantido microbiologicamente
estável durante a estocagem, houve redução no teor de compostos fitoquímicos,
principalmente nos cinco primeiros meses. Foram identificadas 15 antocianinas
majoritárias na casca da uva Isabel, no suco e no resíduo, sendo os derivados de
malvidina presentes em maior quantidade. O resíduo apresentou maior conteúdo
de compostos fenólicos e capacidade antioxidante quando comparado às demais
amostras. A extração a vapor promoveu alteração no perfil de antocianinas no suco
e no resíduo. Entre os sucos de uvas Concord orgânicas e convencionais, houve
diferença de cor, o teor de antocianinas foi maior no suco convencional e o teor de
compostos fenólicos totais, foi similar entre os sucos. O tratamento de uvas Isabel
por APH a 600 MPa permitiu maior extração de compostos fenólicos do resíduo da
uva, em relação ao tratamento a 400 MPa. Os resultados deste estudo demonstram
a influência de diferentes métodos de extração sobre a qualidade do suco de uva,
assim como o efeito da estocagem e da extração a vapor sobre características de
qualidade do mesmo. Demonstram, ainda, que o resíduo da produção de suco de
uva a vapor apresenta potencial para ser utilizado como fonte de compostos
bioativos.
Palavras-chave: Suco de uva. Extração a vapor. Compostos bioativos. Capacidade antioxidante. Resíduo de uva.
ABSTRACT LOPES, Maria Lucia Mendes. From Grapes to Juice: Sensory Evaluation, Bioactive Compounds, Antioxidant Capacity and Microbiological Stability. 2014. 138 p. Thesis - Instituto de Nutrição Josué de Castro, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2014.
Grapes are rich in phenolic compounds which possess health promoting
properties. The cultivars Isabel and Concord are among the most commonly used
for juice processing in Brazil. Juice production on the farm or in cooperatives is an
alternative to generate income for producers. Extraction procedure, however, can
affect bioactive compounds and antioxidant activity in the final product. The aim of
this study was to evaluate the content of total phenolics, anthocyanin content and
profile, antioxidant capacity, physicochemical characteristics and colorimetric
parameters of the products of different varieties of grapes and the effect of
extraction of grape juice on these parameters. Isabel grape juices prepared by
different methods were evaluated for polyphenols content, total anthocyanins,
antioxidant capacity, physicochemical characteristics and color. Acceptance of
steam extracted juices and chemical and microbiological stability of steam
extracted juice were also evaluated. In Isabel grapes, its skin and pulp, steam
extracted juice and pomace obtained after juice extraction, the content and profile
of anthocyanins and the antioxidant capacity were investigated. Organic and
conventional Concord grape juices were evaluated for colorimetric parameters,
phenolic compounds content, antioxidant capacity. It was also investigated the
effect of high hydrostatic pressure (HHP) in grapes on the content of phenolic
compounds in steam extracted juice and in pomace. The steam extracted juice
showed a higher content of soluble phenolic compounds and anthocyanins and
higher antioxidant capacity when compared to juices prepared by other methods.
The extension of the extraction process to 5h reduced soluble solids and acidity, as
well as the content of anthocyanins, while the content of soluble phenolic
compounds and antioxidant capacity increased, especially between the first and
second hour of extraction. Although the steam extracted juice has remained
microbiologically stable during storage, there was a reduction in the content of
phytochemical compounds, especially in the first five months. Fifteen anthocyanins
were identified in the skin, juice and residue of Isabel grape, being malvidin
derivatives present in greater quantity. The pomace showed higher levels of
phenolic compounds and antioxidant capacity when compared to other samples.
The steam extraction caused change in the profile of anthocyanins in the juice and
pomace. The colors of organic and conventional Concord juices were different. The
content of anthocyanins was higher in conventional juice and the content of total
phenolic compounds, similar in the juices. Pressurization of Isabel grapes at 600
MPa increased the extraction of phenolic compounds from grape residue in
comparison to 400MPa. Our results demonstrate the influence of different
extraction methods on the quality of grape juice, as well as the effect of storage and
extraction steam on characteristics of quality. They also demonstrated that the
pomace from steam extracted grape juice has the potential to be used as a source
of bioactive compounds.
Keywords: Grape juice. Steam extraction. Bioactive compounds. Antioxidant capacity. Grape pomace.
SUMÁRIO Página 1. INTRODUÇÃO 17 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 17 2.1. Uvas e suco de uva 17 2.2. Compostos fenólicos 23 2.2.1. Antocianinas em uva 27 2.2.2. Outros compostos fenólicos em uva 30 2.3. Compostos fenólicos, suco de uva e saúde 33 2.4. Influência do processamento sobre compostos bioativos 37 2.5. Métodos analíticos 39 3. JUSTIFICATIVA 47 4. OBJETIVOS 48 4.1. Objetivo Geral 48 4.2. Objetivos Específicos 48 5. CAPÍTULO 1. Suco de uva obtido por métodos de extração em pequena escala: teor de compostos fenólicos, capacidade antioxidante e estabilidade durante a estocagem
49 5.1. OBJETIVOS 49 5.2. MATERIAL E MÉTODOS 49 5.2.1. Preparo das amostras 49 5.2.2. Estabilidade do suco obtido por extração a vapor durante estocagem
50
5.2.3. Determinação de acidez total titulável, pH e sólidos solúveis totais
50
5.2.4. Análise colorimétrica 50 5.2.5. Determinação do teor de compostos fenólicos totais 51
5.2.6. Determinação do teor de antocianinas monoméricas totais 51 5.2.7. Capacidade antioxidante 52 5.2.8. Análise sensorial 52 5.2.9. Estabilidade microbiológica durante estocagem 53 5.2.10. Análises estatísticas 53 5.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 54 6. CAPÍTULO 2. Efeito da extração a vapor sobre antocianinas em uva Isabel (Vitis labrusca), suco e resíduo
55
6.1. OBJETIVO 55 6.2. MATERIAL E MÉTODOS 55 6.2.1. Preparo das amostras 55 6.2.2. Análies por CLAE e CLAE-IE-EM/EM 56 6.2.3. Quantificação de compostos fenólicos totais e antocianinas monoméricas totais
57
6.2.4. Determinação da capacidade antioxidante 57 6.2.5. Análises estatísticas 57 6.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 58
7. CAPÍTULO 3. Suco de uva Concord orgânico e convencional: cor, capacidade antioxidante e teor de antocianinas e de compostos fenólicos
59
7.1. INTRODUÇÃO 59 7.2. OBJETIVO 60 7.3 MATERIAL E MÉTODOS 60 7.3.1. Preparo das amostras 60 7.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 61 8. CAPÍTULO 4: Efeito de alta pressão hidrostática em uvas sobre o teor de compostos fenólicos no suco e resíduo
64
8.1. INTRODUÇÃO 64 8.2. OBJETIVO 65 8.3. MATERIAL E MÉTODOS 65 8.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 66 9. CONSIDERAÇÕES FINAIS 68 10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 69 11. ANEXOS 84 Anexo 1. Artigo I. Grape juice obtained by small-scale extraction methods: phenolic content, antioxidant capacity and stability during storage
85
Anexo 2. Artigo II. Effect of steam extraction on anthocyanins in Isabel grape (Vitis labrusca), juice, and pomace
112
Anexo 3. Termo de consentimento Livre e Esclarecido 138
LISTA DE FIGURAS Página Figura 2.1. Imagem ilustrativa da uva variedade Isabel 19 Figura 2. Estruturas químicas de flavonoides e subclasses de flavonoides 24 Figura 2.3. Estruturas químicas de compostos fenólicos não flavonoides 25 Figura 2.4. Distribuição de compostos fenólicos (indicado por setas) em uvas maduras
27
Figura 2.5. Estruturas das antocianidinas mais comumente encontradas em alimentos
29
Figura 2.6. Antocianinas comumente encontradas em uvas 30 Figura 2.7. Principais flavan-3-ois e flavonois encontrados em uvas 33 Figura 2.8. Variação das estruturas químicas das antocianinas em diferentes valores de pH
40
LISTA DE ABREVIATURAS
APH Alta pressão hidrostática CFH Compostos Fenólicos Hidrolisáveis CFS Compostos Fenólicos Solúveis CIE Commission International d’Eclairage CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência DPPH Radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazila EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa) Fe+3- TPTZ Complexo tripiridiltriazina férrico Fe+2-TPTZ Complexo tripiridiltriazina ferroso FRAP Ferric reducing ability of plasma LC-ESI-MS/MS Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria
de massas em série com ionização por electrospray TOF Time-of-flight mass analyzer WCRF/AICR World Cancer Research Fund/American Institute for Cancer Research Anexos 1 e 2 ANOVA Analyses of variance ac Acetyl cou Coumaroyl Cy Cyanidin Dp Delphinidin g Glucoside Mv Malvidin m/z ratio of mass to charge
Pn Peonidin Pt Petunidin DPPH 2,2-di-phenyl-1-picrylhydrazil ESI–MS/MS Electrospray ionization tandem mass spectrometry FW Fresh weight HP Hydrolyzable polyphenols HPLC–DAD High-performance liquid chromatography with photodiode array
detection QTof Quadrupole/time-of-flight mass spectrometer SP Soluble polyphenols TPTZ 2,4,6-tris (2-pyridyl)-s-tri-azine Trolox 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylicacid TSS Total soluble solid content TTA Total titratable acidity TA Total monomeric anthocyanins content
PRODUÇÃO VINCULADA À TESE
Pacheco F, Simbras BD, Fialho E, Miguel MAL, Lopes MLM, Valente Mesquita
VL. Estabilidade de compostos bioativos durante estocagem do suco de uva. XXXVI Jornada Giulio Massarani de iniciação científica, tecnológica artística e cultural da UFRJ, 16-10 out 2014
Pacheco F, Lopes MLM, Fialho E, Valente Mesquita VL. Teor de compostos
fenólicos e capacidade antioxidante de uvas cultivar isabel, suco e resíduo. XXXVI Jornada Giulio Massarani de iniciação científica, tecnológica artística e cultural da UFRJ,16-10 out 2014
Lopes, MLM; Fialho, E; Valente Mesquita, VL. Efeito do processamento sobre
o perfil de antocianinas de uvas da variedade isabel. VI Encontro Sabores e Saberes e II Jornada do PPGN, 27 e 28 ago 2014
Lopes, MLM; Riedl, K; Schwartz, SJ; Fialho, E; Valente Mesquita, VL.
Anthocyanin profiles of red grape cultivar Isabella and its skin, juice and pomace. 17th IUFoST World Congress of Food Science and Technology and Expo, 2014. Montreal. Canadá, 15-21 ago 2014
Lopes MLM, Fialho E, Valente Mesquita VL. Phenolic compounds content and
antioxidant capacity of grape cultivar Isabella and its juice and pomace. 17th IUFoST World Congress of Food Science and Technology and Expo, 2014. Montreal. Canadá, 15-21 ago 2014
Pacheco F, Queiroz C, Lopes MLM, Fialho E, Valente Mesquita VL. Análise
comparativa da capacidade antioxidante do suco de uva Concord orgânico e convencional. XXXV Jornada Giulio Massarani de Iniciação Científica, Artística e Cultural da UFRJ, 30 set - 04 out 2013
Lopes MLM, Inada KOP, Gonzalez YCFC, Pacheco F, Queiroz C, Fialho E,
Valente MesquitaVL. Antioxidant activity and total phenolic compounds in grape juices produced in small scale. VI International Conference on Polyphenols and Health. Buenos Aires, Argentina, 16-19 out 2013
Pacheco, FM; Inada, KOP; Gonzalez, YCFC; Lopes, MLM; Valente-Mesquita, VL.
A cor do suco de uva é influenciada pelo método de extração? IV Encontro de Sabores e Saberes – UFRJ, Rio de Janeiro, 27e 28 ago 2012
Gonzalez, YCFC; Inada, KOP; Lopes, MLM; Fialho, E; Valente-Mesquita, VL.
Influência de métodos domésticos de extração de suco de uva sobre o teor de compostos fenólicos e capacidade antioxidante. XXXIV Jornada Giulio Massarani de Iniciação Científica, Artística e Cultural da UFRJ, 01-05 out 2012
Gonzalez, YCFC; Inada, KOP; Lopes, MLM; Oliveira, EF; Valente-Mesquita, VL.
Avaliação sensorial de suco de uva extraído por arraste de vapor. XXXIV Jornada
Giulio Massarani de Iniciação Científica, Artística e Cultural da UFRJ, 01-05 out 2012
Inada KOP, Gonzalez YCFC, Lopes MLM, Fialho E, Valente Mesquita VL.
Extração de suco de uva por arraste de vapor: influência do tempo de extração sobre rendimento, parâmetros físico-químicos e cor. XXXIII Jornada Giulio Massarani de Iniciação Científica, Artística e Cultural da UFRJ, 03-07 out 2011
Lopes, MLM; Inada, KOP; Gonzalez, YC; Fialho, E; Valente Mesquita, VL.
Parâmetros colorimétricos de suco de uva obtido por extração a vapor. 11º Congresso Nacional da Sociedade Brasileira de Alimentação e Nutrição – SBAN, Fortaleza – CE, 20-23 de jun 2011
17
Da uva ao suco: análises sensorial, de compostos bioativos e capacidade antioxidante e
estabilidade microbiológica.
1. INTRODUÇÃO
O consumo de frutas e hortaliças está associado à redução do risco de ocorrência
de doenças crônicas não transmissíveis (DCNTs), como doenças cardiovasculares, alguns
tipos de câncer e doenças neurodegenerativas (CROWE et al., 2011; DE PASCUAL-
TERESA, 2014; OYEBODE et al., 2014), o que tem sido atribuído à sua composição em
vitaminas, minerais, fibras e compostos bioativos (AJILA et al., 2007; MARMOT, 2011;
VAUZOUR et al., 2010). As evidências de benefícios à saúde levaram a Organização
Mundial da Saúde a recomendar o consumo diário de pelo menos 400 g desses alimentos
(WHO, 2003) e o World Cancer Research Fund/American Institute for Cancer Research
(WCRF/AICR), o consumo de pelo menos cinco porções de frutas e hortaliças sem amido
por dia (NORAT et al., 2014). Dentre os alimentos associados a propriedades benéficas à
saúde estão as uvas, que são amplamente cultivadas e consumidas em diversas partes do
mundo, e os produtos derivados como sucos de uva e vinhos, todos ricos em compostos
fenólicos (XIA et al., 2010). Considerando que a produção do suco em pequena e média
escala é de grande importância econômico-social, ao proporcionar uma alternativa para
geração de renda aos produtores de uva e suas famílias, e que o processamento da uva
para a produção de suco pode modificar os compostos bioativos no produto (LEBLANC;
JOHNSON; WILSON, 2008; PATRAS et al., 2010), a investigação do efeito do
processamento sobre a qualidade dos produtos obtidos por diferentes processos pode
contribuir para melhor utilização da fruta.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Uvas e suco de uva
As uvas estão entre as frutas mais cultivadas e consumidas em todo o mundo; são
ricas em compostos fenólicos, que oferecem benefícios à saúde (ZHOU; RAFFOUL, 2012).
Além de serem consumidas in natura, as uvas são, também, utilizadas na fabricação de
sucos, vinhos e outros produtos (IACOPINI et al., 2008). A produção mundial dessa fruta
foi superior a 67 milhões de toneladas em 2012 (FAOSTAT, 2014). Nesse mesmo ano, no
Brasil, foram produzidas, aproximadamente, um milhão e meio de toneladas de uva,
18
sendo mais de 50% no Rio Grande do Sul (IBGE, 2012). Tem sido observada forte
expansão da produção de uvas para regiões tropicais, como Mato Grosso, Goiás e Vale do
Rio São Francisco (CAMARGO; MAIA, 2005). O cultivo na região do semiárido brasileiro
teve início na segunda metade da década de 1980, com o plantio de variedades
adaptadas à região. Os polos de frutas de Petrolina/PE e de Juazeiro/BA, no submédio
São Francisco, são responsáveis por 95% das exportações nacionais de uvas de mesa
(BRASIL, 2014).
Uvas da espécie Vitis vinifera são denominadas como finas e comumente
utilizadas na fabricação de vinhos. Exemplares dessa espécie foram as primeiras uvas
introduzidas no Brasil, trazidas pelos portugueses. A denominação "uvas rústicas" ou
"uvas comuns" é utilizada para as cultivares de uvas americanas (Vitis labrusca e Vitis
bourquina) e híbridas de diferentes espécies de Vitis (CAMARGO; MAIA, 2005), a partir
das quais é produzido o suco de uva. Cultivares de uvas americanas ou híbridas
representam mais de 80% do volume de uvas processadas no Brasil (IBRAVIN, 2014).
A uva 'Isabel' (Vitis labrusca) (Figura 2.1.), uma variedade de uva tinta, é,
também, conhecida como “Americana”, “Uva Manga” e “Nacional”, no Brasil, além de
“Frutilla”, no Uruguai e “Fragola”, na Itália (RIZZON; MANFROI; MENEGUZZO, 1998). É
originária do Sul dos Estados Unidos e foi introduzida no Brasil, inicialmente no Rio
Grande do Sul, em meados do século XIX, levando à substituição dos vinhedos de uvas
européias e permitindo a consolidação da viticultura brasileira. Essa variedade
proporciona colheitas abundantes com poucas intervenções de manejo. A expansão do
seu cultivo deveu-se à facilidade de adaptação às condições edafoclimáticas, elevada
produtividade, longevidade e relativa rusticidade desta variedade (CAMARGO; MAIA,
2005; GRIGOLETTI Jr. & SÔNEGO, 1993). No Rio Grande do Sul, a colheita da uva Isabel
concentra-se nos meses de janeiro e fevereiro e é destinada, sobretudo, à elaboração de
suco e de vinho tinto de mesa (vinho com teor alcoólico de 10% a 13% em volume, a
20°C (Brasil, 2004). Uma pequena porcentagem da produção é destinada à elaboração
de vinagre e geléias e ao mercado de uvas de mesa (CAMARGO; MAIA, 2005; PROTAS;
CAMARGO, 2010). Atualmente, a uva Isabel representa aproximadamente 40% de toda a
uva processada para produção de vinhos, sucos e outros produtos, o que correspondeu,
em 2012, a mais de 250 mil toneladas (MELLO; MACHADO, 2013).
19
Figura 2.1. Imagem ilustrativa da uva variedade Isabel (Fonte: fruticultura.iciag.ufu.br)
Suco de uva é a bebida não fermentada e não diluída, obtida da parte comestível
da uva (Vitis ssp.), por meio de processo tecnológico adequado (BRASIL, 2000). Pode ser
classificado como: suco de uva, suco de uva concentrado, suco de uva desidratado e suco
de uva reprocessado ou reconstituído. A designação integral ou simples só deve ser
usada para o suco de uva sem adição de açúcares e na sua concentração natural. Quando
adicionado de açúcares, o rótulo deve conter a designação suco adoçado (BRASIL, 2004).
A legislação brasileira estabelece, ainda, a quantidade mínima de suco de uva na
composição de bebidas de uva. O néctar deve conter 30% de suco a partir de
12/09/2013, 40% a partir de 31/01/2015 e 50% a partir de 31/01/2016 (BRASIL,
2013b) e o preparado em pó para refresco, 1%, em peso, de suco desidratado (BRASIL,
2013a).
Como a produção de uvas e sua disponibilização para o consumo é sazonal, o
processamento para a produção de suco viabiliza a conservação, a estocagem e o
consumo em épocas do ano, em que a fruta in natura não se encontra disponível.
Embora o processamento da uva para a produção de vinho seja feita desde a
antiguidade, a produção de suco processado teve início somente em 1868, quando Dr.
Welch, um dentista de Nova Jersey, aplicando a teoria desenvolvida por Louis Pasteur,
cozinhou as uvas alguns minutos, espremeu o suco usando um pano e colocou o suco em
garrafas que foram fechadas com rolhas de cortiça e cera e fervidas, dando origem a
indústria de suco de uva (MCLELLAN; RACE, 1999).
No Brasil, a produção de suco de uva concentra-se, historicamente, no Rio Grande
do Sul, mas vem se expandindo para regiões tropicais do país (CAMARGO; MAIA, 2005).
20
Na cadeia vitivinícola brasileira, o segmento produtivo de suco de uva tem se mostrado o
mais estável e competitivo. Nos últimos anos, a produção de vinho de mesa e néctar de
uva tem oscilado, ao contrário do que ocorre com o suco de uva, especialmente o suco
integral, que vem apresentando crescimento sistemático. Em 2014, a comercialização do
suco de uva foi superior a 47 milhões de litros, tendo aumentado 16,7% em relação a
2013 e 53,7% em relação a 2012 (UVIBRA, 2014). O mercado do suco concentrado,
também, vem registrando expansão, com crescimento de 17,2% e venda de 17,6 milhões
de quilos entre 2012 e 2013 (IBRAVIN, 2013).
Para a elaboração de suco de uva, no Brasil, utilizam-se, principalmente, uvas
americanas e híbridas. Entre essas, destacam-se as variedades Isabel, Concord e Bordô,
todas da espécie Vitis labrusca (IBRAVIN, 2014; TERRA et al., 2001). As uvas Isabel, pela
grande disponibilidade de matéria-prima, são responsáveis pelo maior volume de suco
produzido (BRESOLIN; GULARTE; MANFROI, 2013; CAMARGO; MAIA; RITSCHEL, 2010).
Para obtenção de produtos com a intensidade de coloração que o mercado exige, sucos
elaborados com essa uva podem ser cortados (usados em combinação) com suco de
cultivares tintureiras, como a Bordô. Novos híbridos de uvas tintureiras como ‘BRS
Rúbea’, ´BRS Cora’ e ‘BRS Violeta’, desenvolvidos pela Empresa Brasileira de Pesquisa
Agropecuária (Embrapa) Uva e Vinho, podem, também, ser usados em corte com a Isabel
(PROTAS; CAMARGO, 2010).
O tipo de processamento aplicado para a fabricação do suco de uva pode
influenciar a estabilidade e o teor de compostos bioativos, asim como a cor do produto
(FULEKI; RICARDO-DA-SILVA, 2003; THRELFALL et al., 2005). O processo mais
difundido para a produção industrial de suco de uva integral consiste na extração a
quente. Neste, as uvas são separadas do engace, esmagadas e aquecidas a temperaturas
entre 60 e 80 °C. Em seguida, a temperatura é reduzida para 50 a 60°C, permanecendo
nessa temperatura por 1 a 2h para ação de enzimas pectinolíticas comerciais
adicionadas ao mosto (mistura obtida com a ruptura mecânica das uvas). O mosto é
drenado e o resíduo, prensado e centrifugado. Se a prensagem é realizada a quente,
pode-se maximizar o rendimento e a extração da cor. Procedem-se, em seguida, as
etapas de clarificação, pasteurização e engarrafamento (RIZZON; LINK, 2006).
A produção do suco de uva em pequena e média escala na própria propriedade
rural agrega valor ao produto, permite aproveitamento econômico de excessos de
produção das frutas e evita a transferência de renda do setor rural para o industrial,
21
representando alternativa para geração de renda dos produtores rurais e suas famílias.
O surgimento de pequenas agroindústrias contribui, assim, para melhor distribuição de
renda e para a estabilidade do setor vitivinícola (BRESOLIN; GULARTE; MANFROI, 2013;
RIZZON; MENEGUZZO, 2007). Por isso, a EMBRAPA Uva e Vinho incentiva os produtores
de uva de pequenas e médias propriedades a processar parte de suas colheitas (RIZZON;
MENEGUZZO, 2007).
A extração de suco de uva por arraste a vapor difundiu-se entre os produtores
rurais no Rio Grande do Sul, por ser um método de fácil operação e não apresentar
custos elevados de instalação e operação, sendo utilizado para produção de suco para
consumo próprio e para comercialização (BRESOLIN; GULARTE; MANFROI, 2013).
Nesse processo, o vapor de água entra em contato com a uva para extração do suco, que
é engarrafado a quente e pode ser estocado, sem adição de conservantes, por até dois
anos. No entanto, tem sido demonstrado que há incorporação de água ao suco obtido
por esse processo, causando diluição do mesmo e reduzindo o teor de sólidos solúveis
(BRESOLIN; GULARTE; MANFROI, 2013; CRISTOFOLI, 2007; RIZZON; MANFROI;
MENEGUZZO, 1998). Assim, embora esse método seja utilizado pela maioria das
agroindústrias familiares da região sul do país, em 2011, a Superintendência do
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento no Estado, suspendeu,
provisoriamente, o registro para o suco de uva produzido por esse processo, com a
alegação de que a incorporação de água ao suco descaracteriza o produto como suco
integral. Nova orientação do mesmo Ministério, no entanto, autorizou a concessão e
prorrogação de registros por três anos, período durante o qual o tema está sendo
estudado, visando à criação de um regulamento técnico específico para o produto, bem
como a proposição de adequações no processo e na legislação existente (BRESOLIN;
GULARTE; MANFROI, 2013).
Sucos de uva produzidos pelo método de arraste a vapor não devem ser
aquecidos a mais de 85-90 °C para evitar a caramelização e alterações de sabor
(RIZZON; MANFROI; MENEGUZZO, 1998). Aquecimento a 80 °C apresenta os melhores
resultados na análise sensorial, enquanto que aqueles produzidos a 60 °C e acima de 85
°C não apresentam boas características de aroma e sabor (VENTURIN, 2004).
A composição química do suco de uva varia em função da variedade usada para a
sua fabricação, das condições de cultivo da uva e das condições de processamento
aplicadas na produção do mesmo. De modo geral, o suco é rico em glicose e frutose,
22
contém os ácidos tartárico, málico e cítrico, além de potássio, cálcio, magnésio,
manganês, sódio, ferro, fosfatos, sulfatos e cloretos. Estão, ainda, presentes, tiamina,
riboflavina, niacina e ácido ascórbico, além de compostos fenólicos e pectina (RIZZON;
MENEGUZZO, 2007). O suco de uva é rico em diversos compostos fenólicos que
influenciam suas características sensoriais e trazem benefícios à saúde (BURIN et al.,
2010; ZHOU; RAFFOUL, 2012). Tais compostos serão abordados no item 2.2.
As características sensoriais são determinantes para a aceitação do suco de uva
pelos consumidores. Por isso, a análise sensorial é indispensável para a avaliação da
qualidade do suco, comparação dos produtos de diferentes safras de uvas, variedades,
processamentos, bem como avaliação da sua aceitação (PEREIRA et al., 2008). A cor,
conferida, principalmente, pelas antocianinas, no caso dos sucos tintos, é, geralmente, a
primeira característica percebida pelo consumidor (WROLSTAD; DURST; LEE, 2005a). A
presença de açúcares, ácidos e compostos fenólicos garante equilíbrio entre os gostos
doce, ácido e amargo do suco de uva (RIZZON; MENEGUZZO, 2007).
A produção de sucos de uva e vinhos gera resíduos, que correspondem a até 20%
da massa da uva e são, tradicionalmente, considerados um problema econômico e
ambiental para os produtores. Sendo produzido em grandes quantidades em um curto
período de tempo durante a estação de colheita das uvas, o resíduo consiste,
principalmente, de cascas e sementes e, dependendo do processamento empregado,
inclui, também, os engaços de uvas que permanecem após a fabricação de vinho e suco
(AUGUSTINE et al., 2013; ROCKENBACH et al., 2011b). O resíduo, bagaço ou co-produto
do processamento de uva tem sido reconhecido como fonte para obtenção de compostos
bioativos. Pesquisas têm sido realizadas visando melhor caracterização dos compostos
presentes e melhor aproveitamento desses (ROCKENBACH et al., 2011b; RUBILAR et al.,
2007). O aproveitamento integral da planta pode trazer benefícios econômicos para os
produtores e reduzir o impacto ambiental do descarte. Grande diversidade de produtos
com potencial benéfico à saúde pode ser obtida pelo processamento do resíduo para
obtenção de produtos como a geléia ou aplicação industrial dos extratos como
antioxidantes, antimicrobianos, flavorizantes, corantes, entre outros, incentivando a
agroindústria (AYALA-ZAVALA et al., 2011).
Tem sido observada, recentemente, tendência de retorno à utilização de produtos
naturais, com aplicação mínima de processos severos de extração e uso de solventes
orgânicos. Patentes relacionadas à saúde humana mostram maior aplicação
23
farmacológica de suco de uva e outros produtos ricos em compostos fenólicos. Essa
substituição ou uso como coadjuvante com fármacos tem se mostrado bastante
promissora (GOLLUCKE; RIBEIRO, 2012).
2.2. Compostos fenólicos
Os compostos fenólicos se caracterizam por terem um (monofenol) ou mais
(polifenol) anéis aromáticos, no qual, pelo menos um hidrogênio é substituído por um
grupamento hidroxila. São altamente reativos e atuam como substratos para diversas
enzimas como polifenoloxidases, peroxidases, glicosidases e esterases. Esses compostos
podem sofrer reações enzimáticas e químicas durante o armazenamento de alimentos
pós-colheita e processamento (DAI; MUMPER, 2010).
A natureza, síntese e distribuição dos compostos fenólicos variam,
significativamente, entre as espécies de plantas. Alguns são ubíquos, enquanto outros
são restritos a espécies específicas, como as isoflavonas em leguminosas (CHEYNIER,
2005). Mono e polifenóis são originados do metabolismo secundário de plantas e
milhares de compostos fenólicos de plantas já foram identificados. A diversidade
estrutural desses compostos deve-se à grande variedade de combinações moleculares
que acontecem na natureza, variando desde compostos de baixo peso molecular, com
um único anel aromático, até compostos complexos de alto peso molecular, com vários
anéis aromáticos, como os taninos. A maioria está presente na forma glicosilada, com
diferentes unidades de açúcares e ácidos orgânicos ligados em diferentes posições da
molécula (DAI; MUMPER, 2010; WAHLE et al., 2010). A síntese dos compostos fenólicos
está, geralmente, associada a respostas de defesa da planta contra danos causados por
fatores bióticos, como ataque de patógenos, ou abióticos, como estresse causado por
condições ambientais adversas, como restrição hídrica, temperaturas extremas ou alta
incidência de raios UV. Sua principal função nas plantas é a de defesa contra os danos
causados por esses fatores (ZHAO et al., 2005). Em alimentos, esses compostos são
responsáveis ou contribuem com características sensoriais como cor, adstringência,
sabor amargo ou picante e aroma, além de conferir estabilidade oxidativa (LORRAIN et
al., 2013; PINTO et al., 2011).
Os polifenois podem ser classificados em flavonoides e não flavonoides
(CHEYNIER, 2005; TSAO, 2010; WAHLE et al., 2010). Os flavonoides apresentam
estrutura básica constituída por 15 átomos de carbono, organizados na configuração
24
C6(anel A)-C3(anel C)-C6(anel B), em que dois anéis aromáticos, A e B, são unidos por
três carbonos que formam um anel heterocíclico, C. Com base nas variações no padrão
de hidroxilação e nos radicais ligados ao anel C, os flavonóides podem ser divididos em
sub-grupos como: flavanois, flavonas, flavanonas, flavonois e antocianidinas (WAHLE et
al., 2010) (Figura 2.2.).
Figura 2.2. Estruturas químicas flavonoides e subclasses de flavonoides
(Adaptado de Balasundram; Sundram; Samman, 2006).
Os compostos fenólicos não flavonoides incluem os ácidos fenólicos
hidroxibenzóicos (estrutura C6-C1) e hidroxicinâmicos (estrutura C6-C3) e os
estilbenos. Os ácidos fenólicos são constituídos por um anel benzeno com uma cadeia de
carbonos alifática. Eles se diferenciam pelas substituições no anel benzeno (Figura 2.3.).
Os estilbenos possuem dois anéis benzeno ligados por uma cadeia de etano ou etileno
(LORRAIN et al., 2013).
As uvas estão entre as frutas que possuem maior teor de compostos fenólicos
com atividade antioxidante e entre as mais consumidas no mundo (IACOPINI et al.,
2008). Diferentes compostos fenólicos estão presentes especialmente na casca e nas
sementes das uvas, e estão sujeitos à extração parcial durante os processos de
fabricação de suco e vinho (REVILLA; RYAN, 2000; THRELFALL et al., 2005).
Em videiras, a síntese e o acúmulo de compostos fenólicos são influenciados por
diversos fatores como variedade, práticas viticulturais, condições ambientais, estádio de
maturação e processamento pós-colheita (TEIXEIRA et al., 2013). No entanto, o perfil
25
desses compostos é definido, principalmente, pelas diferenças varietais ou genéticas.
Uvas tintas apresentam maior teor de compostos fenólicos, principalmente devido à
presença de antocianinas. O teor desses compostos é, geralmente, maior em uvas de cor
mais escura (LIANG et al., 2011b). Assim, os sucos tintos, também apresentam maior
teor de compostos fenólicos (DANI et al., 2007).
Ácidos hidroxibenzóicos Ácidos hidroxicinâmicos
ácido p-hidroxibenzoico ácido protocatecuico ácido vanílico ácido gálico ácido siríngico
R1 R2 R3 R4
H H OH H H OH OH H H OCH3 OH H H OH OH OH H OCH3 OH OCH3
ácido p-cumárico ácido cafeico ácido ferúlico ácido sinápico
Estilbeno
Trans-resveratrol
Figura 2.3. Estruturas químicas de compostos fenólicos não flavonoides
(LORRAIN et al., 2013).
A localização geográfica e a estação do ano são os fatores que mais influenciam o
teor de compostos fenólicos de uma variedade de uva, particularmente devido à
incidência de luz e à temperatura (TEIXEIRA et al., 2013). Cazarin et al. (2013)
observaram que o teor de compostos fenólicos em uma mesma variedade de uva
produzida no mês de setembro foi significativamente maior que no mês de março.
Práticas de cultivo como uso de irrigação, orientação das linhas no plantio e outros
manejos culturais podem melhorar a interação da planta com luz e temperatura
(TEIXEIRA et al., 2013). A distribuição dos compostos fenólicos na uva e em diferentes
estádios de desenvolvimento da planta está apresentada no Quadro 2.1.
26
Quadro 2.1. Compostos fenólicos produzidos e acumulados na uvaa.
Composto
Parte da uva Escala fenológica da uvab
Casca Polpa Semente Verde Início da
maturação Madura
Não flavonoides
Ácidos
hidroxicinâmicos ++ +++ ++ +++ + +
Ácidos
hidroxibenzoicos + - ++
Estilbenos +++ + ++ + ++ +++
Flavonoides
Flavonois ++ - - + +++ ++
Flavan-3-ois ++ + +++ ++ +++ ++
Antocianinas +++ -* - - + +++
*Uvas tintureiras contêm antocianinas também na polpa. aAdaptado de Teixeira
et al. (2013). b Escala de mudanças morfológicas relacionadas ao ciclo da cultura.
A Figura 2.4. ilustra a estrutura de uma uva madura e o padrão de distribuição de
compostos fenólicos nos órgãos e tecidos. O teor de compostos fenólicos apresenta
consideráveis oscilações, que são intimamente influenciadas pelos índices de
precipitação pluviométrica. Como o ponto ótimo de colheita da uva é, tradicionalmente,
determinado pela avaliação da maturação tecnológica, com base no peso das bagas, teor
de sólidos solúveis totais, acidez titulável e pH, é comum que, nessa fase, as bagas não
apresentem o teor máximo de compostos fenólicos (PALLIOTTI et al., 2014). A avaliação
comparativa entre uvas e sucos de uvas obtidas pelo sistema convencional e orgânico
indicam maior teor de compostos fenólicos totais, resveratrol e capacidade antioxidante
nos produtos provenientes do cultivo orgânico. No entanto, os estudos não são
conclusivos, devido às oscilações observadas entre variedades e estádios de maturação
(DANI et al., 2007; MULERO; PARDO; ZAFRILLA, 2010).
27
Casca: Ácidos hidroxicinâmicos (p-
cumárico, cafeico, ferúlico), Ácidos
hidroxibenzoicos (gálico, gentísico,
salicílico), Estilbenos (resveratrol,
viniferinas), Flavonois (quercetina,
kaempferol, miricetina), Flavan-3-
ois (catequina, epicatequina,
epigalocatequina,
proantocianidinas, antocianinas)
Polpa: Ácidos hidroxicinâmicos (p-
cumárico, cafeico, ferúlico), Flavan-3-ois
(catequina, epicatequina,
epigalocatequina), aAntocianinas
Semente: Ácidos
hidroxicinâmicos (p-cumárico,
cafeico, ferúlico), Ácidos
hidroxibenzoicos (gentísico,
salicílico), Estilbenos
(resveratrol, viniferinas),
Flavonois (quercetina,
kaempferol, miricetina), Flavan-
3-ois (catequina, epicatequina,
galocatequina, epigalocatequina,
catequina-3-O-galato,
proantocianidinas)
Figura 2.4. Distribuição de compostos fenólicos (indicado por setas) em uvas
maduras. a Em variedades tintureiras (adaptado de Teixeira et al., 2013).
2.2.1. Antocianinas em uva
As antocianinas são flavonoides amplamente distribuídos na natureza. São
pigmentos solúveis em água, responsáveis pela maioria das cores azul, violeta e
vermelho em flores e frutos. Ocorrem primariamente como O-glicosídios e
acilglicosídios de suas respectivas antocianidinas, ou seja, são derivados
metoxílicos/polihidroxílicos glicosilados de sais de fenil-2-benzopirílio. Seis
antocianidinas (Figura 2.5.) são comuns em plantas superiores: pelargonidina,
peonidina, cianidina, malvidina, petunidina e delfinidina. Assim como os demais
flavonóides, as antocianidinas são constituídas por um esqueleto C6-C3-C6. A
glicosilação ocorre com mono-, di- ou trissacarídeos compostos, principalmente, por
glicose. Contudo, galactose, arabinose, ramnose e xilose, também podem estar presentes,
geralmente na posição 3 do anel C e, em alguns casos, nas posições 5 ou 7 do anel A
(COOPER-DRIVER, 2001). A presença de uma carga positiva em pH ácido (cátion
flavilium) é uma característica única das antocianinas e tem influência sobre os métodos
utilizados para identificação e quantificação, bem como sobre os mecanismos de
absorção e metabolismo das mesmas (PRIOR, 2012). A estrutura das antocianinas varia
com o número e a posição dos grupos hidroxila e metoxila, tipo, número e posição dos
28
glicosídeos ligados à molécula e presença, identidade e número de ácidos alifáticos ou
aromáticos ligados aos glicosídeos (PRIOR; WU, 2006), o que torna possível encontrar
mais de 500 tipos de antocianinas na natureza (DE PASCUAL-TERESA, 2014).
O perfil de antocianinas do fruto confere características cromáticas específicas ao
mesmo. Esse perfil é utilizado como critério para caracterização varietal de uvas tintas
(GÓMEZ-ALONSO et al., 2007; HE et al., 2010b). De acordo com o número de
substituintes no anel B das antocianinas, estas podem ser divididas em dois grupos: um
de 3’-substituintes, incluindo cianidina e peonidina monoglicosídios e seus derivados
acilados; e outro, de 3’,5’-substituintes, composto por formas glicosiladas de delfinidina,
petunidina e malvidina e seus derivados acilados. As antocianinas pertencentes a cada
um dos grupos são formadas por diferentes precursores, sendo antocianinas 3’-
substituídas, provenientes de dihidroquercetina e antocianinas 3’,5’- substituídas, de
dihidromiricetina (GÓMEZ-ALONSO et al., 2007; HE et al., 2010b).
Os comprimentos de onda de absorbância máxima são menores em antocianinas
com dois substituintes no anel B (cianidina e peonidina, max 512nm), quando
comparados àquelas com três substituintes (delfinidina, petunidina e malvidina, max
entre 518 e 520nm). O comprimento de onda de máxima absorbância aumenta com o
número de grupamentos hidroxila no anel B. A substituição de grupamentos hidroxila
por metoxila, por outro lado, leva ao seu decréscimo. Assim, são obtidos valores em
ordem decrescente para delfinidina, petunidina, cianidina, malvidina e peonidina (HE et
al., 2010b; HEREDIA et al., 1998).
29
Antocianidinas R1 R2 R3
Cianidina OH OH H
Delfinidina OH OH OH
Pelargonidina H OH H
Petunidina OMe OH OH
Malvidina OMe OMe OMe
Peonidina OMe OH H
Figura 2.5. Estruturas das antocianidinas mais comumente encontradas em
alimentos (VALLS et al., 2009).
As antocianinas estão localizadas, principalmente, nos vacúolos das células da
casca das uvas tintas (COOPER-DRIVER, 2001) e também na polpa, no caso de uvas
tintureiras (HE et al., 2010b), constituindo a maior porcentagem de compostos fenólicos,
determinantes para os atributos sensoriais de produtos como o suco e o vinho (MUÑOZ-
ESPADA et al., 2004). As principais antocianinas encontradas em uvas e seus produtos
são malvidina, cianidina, delfinidina, petunidina e peonidina. A presença de
pelargonidina foi, também, detectada em algumas espécies de uvas (HE et al., 2010a;
WANG; RACE; SHRIKHANDE, 2003). As antocianinas presentes em uvas V. viniferas são
C
30
monoglicosiladas na posição C3. A presença peculiar de antocianinas 3,5-O-diglicosídeos
em variedades de uvas não viníferas como V. labrusca, V. rotundifolia e V. rupestris é
usada para distinguí-las das V. Viniferas. A diversidade de antocianinas encontradas nas
uvas é aumentada com a acilação da fração glicídica com ésteres de ácido acético,
coumárico e cafeico (Figura 2.6.). O perfil de antocianinas é usado, entre outros, para o
estudo quimiotaxonômico de uvas e para verificar o tipo de uva presente em
determinados produtos, podendo ser útil, neste caso, para a detecção de fraudes
(FLAMINI, 2013; MCCALLUM et al., 2007). Mesmo em pequenas quantidades, a presença
de antocianinas pode ter importância significativa sob aspecto sensorial (STINTZING;
CARLE, 2004) e fisiológico (WU; PITTMAN; PRIOR, 2004).
pelargonidina-3-O-glicosídeo R1=H; R2=H
cianidina-3-O-glicosídeo R1=H; R2=OH
peonidina-3-O-glicosídeo R1=OCH3; R2=H
delfinidina-3-O-glicosídeo R1=OH; R2=OH
petunidina-3-O-glicosídeo R1=OCH3; R2=OH
malvidina-3-O-glicosídeo R1=OCH3; R2=OCH3
R3=H, glicose
R4=H, acetil, cumaroil, cafeoil
Figura 2.6. Antocianinas comumente encontradas em uvas (DE ROSSO et al.,
2012).
Os diferentes padrões de hidroxilação e glicosilação modulam as propriedades
antioxidantes das antocianinas, pois o número e a posição da hidroxilação e metoxilação
no anel B influenciam sua capacidade antioxidante. Assim, delfinidina contendo três
hidroxilações no anel B apresenta maior capacidade antioxidante entre as seis
antocianidinas mais comuns. Dependendo da antocianidina, diferentes padrões de
glicosilação também podem aumentar ou reduzir a capacidade antioxidante
(KÄHKÖNEN; HEINONEN, 2003).
2.2.2. Outros compostos fenólicos em uva
Entre os compostos fenólicos não antociânicos presentes nas uvas estão a
catequina e epicatequina (flavan-3-ois), quercetina, seu glicosídeo rutina, kaempferol,
31
miricetina (flavonois), os estilbenos e os ácidos fenólicos (IACOPINI et al., 2008;
LORRAIN et al., 2013).
Entre os estilbenos, o resveratrol (3,5,4´-triidroxiestilbeno) tem despertado
atenção devido aos benefícios à saúde. Estudo desenvolvido na década de 70 relata a
presença de resveratrol em uma espécie de Eucalyptus (HILLIS; HART; YAZAKI, 1974).
Nos anos 90, estudos sobre a relação entre esse composto e a saúde tornaram-se mais
freqüentes devido a evidências epidemiológicas do denominado “paradoxo francês”, que
revelaram correlação inversa entre o consumo de vinho tinto e a incidência de doenças
cardiovasculares entre os franceses, mesmo com a ingestão de dieta rica em gorduras
saturadas. Foi, então, sugerido que o resveratrol seria a substância do vinho responsável
pelos benéfícios à saúde (RENAUD; DE LORGERIL, 1992). Jang et al. (1997)
demonstraram a atividade quimiopreventiva do resveratrol e, a partir de então, estudos
sobre uvas, vinhos e resveratrol cresceram exponencialmente.
O resveratrol é produzido por mais de 70 plantas e encontrado em cascas e
sementes de uva madura e no vinho tinto (JANG et al., 1997). A glicosilação deste dá
origem aos piceids (resveratrol-3-O-β-d-glicopiranosídeo), a forma mais abundante na
natureza (TEIXEIRA et al., 2013). Duas formas isômeras do resveratrol são encontradas
nas plantas: trans-resveratrol e cis-resveratrol, sendo o isômero trans mais comumente
encontrado. Vian et al. (2005) demonstraram que 89 a 90% deste isômero, em solução,
são convertidos a cis-resveratrol se expostos à luz ultravioleta por 1 h.
Na uva, o resveratrol é sintetizado como resposta ao estresse causado por ataque
fúngico, sendo considerado uma fitoalexina, ou a estresse abiótico como dano mecânico
ou irradiação ultravioleta (DIXON, 2001). Desta forma, o teor de resveratrol em uvas é
influenciado por fatores como a intensidade de infecção por fungos, a exposição ao sol e
a composição do solo (SOLEAS; DIAMANDIS; GOLDBERG, 1997). Maiores concentrações
de resveratrol no vinho estão associadas à infecção moderada da uva por fungos,
enquanto o desenvolvimento muito intenso destes pode destruir a fitoalexina produzida
(JEANDET et al., 1995). Yang, Martinson e Liu (2009) avaliaram 14 variedades de uvas
cultivadas em Nova Iorque e encontraram variação no teor de resveratrol entre 0,038 e
0,571 mg/100g. Entre sete cultivares de uvas brasileiras avaliadas por Abe et al. (2007),
o resveratrol foi encontrado em três, variando entre 0,02 e 0,60 mg/100g. Em uvas
tintas cultivadas na Espanha, o maior conteúdo de trans e cis-resveratrol foi encontrado
nas cascas. Nenhum dos dois isômeros foi detectado na polpa das três Vitis viniferas
32
analisadas e cis-resveratrol não foi detectado nas sementes. González-Barrio et al.
(2009) descrevem que o reduzido conteúdo de resveratrol em sucos de uva pode ser
devido à ausência do composto nas bagas e à falta de tecnologia apropriada para
obtenção dos sucos. Entretanto, entre 11 marcas comerciais de diferentes tipos de sucos
de uvas tintas (integral, reprocessado, reconstituído e adoçado, bem como néctar de
uva) produzidos no Brasil, o teor de trans-resveratrol variou entre 0,19 e 0,90 mg/L,
enquanto que o de cis-resveratrol variou de 0,07 a 1,59 mg/L (SAUTTER et al., 2005).
Os ácidos hidroxicinâmicos são os ácidos fenólicos mais comumente encontrados
em uvas. São comumente acumulados nas cascas e polpa de uvas brancas e tintas, de
variedades viníferas e não viníferas. Quando ácidos p-coumárico, cafeico e ferúlico são
esterificados com ácido tartárico, são denominados ácido coutárico (ácido trans-p-
coumaroil-tartárico), ácido caftárico (ácido trans-cafeoil-tartárico) e ácido fertárico
(ácido trans-feruloil-tartárico) (DI LECCE et al., 2014; LAGO-VANZELA et al., 2011;
TEIXEIRA et al., 2013). Em menor teor, ácidos hidroxibenzóicos, como gálico, vanílico,
siríngico e protocatecuico, também são encontrados em uvas (LIANG et al., 2011b;
TEIXEIRA et al., 2013). Os ácidos fenólicos representam um dos principais compostos
em uvas brancas, influenciando o aroma e o sabor dos vinhos (ABE et al., 2007).
Entre os flavonois, glicosídeos de quercetina, kaempferol e miricetina são os mais
frequentemente encontrados em uvas (CANTOS; ESPÍN; TOMÁS-BARBERÁN, 2002;
LEDDA et al., 2010; SANDHU; GU, 2010). Isorhamnetina, laricitrina e siringetina também
foram identificados (LORRAIN et al., 2013). Os flavonois são sintetizados,
predominantemente, nas cascas das uvas e são importantes para a coloração do vinho,
atuando como co-pigmentos junto às antocianinas (MATTIVI et al., 2006). Catequina e
epicatequina são os principais fenólicos presentes em sementes de uvas (ROCKENBACH
et al., 2011a) e são responsáveis pelo sabor e adstringência de vinhos e sucos de uva. Na
Figura 2.7. são apresentados os principais flavan-3-ois e flavonois encontrados em uvas.
33
(+)-Catequina R1=H; R2=OH
(-)-Epicatequina R1=OH; R2=H
R=glicose, ácido glicurônico
Kaempferol R1=H; R2=H
Quercetina R1=OH; R2=H
Miricetina R1=OH; R2=OH
Isoharmnetina R1=H; R2=OCH3
Laricitrina R1=OH; R2=OCH3
Siringetina R1= OCH3; R2= OCH3
Figura 2.7. Principais flavan-3-ois e flavonois encontrados em uvas (LORRAIN et
al., 2013).
2.3. Compostos fenólicos, suco de uva e saúde
A presença de alimentos ricos em polifenois na dieta é de grande importância
devido às diversas atividades biológicas benéficas destes compostos no organismo. Há
evidências de que fitoquímicos em alimentos desempenham importante papel na
redução do risco de ocorrência de DCNTs (VAUZOUR et al., 2010; WAHLE et al., 2010;
ZHANG et al., 2010). Eles atuam na alteração da microbiota intestinal (CARDONA et al.,
2013), modulam vias de sinalização celular, tanto em condições fisiológicas como em
condições patológicas (PANG et al., 2012), têm ação antiaterogênica (KALIORA;
DEDOUSSIS; SCHMIDT, 2006), anticarcinogênica (WAHLE et al., 2010), anti-inflamatória
(XIA et al., 2010), além de alta capacidade antioxidante (TSAO, 2010). A capacidade
antioxidante de uma substância é definida pela sua habilidade em seqüestrar espécies
reativas. Essas espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (ex. ânion superóxido,
peróxido de hidrogênio, radical hidroxila, peroxinitrito) são constantemente produzidas
no organismo durante o metabolismo celular. Fontes externas ao organismo humano,
como os constituintes dietéticos, o tabaco, a radiação ultravioleta e poluentes
ambientais, também, contribuem para o aumento de espécies reativas. O organismo
humano possui mecanismos de defesa enzimáticos e não enzimáticos para manter em
equilíbrio a presença destas substâncias. No entanto, a produção exacerbada de espécies
34
reativas e/ou a deficiência de antioxidantes enzimáticos ou não enzimáticos, necessários
para neutralizar essas substâncias, podem causar seu acúmulo (ALVES et al., 2010).
Substâncias antioxidantes inibem a geração e reduzem a quantidade de radicais
livres, ajudando a prevenir ou adiar as reações de oxidação, como a auto-oxidação
lipídica, oxidação de ácidos nucleicos e proteínas (XU, 2012). Em alimentos, a oxidação
lipídica compromete a qualidade sensorial e nutricional daqueles que contêm esse
nutriente. Em células de mamíferos, danos oxidativos podem resultar em inflamação e
modificação permanente do material genético, que representa o primeiro passo
envolvido na mutagênese, carcinogênese e processos de envelhecimento, entre outros
danos (VALKO et al., 2007; XU, 2012).
Os compostos fenólicos presentes em uvas são considerados os principais
responsáveis pela atividade antioxidante destas (ZHOU; RAFFOUL, 2012). A atividade
antioxidante desses compostos depende da sua estrutura, como número e posição das
hidroxilas e dos padrões de glicosilação (TSAO, 2010). Eles agem por meio da captura
de radicais livres, atividade quelante de metais, doação de átomos de hidrogênio ou
elétrons, ou pela interação com biomembranas, o que pode resultar na modificação do
potencial de oxirredução das células (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006; DAI; MUMPER,
2010).
Tem sido demonstrada, por outro lado, atividade pró-oxidante de alguns
compostos fenólicos como resveratrol e flavonois que, em certas condições e em certos
tecidos, podem oferecer mais riscos oxidativos do que benefícios antioxidantes. Tem
sido proposto que os mecanismos anticarcinogênicos dos compostos fenólicos de
plantas estão, principalmente, relacionados ao seu comportamento pró-oxidante na
presença de metais de transição, como cobre e ferro. Desta forma, o uso terapêutico de
compostos com atividade pró-oxidante tem sido considerado como estratégia
promissora no tratamento de diversos tipos de câncer (AZMI; SARKAR; HADI, 2013;
MARTIN-CORDERO et al., 2012; PROCHÁZKOVÁ; BOUŠOVÁ; WILHELMOVÁ, 2011).
O intenso interesse pelas antocianinas deve-se tanto aos seus atributos de cor,
como aos potenciais efeitos benefícios à saúde. Esses efeitos incluem atividade anti-
inflamatória e anticarcinogênica e redução do risco de ocorrência de doenças
cardiovasculares, obesidade e diabetes. Todos esses efeitos estão, em maior ou menor
grau, associados à capacidade antioxidante (HE; GIUSTI, 2010). Um exemplo é o estudo
desenvolvido por Yang et al. (2012), que demonstra que delfinidina-3-O-glicosídeo inibe
35
a ativação plaquetária e atenua o crescimento do trombo em modelos in vitro e in vivo,
sugerindo que o consumo diário de antocianinas pode ter importante efeito protetor
contra trombose e doenças cardiovasculares.
As antocianinas são absorvidas no estômago e intestino delgado (PRIOR, 2012). A
quantificação das antocianinas e de seus metabólitos conjugados, glicurônicos e
sulfatados no plasma e na urina têm demonstrado baixa biodisponibilidade destas
(MANACH et al., 2005). Tem sido demonstrado que a microbiota do sistema digestório
desempenha papel primordial no metabolismo das antocianinas. Incubação, ex vivo, de
extratos de antocianinas obtidos de frutas, como morangos e uvas tintas, com saliva
coletada de 14 voluntários mostrou que as antocianinas foram parcialmente degradadas,
sendo a degradação, provavelmente, mediada pela microbiota da cavidade oral
(KAMONPATANA et al., 2012). No intestino, podem ser produzidas agliconas,
resultantes da hidrólise por glicosidases, que podem ser metabolizadas no intestino
grosso, produzindo compostos como ácido gálico, protocatecuico, siríngico e vanílico
(FORESTER; WATERHOUSE, 2008). Tanto as antocianinas como seus metabólitos
exercem modulação positiva da população bacteriana intestinal, contribuindo para a
manutenção da saúde do intestino (HIDALGO et al., 2012).
Diversas pesquisas evidenciam a importância do resveratrol na promoção da
saúde. Há evidências de que o mesmo seja um potente antioxidante, tenha efeitos
quimiopreventivos e quimioterapêuticos, previna a ocorrência de doenças cardíacas,
isquemia, diabetes, doenças neurodegenerativas, inflamação e infecções virais, além de
atuar na redução de peso corporal (MARQUES; MARKUS; MORRIS, 2009; PANG et al.,
2012; SZKUDELSKA; SZKUDELSKI, 2010; ZHOU; RAFFOUL, 2012). Mais recentemente,
foi demonstrado que a suplementação dietética com resveratrol previne a atrofia de
células musculares, frequente em pacientes com diabetes e câncer e em idosos, e poderia
ser usada como estratégia para manutenção ou melhoria da massa muscular (WANG et
al., 2014). Outro grupo demonstrou que o resveratrol reverte a resistência a drogas
usadas no tratamento de câncer de mama, melhorando a eficácia dos quimioterápicos
(HUANG et al., 2014).
Não há consenso em relação à dose de resveratrol recomendada para que sejam
alcançados os diversos efeitos benéficos à saúde (DUDLEY et al, 2009). Em um estudo
com animais, doses de 2,5 ou 5,0 mg/kg de resveratrol aumentaram a expressão de
enzimas envolvidas em vias de sinalização de sobrevivência celular, enquanto doses
36
maiores, de 25 e 50 mg/kg, potencializaram sinais de morte celular. Estudos clínicos
para avaliação da relação entre resveratrol e doenças como câncer, síndrome
metabólica, doença de Alzheimer, entre outras, utilizam doses de 5g/dia (USNIH, 2010).
Embora os efeitos benéficos da uva sejam relacionados, em maior parte, aos
compostos fenólicos que fazem parte de sua composição (KHADEM-ANSARI; RASMI;
RAMEZANI, 2010; ZHOU; RAFFOUL, 2012), a ocorrência desses compostos em
concentração relevante na uva e nos seus derivados não garante a ação efetiva no
organismo. Outros aspectos como isomeria, conjugação com outras moléculas no
produto ou no organismo, além da transformação durante o processamento, entre
outros, podem influenciar na bioacessibilidade, biodisponibilidade e bioatividade dos
compostos fenólicos (PINTO et al., 2011).
A uva, o suco de uva e o vinho estão entre os 10 alimentos com maior atividade
antioxidante e mais comumente consumidos nos Estados Unidos (FLOEGEL et al., 2010).
O consumo do suco apresenta vantagens em relação ao vinho, uma vez que a ausência de
álcool permite que seja ingerido pela maioria das pessoas, incluindo crianças e pessoas
portadoras de enfermidades ou que apresentem restrições de ordem religiosa, por
exemplo.
Diversos estudos in vitro e in vivo avaliam os efeitos do suco de uva para a saúde.
O consumo de suco de uvas tintas exerceu efeito hepatoprotetor em ratos expostos a
raios-X, promovendo a manutenção do peso do fígado, ao contrário do grupo placebo
que perdeu 25% do peso do órgão (RAMOS DE ANDRADE et al., 2009). Foi observado,
também, efeito protetor do consumo de suco de uva contra danos cerebrais em ratos,
causados por estresse oxidativo induzido (DANI et al., 2008). Em coelhos
hipercolesterolêmicos, o consumo de suco de uva atenuou agregação plaquetária e
reduziu a concentração de colesterol sérico e o desenvolvimento de placa de ateroma.
Esse efeito foi maior, quando comparado àquele exercido por extratos de polifenois de
uva, sugerindo que o consumo de suco de uva, e não a suplementação dietética com
compostos bioativos isolados, seja mais eficiente na veiculação dos efeitos benéficos à
saúde (SHANMUGANAYAGAM et al., 2007).
Ensaios clínicos têm demonstrado que o consumo regular de suco de uva pode
estar associado à melhora do sistema imunológico devido, principalmente, aos
compostos fenólicos (ROWE et al., 2011). Antocianinas de suco de uva são mais bem
absorvidas do que as antocianinas do vinho, o que poderia ser devido a um efeito
37
sinergístico da glicose, que encontra-se em maior teor no suco (BITSCH et al., 2004). O
consumo do suco de uva promove melhora da memória em idosos (KRIKORIAN et al.,
2010) e redução da pressão arterial em hipertensos (PARK; KIM; KANG, 2004), além de
exercer efeitos antioxidante (CASTILLA et al., 2006; PRIOR et al., 2007), hipolipidêmico e
anti-inflamatório (CASTILLA et al., 2006).
A biodisponibilidade do resveratrol também demonstrou ser influenciada pela
matriz alimentar. O consumo de doses semelhantes indicou que a biodisponibilidade do
resveratrol do vinho e do suco de uva foi seis vezes maior do que de tabletes preparados
com extrato de vinho e enriquecidas com resveratrol (ORTUÑO et al., 2010).
Ko et al. (2005) observaram que, entre sucos de nove frutas testadas (pera, maçã,
laranja, uva, pêssego, ameixa, kiwi, melão e melancia), oito apresentaram potente efeito
antioxidante no plasma humano (o suco de pera foi a exceção). O suco de uva destacou-
se, pois após seu consumo, a atividade antioxidante persistiu por até 120 min, enquanto,
para os demais sucos o efeito persistiu por 90 min.
Estudo realizado com base nos dados do Health and Nutrition Examination Survey
(NHANES), de 2003 a 2008 analisou a relação entre o consumo de uvas e produtos de
uva não alcoólicos (passas e suco integral) com a qualidade da dieta entre crianças de 2
a 19 anos (n = 9622) e adultos de 20 ou mais anos (n = 12251). Os resultados mostraram
que o consumo de produtos de uva está associado com padrão dietético mais saudável
(Healthy Eating Index), além de maior ingestão de frutas e menor ingestão de gorduras
sólidas e açúcar de adição, nos dois grupos etários (McGILL et al., 2013). Os autores
concluem que a inclusão de uvas e seus produtos na dieta pode contribuir, de forma
significativa, para uma dieta saudável.
2.4. Influência do processamento sobre compostos bioativos de uvas e seus
produtos
Fatores como pH, estrutura química, matriz alimentar, concentração,
temperatura de estocagem, incidência de luz, oxigênio e presença de enzimas alteram a
estabilidade dos compostos bioativos de uvas (HELLSTRÖM; MATTILA; KARJALAINEN,
2013; MOLDOVAN et al., 2012; PATRAS et al., 2010; REIN; HEINONEN, 2004). No
processamento do suco de uva, fatores como método de elaboração, prensagem, tempo e
temperatura de maceração, estabilização e filtração, entre outros, também, influenciam
o teor de compostos fenólicos do produto (FULEKI; RICARDO-DA-SILVA, 2003;
38
THRELFALL et al., 2005). Estudos demonstram a sensibilidade térmica das antocianinas.
Em um primeiro momento, há hidrólise com liberação do grupamento glicosídico e
formação de aglicona e, dependendo da severidade e natureza do tratamento térmico, a
formação de diversos outros compostos (PATRAS et al., 2010). Wang e Xu (2007)
demonstraram que a taxa de degradação de antocianinas durante tratamento térmico de
amoras silvestres aumenta com a elevação da temperatura de processamento. O
processamento a quente, para obtenção de suco e geléia de uva, causou redução no teor
antocianinas totais de 71% e 92%, respectivamente (VEDANA, 2008).
A temperatura de estocagem também pode causar degradação das antocianinas.
A estocagem de diversas frutas em diferentes temperaturas demonstrou que a
estabilidade de antocianinas foi significativamente menor em temperatura ambiente,
quando comparada à estocagem sob refrigeração (HELLSTRÖM; MATTILA;
KARJALAINEN, 2013). Há, também, estudos que demonstram perda de antocianinas,
mesmo em temperatura de refrigeração, como em suco de mirtilo, que apresentou
redução de 83% no teor de antocianinas quando mantido por 10 dias a 4°C (REQUE et
al., 2014). Por outro lado, foi demonstrado que a extração do suco de uva a quente
permite obtenção de um produto com maior teor de compostos fenólicos e antocianinas
e cor vermelha mais intensa, quando comparado ao produto obtido por extração a frio
(THRELFALL et al., 2005).
O vinho tinto e o suco de uva são, também, utilizados em preparações culinárias
submetidas a tratamentos térmicos. Teófilo et al. (2011) observaram que a fervura por
até 60 minutos não provocou variações importantes na capacidade antioxidante total e
no teor de fenólicos totais destas bebidas. Por outro lado, Vedana (2008) observou
redução na quantidade de fenólicos totais de 66% e 68% no processamento de suco e de
geléia de uva, respectivamente.
Foi demonstrado que o método de extração do suco de uva influencia o teor de
resveratrol no produto. A prensagem a quente resulta em sucos com maior teor de
resveratrol comparada com a extração a frio, com ou sem tratamento enzimático
(LEBLANC; JOHNSON; WILSON, 2008).
Portanto, a investigação sobre o teor e a estabilidade de compostos bioativos em
alimentos fonte desses compostos é de fundamental importância para se conhecer as
propriedades funcionais dos alimentos.
39
2.5. Métodos Analíticos
Os métodos analíticos aplicados para extração e análise geram diferentes
resultados quanto ao teor dos compostos fenólicos das amostras (LORRAIN et al., 2013).
Considerando-se a complexidade química e a frequência de ocorrência dos polifenois em
plantas, mesmo com o avanço das técnicas de análise, a determinação desses é um
desafio. Diversos cuidados devem ser tomados durante a obtenção, transporte e análise,
a fim de minimizar a degradação dos compostos. A exposição a altas temperaturas, luz e
oxigênio, por exemplo, podem afetar a composição fenólica dos produtos (TSAO, 2010).
Extratos ricos em compostos fenólicos são comumente obtidos de plantas por
meio de extração com solventes. O rendimento da extração depende da polaridade do
solvente, tempo e temperatura de extração, proporção entre volume de solvente e
amostra, assim como da composição química e características físicas da amostra. Não há,
portanto, um único método adequado para a extração de todos os compostos fenólicos
presentes em alimentos de origem vegetal (DAI; MUMPER, 2010).
Algumas características das antocianinas auxiliam na seleção do método de
extração. Uma delas é a característica polar da molécula, conferida pela presença de
múltiplos grupamentos hidroxila. O pH ácido confere estabilidade ao cátion flavilium das
antocianinas e intensifica sua cor. Soluções de antocianinas apresentam coloração
vermelha mais intensa em pH abaixo de 2,0 e são incolores em pH 4,5 (WROLSTAD;
DURST; LEE, 2005b). Essas características têm feito com que os métodos mais
comumente utilizados para extração de antocianinas envolvam o emprego de solventes
orgânicos acidificados, especialmente etanol e metanol (MOLDOVAN et al., 2012;
REVILLA; RYAN; MARTÍN-ORTEGA, 1998).
Considerando a diversidade de tipos de antocianinas na natureza, o emprego de
diferentes métodos de análise pode ser necessário para discriminar entre compostos
que possuem características espectrais muito semelhantes (GIUSTI et al., 1999). O
método de pH diferencial pode ser usado para determinação da quantidade total de
antocianinas monoméricas. Este se baseia na mudança estrutural reversível das
antocianinas monoméricas, com a mudança de pH. A quantificação é feita com base na
diferença entre as absorbâncias de soluções contendo as antocianinas em pH 1,0 e pH
4,5, medidas no comprimento de onda de máxima absorbância (λmáx) (Figura 2.8.). Esse
método demonstrou ser confiável, mesmo na presença de compostos potencialmente
40
interferentes, além de apresentar concordância com dados obtidos por cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE) para determinação de antocianinas em bagas (LEE et al.,
2012).
Figura 2.8. Variação das estruturas químicas das antocianinas em diferentes
valores de pH (WATERHOUSE, 2005).
Diversos métodos de análise por CLAE em fase reversa foram desenvolvidos para
detecção de antocianinas em amostras de uvas e seus produtos (HEBRERO et al., 1989;
MCCALLUM et al., 2007; WANG; RACE; SHRIKHANDE, 2003). O padrão de eluição das
antocianinas é dependente da fase estacionária, da fase móvel e da polaridade dos
analitos. A ordem de eluição se dá em função do número de grupamentos hidroxila e
grau de metoxilação. Assim, pela ordem, eluem delfinidina, cianidina, petunidina,
peonidina e malvidina. Também influenciam, o número de substituintes glicídicos e o
padrão de acilação dos resíduos de açúcares com ésteres de ácido acético, p-coumárico
ou cafeico. Os diglicosídeos são mais polares que os monoglicosídeos, apresentando
menor tempo de retenção, e a acilação das antocianinas envolve perda de sua polaridade
em relação aos compostos não acilados correspondentes, refletindo em aumento no
41
tempo de retenção. Devido à complexidade do perfil de antocianinas em uvas, a
separação cromatográfica incompleta é comum, com sobreposição dos picos (HEBRERO
et al., 1989; MCCALLUM et al., 2007).
A análise de alimentos por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à
espectrometria de massas em série com ionização por electrospray (CLAE-IE-EM/EM)
permite a identificação e quantificação de compostos específicos em alimentos. A
espectrometria de massas é uma técnica que envolve a ionização e/ou fragmentação de
moléculas, seguida por separação e quantificação de um fragmento caracterizado por
sua relação massa/carga (m/z) (DASS, 2007). O acoplamento do detector de
espectrometria de massas à técnica de cromatografia líquida permite que os compostos
pré-separados pela cromatografia sejam identificados e quantificados com alto grau de
sensibilidade, seletividade e confiabilidade. Substâncias presentes em amostras
complexas podem ser analisadas livres de interferentes, mesmo quando presentes
apenas em quantidades traço (CHIARADIA et al., 2008).
As características fundamentais de um espectrômetro de massas são: produção
de íons em fase gasosa; aceleração dos íons a velocidades específicas em um campo
elétrico; separação dos íons por um analisador de massas; detecção de cada íon com
relação m/z específica. A partir de uma molécula neutra, íons podem ser produzidos
pela remoção ou adição de um elétron ou próton. Os íons podem ser separados no
analisador de massas pelo uso de campos magnéticos ou elétricos ou, ainda, de acordo
com o tempo que os íons de diferentes massas levam para percorrer distâncias definidas
em um analisador de massas por tempo de vôo (time-of-flight - TOF). Informações
estruturais mais específicas para a identificação dos compostos podem ser obtidas
utilizando espectrometria de massas em sequência (EM/EM e EMn). Nesses
equipamentos, dois ou mais analisadores, não necessariamente do mesmo tipo, são
acoplados. Em um primeiro analisador, a molécula é fragmentada pela colisão de um gás
neutro (ex. argônio) e os fragmentos gerados são analisados em um segundo analisador
(AITKEN, 2010).
O acoplamento CLAE-EM correspondeu a um desenvolvimento chave para
obtenção de informações na elucidação estrutural de antocianidinas, antocianinas e
compostos derivados. As antocianinas são, geralmente, detectadas como cátion flavilium
na medição em modo íon-positivo e em meio ácido. No entanto, o espectro de massas
obtido no modo negativo pode ser útil para diferenciar compostos com mesmos íons
42
moleculares e padrões de fragmentação, como glicosídeos de quercetina e de delfinidina
(LORRAIN et al., 2013).
Diversos métodos têm sido usados para a determinação da capacidade
antioxidante em alimentos e podem produzir resultados diferentes para uma mesma
amostra. Os ensaios espectrofotométricos detectam grupos específicos de compostos
reativos quimicamente similares. A comparação da capacidade antioxidante entre os
diferentes métodos não é feita em valores absolutos, pois cada método tem sua própria
escala de valores (HUANG; OU; PRIOR, 2005). Não há um procedimento padrão para
determinação da capacidade antioxidante. Recomenda-se, entre outros, que o método
adotado seja tecnicamente simples; com instrumentação disponível e tenha boa
repetibilidade e reprodutibilidade. Dentre os métodos, ABTS (2,2'-azino-bis-(3-etil-
benzotiazolina)-6-sulfônico), DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazil), FRAP (ferric reducing
ability of plasma) e ORAC (oxygen radical absorbance capacity) são os mais usuais
(PÉREZ-JIMÉNEZ; SAURA-CALIXTO, 2006).
O método de captura do radical DPPH se baseia na avaliação da capacidade de
uma determinada substância em sequestrar esse radical, reduzindo-o a 2,2-difenilpicril-
hidrazina (DPPH-H), com mudança na coloração de violeta a amarelo pálido. O
decréscimo da absorbância da solução a 515 nm é avaliado. O DPPH é um radical livre
que pode ser obtido diretamente por dissolução do reagente em meio orgânico. O
método é rápido, sensível e econômico sendo, resultados reprodutíves e comparáveis a
outros métodos de captura de radicais livres como o ABTS. Por isso, é um dos mais
utilizados para avaliar a capacidade antioxidante de sucos e extratos de frutas e
hortaliças (SINGH; SINGH, 2008).
O método ABTS se baseia na habilidade de redução do radical catiônico ABTS·+
por antioxidantes, com redução da absorbância, que é monitorada em comprimento de
onda entre 400 e 750 nm. Quando Trolox (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-ácido
carboxílico), análogo hidrossolúvel da vitamin E, é usado como padrão, o método é
denominado TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity). O radical ABTS·+ pode ser
usado para a determinação da capacidade antioxidante de compostos hidrofílicos e
lipofílicos (SINGH; SINGH, 2008).
A habilidade de um composto antioxidante de reduzir o complexo
tripiridiltriazina férrica (Fe+3- TPTZ) ao complexo ferroso (Fe+2-TPTZ) em baixo pH é
43
avaliada pelo método FRAP, por meio da medição da cor azul, resultante da reação, a
593 nm. O método pode ser aplicado para estudos da atividade antioxidante em extratos
de alimentos e bebidas e para o estudo da eficiência antioxidante de substâncias puras,
com resultados comparáveis àqueles obtidos com metodologias mais complexas
(HUANG; OU; PRIOR, 2005; SINGH; SINGH, 2008).
O método ORAC utiliza um indicador fluorescente, que tem sua fluorescência
reduzida como consequência da oxidação promovida por radicais livres gerados por
AAPH [dicloreto de 2,2’-azobis(2-amidinopropano)]. O método monitora a fluorescência
e avalia a capacidade dos antioxidantes de capturarem radicais livres, retardando a
redução da fluorescência (DUDONNÉ et al., 2009).
Foi demonstrado que alguns compostos não antioxidantes presentes em
alimentos, como aminoácidos, e solventes usados no processo de extração, podem
interferir nos resuldados obtidos por ABTS, FRAP, DPPH e ORAC, sendo este último, o
método que sofreu maior interferência e FRAP, o que sofreu menor interferência desses
fatores. Dudonné et al. (2009) obtiveram resultados comparáveis, na avaliação da
capacidade antioxidante, obtidos pelos métodos DPPH, ABTS, FRAP e ORAC, de extratos
aquosos de 30 vegetais, incluindo café, erva mate, groselha, entre outros. Os autores
encontraram correlação significativa positiva entre a capacidade antioxidante e o teor
de compostos fenólicos, indicando que esses compostos são os que mais contribuem
para as propriedades antioxidantes desses vegetais. Devido aos diferentes mecanismos
de ação dos antioxidantes, recomenda-se que mais de um tipo de avaliação da
capacidade antioxidante seja realizada (PÉREZ-JIMÉNEZ; SAURA-CALIXTO, 2006). A
International Organisation of Vine and Wine recomenda o método DPPH para produtos
de uva (OIV apud GOLLÜCKE et al., 2009).
A análise sensorial de alimentos é um instrumento que permite investigar se o
consumidor gosta de um produto, prefere um produto em relação a outro ou acha o
produto aceitável, com base em suas características sensoriais. Testes sensoriais
envolvem seres humanos, que são os responsáveis pela medição. Os erros associados a
diferenças pessoais em relação a grau de perspicácia, experiências, genética e
preferências sensoriais são uma limitação em testes sensoriais. Desta forma, é
fundamental que os ensaios sejam conduzidos de forma a minimizar os fatores que
possam interferir nos resultados (LAWLESS; HEYMANN, 1999). O teste de aceitação
com escala hedônica estruturada de nove pontos, incluindo ou não questões sobre
44
consumo e intenção de compra, tem sido amplamente utilizado para avaliação de sucos
de frutas (BORGES et al., 2011; PONTES et al., 2010; VIDIGAL et al., 2011).
A cor é um dos mais importantes atributos sensoriais do suco de uva e é usado
como critério de aceitação dos produtos pelo consumidor. A cor pode ser definida como
a percepção da distribuição espectral da luz visível incidente na retina e processada no
cérebro humano (MYSHKIN et al., 2001). A mensuração direta da cor, por meio do
colorímetro, é mais simples e rápida do que as análises químicas. Essa determinação
pode ser feita com base no sistema colorimétrico CIE (Commission International
d’Eclairage), também denominado CIELAB, internacionalmente aceito e largamente
utilizado na avaliação da coloração em alimentos que são submetidos a diferentes tipos
de processamento (GONÇALVES et al., 2007; JO et al., 2014). Esse sistema é tido como o
mais completo espaço de cor especificado pela CIE. Ele descreve todas as cores visíveis
ao olho humano e foi criado como modelo independente para ser usado como referência.
Nesse sistema, três parâmetros são utilizados para descrever um espaço tridimensional
de cores que permite a expressão numérica da luminosidade, tonalidade e saturação: L*,
que representa a luminosidade refletida pela amostra e pode variar entre zero
(completamente opaco ou “preto”) e 100 (completamente transparente ou “branco”); o
parâmetro a*, que representa o espectro vermelho (valores positivos) – verde (valores
negativos); e o parâmetro b*, que representa o espectro amarelo (valores positivos) –
azul (valores negativos). O centro é acromático e valores crescentes de a* e b*, a partir
do centro, refletem aumento da saturação da cor. A partir desses valores, podem ser
calculados o croma: C* = (a*2+ b*2)1/2, que representa a pureza da cor, e a medida do
ângulo h° = tg-1 (b*/a*), cujos valores podem variar entre 0° e 360°, dependendo da
tonalidade da cor: 0/360° para magenta, 90° para amarelo, 180° para verde e 270° para
azul. A diferença de cor entre duas amostras é, frequentemente, expressa como ΔE∗ =
(Δa*2+Δb*2+ΔL*2)1/2. Onde Δa* = a*-a*0, Δb*= b*-b*0 e 0 subscrito indica a cor na amostra
com a qual se está comparando. Valores de ΔE* < 1 indicam que as diferenças de cores
entre amostras que não estejam em posições adjacentes, são praticamente
imperceptíveis (BALDEVBHAI; ANAND, 2012).
Os parâmetros colorimétricos baseados no sistema CIELAB são utilizados para
avaliação comparativa da cor de vinhos, de acordo com os procedimentos
recomendados pelo Compendium of International Methods of Wine and Musts Analysis
(OIV, 2014). A intensidade e a tonalidade de cor podem variar de acordo com a região
45
onde as uvas são cultivadas e com a tecnologia de fabricação dos produtos (DOWNEY;
DOKOOZLIAN; KRSTIC, 2006). A cor está relacionada, também, à composição química,
como o teor de antocianinas na amostra (ABE et al., 2007; MUÑOZ-ESPADA et al., 2004).
A correlação entre os parâmetros colorimétricos do sistema CIELAB com a cor das
cascas e o perfil de antocianinas de 78 variedades de uvas foi avaliada (LIANG et al.,
2011a). Todos os parâmetros do sistema CIELAB apresentaram correlação com o teor de
antocianinas totais nas uvas. L*, a*, b*, e C* apresentaram correlação negativa, enquanto
h° apresentou correlação positiva. Foi avaliada correlação entre esses parâmetros e o
conteúdo de cada grupo de antocianina. Derivados de cianidina foram positivamente
correlacionados e derivados de malvidina negativamente correlacionadas com os
parâmetros de cor, exceto para h°, que foi negativamente correlacionado com derivados
cianidina e peonidina e positivamente correlacionado com derivados de malvidina e
petunidina. Derivados de peonidina apresentaram apenas correlação significativa
positiva com a* e não houve correlação significativa entre derivados de delfinidina e os
parâmetros colorimétricos CIELAB.
Análises microbiológicas de suco de uva podem indicar a presença de micro-
organismos patogênicos e deterioradores. A composição nutricional do suco de uva, com
elevada atividade de água e presença de glicose e frutose, oferece condições para a
fermentação alcoólica por leveduras, cujo desenvolvimento é favorecido pelo meio
ácido. O álcool produzido pode ser oxidado a ácido acético por ação de bactérias. Podem,
também, atuar leveduras e fungos filamentosos, que crescem na superfície, quando o
suco está exposto ao ar. Bactérias láticas, como espécies dos gêneros Leuconostoc e
Lactobacillus podem degradar os glicídeos simples com produção de ácido lático e
acético, dióxido de carbono, etanol e outras substâncias (MARZAROTTO, 2005).
Portanto, a deterioração microbiana do suco é causada por micro-organismos tolerantes
à acidez característica deste, com predomínio de bactérias láticas, leveduras e fungos
filamentosos. Os padrões microbiológicos estabelecidos pela legislação brasileira para
sucos de frutas estabelecem ausência de coliformes a 35 °C (cuja denominação clássica
de coliformes totais foi alterada pela resolução da Diretoria Colegiada da Agência
Nacional de Vigilância Sanitária n° 12 de 2001) em 50mL e ausência de Salmonella sp.
em 25 mL do produto (BRASIL, 2001). A presença de micro-organismos em sucos
processados termicamente pode estar relacionada a fatores como tratamento térmico
46
ineficiente, termorresistência dos micro-organismos ou contaminação pós-
processamento (MARCOLINO, 2003).
47
3. JUSTIFICATIVA
Os benefícios de uma dieta rica em frutas, fontes de compostos bioativos que
agem na promoção da saúde, são evidenciados em inúmeros estudos. As uvas estão
entre as frutas com maior teor de compostos fenólicos com propriedades antioxidantes,
apresentam grande aceitação para consumo in natura ou na forma de produtos
derivados, e são produzidas e comercializadas em grande escala no Brasil. No entanto,
seu curto período de safra e a elevada perecibilidade limitam seu consumo. Nesse
sentido, a extração a vapor para produção de suco da uva representa importante papel
econômico e social, especialmente para os produtores e suas famílias, disponibilizando o
produto para consumo durante todo o ano. Entretanto, os resíduos gerados com a
produção do suco, mesmo apresentando potencial bioativo, são, geralmente,
descartados, representando desperdício e causando danos ambientais. Diante do
exposto, a avaliação do efeito do processamento da uva sobre características que
influenciam a qualidade de produtos elaborados com a variedade Isabel pode contribuir
para melhor utilização e aproveitamento da fruta.
48
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo Geral
Avaliar o teor de compostos fenólicos totais, teor e perfil de antocianinas,
capacidade antioxidante, características físico-químicas e parâmetros colorimétricos dos
produtos de uvas de diferentes variedades e o efeito da extração de suco de uva sobre
esses parâmetros.
4.2. Objetivos Específicos
Em uvas da variedade Isabel:
- Investigar o efeito de quatro métodos de extração de suco de uva em pequena
escala sobre o teor de compostos fenólicos totais e antocianinas totais, capacidade
antioxidante, características físico-químicas e parâmetros colorimétricos dos sucos;
- Avaliar o efeito da duração do processo de extração de suco a vapor sobre o teor
de compostos fenólicos totais, antocianinas totais, acidez total titulável, pH, teor de
sólidos solúveis totais, parâmetros colorimétricos e capacidade antioxidante do suco;
- Avaliar a aceitação sensorial e intenção de compra de suco extraído a vapor;
- Avaliar a estabilidade durante estocagem de sucos extraídos a vapor, sob
aspecto microbiológico e de compostos fenólicos totais, antocianinas totais e capacidade
antioxidante;
- Investigar o efeito da extração de suco a vapor sobre o teor de compostos
fenólicos totais, antocianinas totais e capacidade antioxidante, bem como sobre o perfil
de antocianinas, pela quantificação destes na uva, na sua casca e polpa, no suco e no
resíduo da produção do suco.
- Avaliar o efeito de alta pressão hidrostática em uvas sobre o teor de compostos
fenólicos no suco e no resíduo;
Em uvas da variedade Concord:
- Avaliar, comparativamente, a capacidade antioxidante, o teor de antocianinas e
de compostos fenólicos em sucos comerciais de uvas produzidas pelos sistemas orgânico
e convencional.
49
5. CAPÍTULO 1: Suco de uva obtido por métodos de extração em pequena escala:
teor de compostos fenólicos, capacidade antioxidante e estabilidade durante a
estocagem.
5.1. OBJETIVOS
Em uvas da variedade Isabel:
- Investigar o efeito de quatro métodos de extração de suco de uva em pequena
escala sobre o teor de compostos fenólicos totais e antocianinas totais, capacidade
antioxidante, características físico-químicas e parâmetros colorimétricos dos sucos;
- Avaliar o efeito da duração do processo de extração de suco a vapor sobre o teor
de compostos fenólicos totais, antocianinas totais, acidez total titulável, pH, teor de
sólidos solúveis totais, parâmetros colorimétricos e capacidade antioxidante do suco;
- Avaliar a aceitação sensorial e intenção de compra de suco extraído a vapor;
- Avaliar a estabilidade durante estocagem de sucos extraídos a vapor, sob
aspecto microbiológico e de compostos fenólicos totais, antocianinas totais e capacidade
antioxidante;
5.2. MATERIAL E MÉTODOS
5.2.1. Preparo das amostras
Uvas da cultivar Isabel (Vitis labrusca) foram colhidas no Rio Grande do Sul e
adquiridas em uma central de abastecimeno no Rio de Janeiro. As frutas e engaços, assim
como cascas, polpas e sementes foram manualmente separados e pesados. Foi
determinado o teor de umidade das frutas após secagem das amostras a 105 °C até peso
constante.
Foram preparados sucos, utilizando uvas provenientes de uma mesma safra, em
três repetições e utilizando quarto diferentes métodos de extração: extração a vapor
(Cook N Home, EUA) ou utilizando um liquidificador doméstico (Walita, Brasil), um
extrator por esmagamento (Samsom, EUA) e uma centrífuga (Walita, Brasil). A extração
a vapor foi conduzida por até cinco horas utilizando 5,0 Kg de frutas e foram coletadas
alíquotas do suco a cada intervalo de uma hora (essas foram denominadas frações A: 0-
50
1 h, 1-2 h, 2-3 h, 3-4 h e 4-5 h). Foram, também coletadas alíquotas do suco obtido desde
o início do processo de extração (frações B: 0-1 h, 0-2 h, 0-3 h, 0-4 h e 0-5 h). Para
obtenção do suco por métodos mecânicos (liquidificador, extrator e centrífuga), foi
utilizado 1,0 kg de fruta. O rendimento foi determinado e expresso com volume (mL) de
suco obtido por kg de fruta. Foram, também, adquiridos três lotes de três marcas de
sucos integrais de uvas tintas. Exceto para as análises sensoriais e microbiológicas,
amostras dos sucos foram mantidas até -80 °C até a realização das demais análises.
5.2.2. Estabilidade do suco obtido por extração a vapor durante estocagem
Sucos obtidos por extração a vapor foram estocados por 24 meses e avaliados
quanto à qualidade microbiológica, teor de antocianinas totais e compostos fenólicos
totais e capacidade antioxidante. Considerando que os sucos obtidos pelos outros
métodos de extração aplicados não são estáveis, esses não foram estocados.
Imediatamente após a extração a vapor, amostras de sucos foram coletadas em frascos
estéreis de 50 mL, tampados com tampa de rosca e estocados em temparatura ambiente
(28 °C) protegidos da luz. Após 0, 5, 12, 20 e 24 meses foram coletadas amostras que
foram submetidas a análises microbiológicas e estocadas a -80 °C até a realização das
demais análises.
5.2.3. Determinação de acidez total titulável, pH e sólidos solúveis totais
A acidez total titulável foi determinada por titulação de 10 mL de suco + 50 mL de
água destilada, com 0,1 N NaOH até pH 8,2 usando um pHmetro (Micronal, Brasil) e foi
expressa em g de ácido tartárico.100 mL-1. O pH foi determinado em 2 mL de amostra,
com uso de um pHmetro. O teor de sólidos solúveis totais foi determinado no
sobrenadante obtido após centrifugação das amostras a 4000g por 5 min, usando um
refratômetro com correção de temperatura (20 °C) (Atago 0–32 °Brix, Japão), e os
resultados foram expressos em °Brix, de acordo com a Association of Official Analytical
Chemists methods (AOAC, 1995). Todas as análises foram realizadas em triplicata.
5.2.4. Análise colorimétrica
A cor dos sucos foi avaliada utilizando um colorímetro Konica Minolta (CR-400,
Japão) calibrado com placa de calibração branca. Foram determinadas as coordenadas
de cor L*, a* e b*, que representam as diferentes características cromáticas, com L*
51
representando o brilho, com variação entre o preto total e o branco total (0 a 100), a *, a
posição entre o verde (valores negativos) e o vermelho e b *, a extensão entre o azul
(valores negativos) e o amarelo (valores positivos). Com base nesses dados, foram
calculados os valores de Croma, C*= (a *2 + b *2 )1/2 e tonalidade, h° = arctan (b */a*). A
diferença total de cor (ΔE*) foi calculada usando a equação: ΔE* = (Δa*2+Δb*2+ΔL*2)1/2,
onde Δa* = a*-a*0 e Δb* = b*-b*0, e 0 subscrito indica a cor no tempo zero. Foram
realizadas três medições para cada repetição.
5.2.5. Determinação do teor de compostos fenólicos totais
A extração de compostos fenólicos solúveis (CFS) e hidrolizáveis (CFH) foi
realizada de acordo com Vinson et al. (2001). Resumidamente, em tubos com tampa de
rosca, 100 μL de suco ou 100 mg de amostras foram extraídos com 500 μL de solução de
metanol 50% para CFS, e solução de metanol 50% acidificado (1,2 M) com HCl para CFH.
Os tubos permaneceram em banho-maria (90 °C/3 h) e, após resfriamento, o volume foi
completado para 1mL com metanol. Os tubos foram centrifugados (12.000 g/5 min) e os
sobrenadantes usados para a determinação de CFS e CFH de acordo com Karou et al.
(2005). Um volume de 150 L de reagente Folin-Ciocalteu 50% foi adicionado a 60 L
dos extratos. Após 5 min, 840 L de água e 150 L de solução de carbonato de sódio
anidro 20% foram adicionados. Após 30 min a absorbância foi medida a 750 nm. O teor
de polifenois foi calculado com base em curva padrão de ácido gálico (0 – 500 mg.L-1) e
os resultados expressos em equivalentes de ácido gálico, GAE.L-1. As análises foram
realizadas em triplicata.
5.2.6. Determinação do teor de antocianinas monoméricas totais
O teor de antocianinas monoméricas totais foi determinado pelo método de pH-
diferencial (GIUSTI; WROLSTAD, 2001). O fator de diluição adequado dos extratos, foi
definido pela diluição dos mesmos em solução tampão de cloreto de potássio, pH 1,0 e
determinação da absorbância a 520nm. Foi considerado adequado o fator de diluição
que permitia a obtenção de leitura de absorbância dentro da faixa de linearidade do
espectrofotômetro. Alíquotas das amostras foram diluídas de acordo com o fator de
diluição determinado previamente, com soluções tampão de cloreto de potássio, pH 1,0
e de acetato de sódio, pH 4,5. A absorbância das soluções foi lida após 15 min a 520
(A520) e a 700nm (A700) e os resultados, calculados em equivalentes de cianidina 3-
52
glicosídeo por litro (mg cianidina.L-1), utilizando coeficiente de extinção molar (ε) de
26.900 L.mol−1.cm−1 e peso molecular (MW) de 449,2 g.mol-1: teor de antocianinas (mg.L-
1) = (A × MW × DF × 103)/(ε x 1), onde: A = (A520 – A700)pH1,0 – (A520 - A700)pH4,5; DF =
fator de diluição; 1 = caminho ótico (1 cm). As leituras foram replicadas três vezes.
5.2.7. Capacidade antioxidante
A capacidade antioxidante foi determinada pelos métodos de captura do radical
livre 2,2-difenil-1-picrilidrazila (DPPH) (KIM et al., 2002) e ferric reducing ability of
plasma (FRAP) (PANTELIDIS et al., 2007). Para determinação da capacidade
antioxidante por DPPH, 2,9 mL de solução 100 µM de DPPH solubilizado em solução
aquosa de metanol 80% foram adicionados, em duplicata, a 100 µL das amostras e a 100
µL de soluções padrão de Trolox em concentrações entre 100 e 1000 µM. A absorbância
foi medida a 517 nm antes da adição das amostras e 30 min após.
Para determinação da capacidade antioxidante por FRAP 20 µL das amostras
foram diluídas em 80 µL de água destilada e 15 µL dessa solução foram adicionados a
285 µL do reagente de FRAP preparado pela mistura de tampão acetado de sódio 300
mM, pH 3,6, TPTZ 10 mM em 40 mM HCl e cloreto férrico 20 mM, na proporção de
10:1:1. A absorbância foi lida a 593 nm após 30 min na ausência de luz. Soluções padrão
de Trolox foram preparadas em concentrações de 0,1 a 2 mM. As análises foram
realizadas em duplicata para cada repetição e os resultados foram expressos em μmol
equivalentes de trolox, μmol TE.L-1.
5.2.8. Análise sensorial
O suco extraído a vapor foi submetido à análise sensorial após aprovação pelo
comitê de ética do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho (protocolo 145/2011).
Essas análises foram realizadas somente com os sucos obtidos por extração a vapor
devido à estabilidade desses. Os critérios de inclusão dos participantes foram gostar de
suco de uva e não ser intolerantes a este. Um painel composto de 50 provadores não
treinados, sendo 20 homens e 30 mulheres, em idades variando entre 18 e 64 anos,
participou da avaliação do suco. As amostras (50 mL) foram servidas em temperatura
ambiente e os avaliadores pontuaram os atributos cor, sabor, aroma e aceitação geral
em uma escala hedônica de 1 a 9 na qual 1 denota “desgostei extremamente” e 9, “gostei
extremamente”. Os provadores também responderam a questões demográficas
53
relacionadas a gênero; grupo de idade; intenção de compra, medida em uma escala de
cinco pontos; e hábitos de consumo de suco de uva, medidos em uma escala de quatro
pontos.
5.2.9. Estabilidade microbiológica durante estocagem
Sucos de uva extraídos a vapor foram avaliados quanto à estabilidade microbiana,
durante estocagem por 0, 5, 12, 20 e 24 meses. Foram determinadas a contagem total de
bactérias aeróbias mesófilas (em unidades formadoras de colônias UFC/mL), contagem
de fungos filamentosos e leveduras (UFC/mL), bactérias ácido láticas (UFC/mL) e
coliformes (número mais provável NMP/mL). As analyses foram conduzidas de acordo
com metodologia descrita no Compendium of Methods for the Microbiological
Examination of Foods (VANDERZANT and SPLITTSTOESSER, 1992). Para a realização da
contagem microbiana, as amostras de suco foram submetidas a diluições decimais
seriadas (1 x 100 a 1 x 10-3) em solução salina peptonada (1 g peptona e 8,5 g NaCl.L-1)
em duplicata. A quantificação de bactérias aeróbias mesófilas foi determinada por
contagem padrão em placas utilizando ágar padrão para contagem após incubação a 37
°C/48 h, fungos filamentosos e leveduras em agar batata dextrose após incubação a 25
°C/48 h e bactérias ácido láticas em agar Man, Rogosa and Sharpe após incubação a 37
°C/24 h em microaerofilia. A contagem de bactérias coliformes totais foi determinada
pela técnica do número mais provável em Caldo Verde Brilhante Lactose Bile 2%, com
tubos Durham invertidos e incubação a 37 °C/24 h.
5.2.10. Análises estatísticas
Três experimentos independents foram realizados e os ensaios foram
conduzidos em triplicata. As diferenças entre as médias foram detectadas pela análise
de variância (ANOVA) e avaliadas pelo teste de Tukey, sendo p < 0,05 considerado
significativo. As análises foram realizadas utilizando o programa Graph Pad Prism 5
(GraphPad Software, 2009). A correlação entre o conteúdo de fenólicos totais e a
capacidade antioxidante foi determinada por meio do coeficiente de correlação de
Pearson.
54
5.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados deste capítulo são apresentados no Artigo I (Anexo I): Lopes, Maria
Lucia Mendes. Grape juice obtained by four small-scale extraction methods:
physicochemical characteristics phenolic content, antioxidant capacity and
stability during storage. Submetido para publicação na revista Journal of Food
Composition and Analysis.
Resumo
Sucos de uva produzidos em pequena escala são amplamente consumidos como
alternativa aos produtos comerciais. O processo de extração, entretanto, pode alterar os
compostos bioativos e a capacidade antioxidante no produto final. Neste estudo, quatro
métodos de extração (vapor, extrator, centrífuga e liquidificador) foram aplicados e seus
produtos avaliados quanto aos teores de compostos fenólicos solúveis e hidrolisáveis,
antocianinas totais, capacidade antioxidante determinada por FRAP (método de redução
dos íons de ferro) e pelo radical DPPH (método de captura do radical 2,2-difenil-1-
picrilidrazila), características físico-químicas e parâmetros colorimétricos. A
aceitabilidade dos sucos preparados por extração a vapor, assim como a estabilidade
desses durante a extração e a estocagem por 24 meses, foram, também, avaliadas. O suco
extraído a vapor apresentou maior teor de compostos fenólicos solúveis (1073 ± 58 mg
ác.gálico.L-1), antocianinas (138 ± 22 mg cianidina.L-1) e capacidade antioxidante (2560
± 239 e 4539 ± 456 μM Trolox por DPPH e FRAP, respectivamente), quando comparado
aos sucos preparados pelos demais métodos. O prolongamento do processo de extração
por 5h reduziu o teor de sólidos solúveis e acidez, assim como o teor de antocianinas,
enquanto o teor de compostos fenólicos solúveis e a capacidade antioxidante
aumentaram, especialmente entre a primeira e a segunda hora de extração. Embora o
suco extraído a vapor tenha se mantido microbiologicamente estável durante 24 meses
de estocagem, houve redução no teor de compostos fitoquímicos, principalmente ao
longo dos cinco primeiros meses. O tipo de processamento e a estocagem do suco de uva
devem ser considerados na estimativa da ingestão de fitoquímicos.
55
6. CAPÍTULO 2: Efeito da extração a vapor sobre antocianinas em uva Isabel (Vitis
labrusca), suco e resíduo.
6.1. OBJETIVO
Investigar o efeito da extração de suco a vapor sobre o teor compostos fenólicos
totais, antocianinas totais e capacidade antioxidante, bem como sobre o perfil de
antocianinas, pela quantificação destes na uva, na sua casca e polpa, no suco e no resíduo
da produção do suco.
6.2. MATERIAL E MÉTODOS
6.2.1. Preparo das amostras
Uvas da cultivar Isabel (Vitis labrusca) colhidas no Rio Grande do Sul foram
adquiridas em uma central de abastecimeno no Rio de Janeiro. Aproximadamente 15 kg
de uvas foram higienizadas, desengaçadas e utilizadas para o preparo de suco por
extração a vapor, em três repetições. Foram coletadas alíquotas das uvas inteiras, do
suco e do resíduo obtido após a extração. Três alíquotas de 100 g de uvas tiveram as
frações casca, polpa e sementes, separadas manualmente, em ambiente protegido da luz
e sob refrigeração para prevenir oxidação. Todas as amostras froam liofilizadas e
mantidas a -80 °C até o momento das análises.
Foram conduzidos testes para extração de antocianinas utilizando soluções de
metanol: acido fórmico (95:5, v:v), água:metanol (50:50, v:v) e metanol:água:ácido
fórmico (70:25:5, v:v:v) a fim de identificar aquela que produziria maior rendimento.
Aproximadamente 1 g das amostras liofilizadas foram trituradas em nitrogênio
líquido e extraídas com 10 ml de solução de metanol:água:ácido fórmico (70:25:5, v:v:v).
Após agitação por 30 s, os tubos contendo as amostras e a solução de extração foram
submetidos à sonicação (Fisher Scientific, EUA) por 5 min em ambiente escuro, e
centrifugados 10.000 rpm por 10 min. O sobrenadante foi coletado e os resíduos re-
extraídos por três vezes. Os extratos foram combinados e o volume completado para 50
mL com solução de extração em frascos volumétricos. Os extratos foram mantidos a -80
°C até o momento das análises.
56
6.2.2. Análies por CLAE e CLAE-IE-EM/EM
Análises para identificação das antocianinas foram conduzidas por cromatografia
líquida de alta eficiência em cromatógrafo Waters 2695 equipado com detector de
fotodiodo (Waters, EUA) acoplada à espectrometria de massas (CLAE-EM) com
ionização por electrospray e analisador do tipo quadrupolo em tempo-de-vôo em
sequência (IE-QToF-EM/EM) (Micromass MS Technologies, GBR). Os extratos foram
secos em um concentrador Speedvac (Savant SPD131 DDA, EUA) e o resíduo
solubilizado em solução de água:metanol:ácido fórmico (80:18:2, v:v:v) e filtrado em
filtro de politetrafluoretileno (PTFE) de 0,45 µm antes da injeção. Foi utilizada coluna
Gemini C6-fenil (250 mm x 4,6 mm, 5 μm, Phenomenex) (Torrance, EUA) mantida a 35
°C para a separação dos compostos. A fase móvel consistiu de gradiente de solução
aquosa de ácido fórmico a 5% (eluente A) e 5% de ácido fórmico em acetonitrila
(eluente B). Antes da injeção da amostra, a coluna foi equilibrada com 0%B. Após a
injeção, essa proporção foi aumentada para 30%B em 30 min, 95%B em 35 min, foi
mantida constante até 39 min, e decresceu a 0% de 39,01 a 48 min. Entre as injeções,
intervalos de 20 min foram utilizados para reequilibrar a coluna. O fluxo foi de 1,0
mL/min. A análise por espectrometria de massas foi realizada em modos de ionização
positivo e negativo, nas seguintes condições: voltagem do capilar 3,2 kV para o modo
positivo e 2,8 kV para o negativo, voltagem do cone de 35 V, temperatura da fonte de
100 °C, e nitrogênio como gás de dessolvatação a temperatura de 400 °C, com fluxo de
600 L/h. Os mesmos parâmetros instrumentais foram utilizados para as análises por
EM/EM, exceto que a energia de colisão, neste caso, foi de 25 eV.
A quantificação das antocianinas nas amostras foi realizada em cromatógrafo
Agilent 1100 (Agilent, DEU) equipado com injetor automático e detector de arranjo de
fotodiodo. Para a separação cromatográfica foram utilizados os mesmos coluna e
método descritos na etapa de identificação. Foram injetados 10 μL dos extratos e o
perfis cromatográficos foram monitorados em comprimentos de onda entre 280 a 600
nm. O teor de antocianinas foi calculado a partir da área total dos picos a partir de
cromatogramas de curvas de calibração de cinco pontos obtidos com cianidina 3-O-
glicosídeo a 520 nm.
57
6.2.3. Quantificação de compostos fenólicos totais e antocianinas monoméricas
totais
O teor de compostos fenólicos totais foi determinado de acordo com Waterhouse
(2005). Os extratos foram diluídos para obtenção de concentrações apropriadas para
análise. Uma alíquota de 60 µL dos extratos foi adicionada a 150 µL de reagente de
Folin-Ciocalteu diluído a 50% em água. Após 5 min, 840 L de água e 150 L de solução
de carbonato de sódio anidro 20% foram adicionados. A absorbância da solução de cor
azul foi lida a 765 nm após incubação por 2 h em temperatura ambiente. Os resultados
foram calculados utilizando a equação obtida para a curva de solução de ácido gálico (0 a
750 mg.L-1) e expressos em mg equivalente de ácido gálico (GAE) por quilograma ou
litro de amostra fresca.
A metodologia de pH-diferencial (GIUSTI; WROLSTAD, 2001) foi utilizada para
quantificar o teor de antocianinas monoméricas totais nas amostras, conforme descrito
no item 5.2.6.
6.2.4. Determinação da capacidade antioxidante
A capacidade antioxidante foi determinada pelos métodos de captura do radical
livre 2,2-difenil-1-picrilidrazila (DPPH) e ferric reducing ability of plasma (FRAP). A
determinação da capacidade antioxidante por DPPH foi realizada conforme descrito no
item 5.2.7. Para determinação da capacidade antioxidante por FRAP, 90 µL dos extratos
ou de soluções padrão de trolox (0 a 1000 μmol.L-1) foram foram adicionados a 2,7 mL
do reagente de FRAP preparado pela mistura de tampão acetado de sódio 300 mM, pH
3,6, TPTZ 10 mM em 40 mM HCl e cloreto férrico 20 mM, na proporção de 10:1:1. A
absorbância foi lida a 593 nm após 30 min na ausência de luz. As análises foram
realizadas em duplicata para cada repetição e os resultados foram expressos em
equivalentes de trolox, μmol TE.kg-1 ou mol TE.L-1 (BENZIE & STRAIN, 1996).
6.2.5. Análises estatísticas
Os experimentos foram conduzidos em três repetições e os dados foram
submetidos à análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de Tukey, para
comparação entre as médias (p < 0,05). Dados quantitativos foram apresentados como
médias com os respectivos desvios padrão. As análises foram realizadas utilizando o
programa Graph Pad Prism 5 (GraphPad Software, 2009).
58
6.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados deste capítulo são apresentados no Artigo II (Anexo II): Lopes,
Maria Lucia Mendes. Effect of steam extraction on anthocyanins in Isabella grape
(Vitis labrusca), juice, and pomace.
Resumo
As antocianinas são responsáveis pela cor dos sucos de uvas tintas e possuem
propriedades benéficas à saúde. O processamento térmico dos alimentos pode alterar o
conteúdo desses compostos nos seus produtos. O objetivo deste estudo foi determinar o
teor de antocianinas totais e o perfil de antocianinas, o teor de compostos fenólicos
totais e a capacidade antioxidante in vitro de uvas da variedade Isabel, sua casca, polpa e
suco obtido por extração a vapor, assim como no resíduo obtido após a extração do suco.
O perfil de antocianinas foi analisado por cromatografia líquida de alta eficiência com
detector de arranjo de diodos (CLAE-DAD) e por espectrometria de massas sequencial
com ionização do tipo electrospray (IE/EM/EM). A quantificação de antocianinas foi
determinada por CLAE e pelo método de pH diferencial. O teor de compostos fenólicos
totais foi avaliado usando o reagente de Folin-Ciocalteu e a capacidade antioxidante,
determinada pelo método de sequestro do radical livre 2,2-difenil-1-picrilidrazila
(DPPH) e pelo método de redução dos íons de ferro (FRAP). As antocianinas estão
presentes exclusivamente na casca das uvas da variedade Isabel, cuja amostra
apresentou maior teor deste composto. Foram identificadas 15 antocianinas. Os
derivados de malvidina estavam presentes em maior teor em todas as amostras.
Diferente das demais antocianinas, o teor de derivados de delfinidina e petunidina foi
maior no suco e no resíduo, quando comparado com a casca. O resíduo apresentou
maior conteúdo de compostos fenólicos e capacidade antioxidante por DPPH e FRAP. Os
resultados demonstraram que o processamento aplicado para a extração do suco
promove alteração no perfil de antocianinas.
59
7. CAPÍTULO 3: Suco de uva Concord orgânico e convencional: cor, capacidade
antioxidante e teor de antocianinas e de compostos fenólicos.
7.1. INTRODUÇÃO
As uvas da variedade Concord (Vitis labrusca) estão entre as três mais
comumente utilizadas para a fabricação de suco no Brasil (RIZZON & MIELE, 2012). São
uvas tintas com sementes e ricas em compostos fenólicos. Diversos estudos demonstram
os efeitos benéficos à saúde, resultantes do consumo do suco desta uva (KRIKORIAN et
al., 2010; ROWE et al., 2011; SHUKITT-HALE et al., 2006).
A busca pela alimentação saudável tem sido acompanhada pela preocupação dos
consumidores em relação à produção sustentável de alimentos (WHO, 2003), levando ao
crescimento do consumo de produtos cultivados pelo sistema orgânico. Produtos
obtidos segundo os princípios e métodos do cultivo orgânico promovem a conservação
ambiental e representam opção de renda, especialmente para a agricultura familiar. No
Brasil, a Lei 10.831/2003 dispõe sobre o sistema orgânico de produção agropecuária
(BRASIL, 2003) e o Decreto 6.323/2007 regulamenta esta lei (BRASIL, 2007). Na
vitivinicultura orgânica, é vedado o uso de agrotóxicos sintéticos no controle de pragas e
doenças, que são controladas com preparados naturais.
A agricultura familiar, meio de organização da produção agrícola gerenciada e
operada por uma família e predominantemente dependente do trabalho familiar, busca
geração de renda, segurança alimentar e qualidade de vida na propriedade rural (FAO,
2014). As agroindústrias familiares contribuem para melhor distribuição de renda e
para a estabilidade do setor vitivinícola. Assim, a produção do suco de uva na própria
propriedade rural evita a transferência de renda do setor rural para o industrial,
representando uma alternativa para geração de renda dos produtores rurais e suas
famílias (BRESOLIN; GULARTE; MANFROI, 2013; RIZZON; MENEGUZZO, 2007).
A extração de suco de uva por arraste de vapor é utilizada pela maioria das
agroindústrias familiares do Rio Grande do Sul (BRESOLIN; GULARTE; MANFROI, 2013).
Nesse processo, o suco é engarrafado a quente para garantir a conservação sem
utilização de aditivos químicos, compatível com o que é preconizado pelo sistema de
cultivo orgânico.
Até recentemente não havia evidências de que o consumo de alimentos orgânicos
traria mais benefícios à saúde quando comparados aos convencionais. No entanto,
60
estudo de revisão sistemática e meta-análise divulgada, recentemente, conclui que há
diferenças significativas na composição entre alimentos cultivados pelo sistema
orgânico em relação ao convencional, especialmente no que se refere ao teor de
compostos com atividade antioxidante, que foi substancialmente maior em alimentos
orgânicos. Os autores verificaram, ainda, maior teor de metais tóxicos e frequência de
ocorrência de resíduos de defensivos agrícolas quatro vezes maior em culturas
convencionais (BARAŃSKI et al., 2014). Dani et al. (2007) e Vrček et al. (2011)
encontraram maior teor de compostos fenólicos em uvas e produtos de uvas obtidas por
cultivo orgânico, quando comparados aos convencionais.
7.2. OBJETIVO
Avaliar, comparativamente, a capacidade antioxidante, o teor de antocianinas e
de compostos fenólicos em sucos comerciais de uvas Concord produzidas pelos sistemas
orgânico e convencional.
7.3 MATERIAL E MÉTODOS
7.3.1. Preparo das amostras
Para avaliação comparativa dos sucos de uva Concord orgânico e convencional
quanto a cor, capacidade antioxidante e teor de antocianinas e de compostos fenólicos,
foram adquiridas três amostras de três diferentes lotes de sucos produzidos em uma
vinícola situada em Bento Gonçalves – RS, a partir de uvas da variedade Concord
cultivadas pelos sistemas orgânico e convencional, na própria propriedade. Os sucos
foram produzidos pelo método de extração a vapor. Três amostras de cada um dos sucos
foram adquiridas para análise. Aproximadamente 1 g da amostra liofilizada foi
submetido à extração com 10 mL de solução de metanol:água:ácido fórmico ( 80:75:5,
v:v:v), por quatro vezes.
A cor dos sucos foi avaliada com colorímetro Konica Minolta, conforme descrito
no item 5.2.4. O teor de compostos fenólicos totais dos sucos foi determinado de acordo
com Waterhouse (2005), conforme descrito no item 6.2.3 e o teor de antocianinas totais,
pelo método de pH-diferencial (GIUSTI; WROLSTAD, 2001), conforme descrito no item
5.2.6. A capacidade antioxidante foi determinada pelos métodos de captura do radical
61
livre 2,2-difenil-1-picrilidrazila (DPPH) e ferric reducing ability of plasma (FRAP),
conforme descrito no item 5.2.7.
Os dados quantitativos foram apresentados como média com os respectivos
desvios padrão. Foi aplicado o teste t não pareado para definir diferenças significativas
do teor de compostos fenólicos e antocianinas, capacidade antioxidante e cor entre as
amostras. Os dados foram analisados com auxílio do programa Graphpad Prism, versão
5 (2009).
7.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
As uvas utilizadas para a produção dos sucos analisados neste ensaio foram
cultivadas em diferentes áreas de uma mesma propriedade e pertencem à mesma safra
agrícola. A vinícola onde os sucos são produzidos recebe certificação, que garante a
qualidade orgânica dos produtos.
Os valores dos parâmetros colorimétricos obtidos para os sucos de uva Concord
orgânico e convencional estão apresentados na Tabela 7.1. A diferença média de cor
entre os sucos (ΔE* = 1,9) indica que a mesma pode ser percebida, mesmo por um
observador não treinado (BALDEVBHAI; ANAND, 2012). Essa diferença, embora
perceptível, não necessariamente compromete a aceitação do produto pelo consumidor.
Tabela 7.1. Parâmetros colorimétricos de suco de suco de uva Concord orgânico e
convencional.
Parâmetros
cololimétricos
avaliados
Suco de uva Concord
Convencional
(n = 9)
Orgânico
(n = 9)
L* 19,2 ± 0,3 a 18,4 ± 0,0 b
a* 3,6 ± 0,7 a 1,9 ± 0,1 b
b* -0,05 ± 0,08 a -0,10 ± 0,04 a
C* 3,6 ± 0,8 a 1,9 ± 0,0 b
h° -0,01 ± 0,02 a -0,05 ± 0,01 b
Os valores são expressos como médias ± DP. Médias seguidas de letras diferentes nas
linhas indicam diferença significativa pelo teste t (p < 0,05).
62
Os valores de croma foram inferiores aos obtidos em outro experimento
realizado pelos autores com sucos de uva da variedade Isabel (8,0 a 13,1). Esses
resultados, no entanto, ficaram próximos aos valores de croma obtidos para sucos
industrializados, que variaram entre 1,3 e 2,1. A tonalidade do suco de uva Concord é
mais vermelha, quando comparado aos sucos industrializados e àqueles preparados com
uvas da variedade Isabel, pelo mesmo método de extração, que apresenta variação em
direção ao amarelo (h° = 10,5 a 16,7).
Na tabela 7.2 são apresentados os resultados do teor de antocianinas e
compostos fenólicos e capacidade antioxidante de suco de uva Concord orgânico e
convencional. O suco convencional apresentou teor de antocianinas aproximadamente
60% maior, o que pode estar relacionado às práticas culturais adotadas no sistema de
cultivo orgânico ou a fatores, como topografia do terreno ou posição geográfica da
cultura, que poderiam permitir maior exposição dos cachos de uva à luz solar (TEIXEIRA
et al., 2013). Embora o teor de antocianinas tenha sido maior no suco convencional, não
houve diferença significativa no teor de compostos fenólicos totais entre os sucos
orgânicos e convencionais. No entanto, de modo geral, a literatura demonstra que o teor
de compostos fenólicos é maior em alimentos produzidos pelo sistema orgânico,
provavelmente como resposta de resistência induzida nessas culturas, que ficam mais
susceptíveis à incidência de pragas e doenças, pelo fato de não serem aplicados
fertilizantes e defensivos sintéticos (BARAŃSKI et al., 2014).
Tabela 7.2. Teor de antocianinas e compostos fenólicos e capacidade antioxidante de
suco de uva Concord orgânico e convencional.
Suco de uva
Concord
Antocianinas
(mg cianidina
.L-1)
Compostos
fenólicos
(mg GAE.L-1)
DPPH
(μM TE.L-1)
FRAP
(μM TE.L-1)
Orgânico 231 ± 49 b 3466 ± 643 a 15460 ± 1456 a 19310 ± 1773 a
Convencional 371 ± 79 a 3460 ± 574 a 12920 ± 1674 a 15800 ± 1635 b
Médias seguidas de letras diferentes nas colunas indicam diferença significativa pelo
teste t (p < 0,05).
A capacidade antioxidante não diferiu significativamente quando avaliada por
DPPH e foi aproximadamente 22% maior no suco orgânico, quando avaliada pelo
63
método FRAP. Estudo comparativo entre uvas orgânicas e convencionais e seus
produtos demonstra que as uvas orgânicas apresentaram maior capacidade
antioxidante e teor de compostos fenólicos totais um mês antes da colheita. No entanto,
essa diferença não foi observada no momento da colheita da uva nem nos vinhos obtidos
com as mesmas (MULERO; PARDO; ZAFRILLA, 2010).
As uvas utilizadas na elaboração dos sucos avaliados neste experimento
pertenciam a uma mesma variedade, foram produzidas nas mesmas safra agrícola e
propriedade. Estavam, portanto, sujeitas a condições edafoclimáticas semelhantes. Além
disso, o processo utilizado para elaboração dos sucos foi o mesmo. No entanto, ainda
assim, conforme destacado por Teixeira et al. (2013), outras variáveis influenciam o teor
de compostos fenólicos nas uvas.
Smith-Spangler et al. (2012) destacam, entre os benefícios do consumo de
alimentos orgânicos, a redução da exposição a resíduos de pesticidas e a bactérias
resistentes a antibióticos. Para avaliação comparativa mais aprofundada do teor dos
compostos fenólicos em produtos de uva orgânicos e convencionais, torna-se necessário
o acompanhamento da cultura e o controle dos tratos culturais, além da repetição do
experimento em diferentes safras.
64
8. CAPÍTULO 4: Efeito de alta pressão hidrostática em uvas sobre o teor de
compostos fenólicos no suco extraído a vapor e no resíduo.
8.1. INTRODUÇÃO
O teor e o perfil de compostos fenólicos presentes nas uvas pode ser alterado pelo
processamento aplicado para a produção do suco (PATRAS et al, 2009). A alta pressão
hidrostática (APH) é uma tecnologia alternativa ao tratamento térmico, que age sobre o
produto de forma instantânea e uniforme, independente de tamanho, forma ou
composição. O processamento de alimentos por APH preserva as características
sensoriais e nutricionais e promove inativação de micro-organismos e enzimas,
garantindo extensão da vida de prateleira, sem a utilização de aditivos (LAVINAS et al.,
2008; TORRES; VELAZQUEZ, 2005). Enquanto a estrutura de moléculas de alto peso
molecular, como proteínas e glicídeos, pode ser alterada pela aplicação de APH,
moléculas menores, como compostos voláteis, pigmentos, vitaminas e outros compostos
relacionados às características sensoriais, nutricionais e à promoção da saúde, não são
afetadas (OEY et al., 2008).
A aplicação de tratamentos por APH em suco de uva tem sido investigada,
visando obter máxima retenção da capacidade antioxidante e de compostos fenólicos
(CHAUHAN et al., 2011). Tratamentos de 600 e 900 MPa aplicados ao suco de uva
preparado a frio reduziram o escurecimento dos sucos e permitiram maior retenção de
compostos fenólicos não flavonoides, quando comparados ao suco não pressurizado e
aos sucos pressurizados a 300MPa (CASTELLARI et al., 2000). Tem sido investigada,
também, a aplicação de tratamentos por APH visando aumentar a extração de
compostos bioativos da casca de uvas e do resíduo da industrialização desta fruta
(CORRALES et al., 2009).
O processamento de uvas gera grande quantidade de resíduo, que consiste,
principalmente, de cascas e sementes que é, geralmente, descartado, causando
problemas econômicos e ambientais (AUGUSTINE et al., 2013; ROCKENBACH et al.,
2011b). Como os resíduos podem ser fontes para obtenção de compostos bioativos, têm
sido realizadas pesquisas visando melhor caracterização dos compostos presentes
(ROCKENBACH et al., 2011b; RUBILAR et al., 2007), aperfeiçoamento dos métodos de
extração de compostos bioativos (CORRALES et al., 2008; GOLLUCKE; RIBEIRO, 2012) e
utilização desses resíduos na produção de alimentos e ingredientes (YU; AHMEDNA,
65
2013). São necessários estudos relacionados à aplicação de tecnologias que visem
melhor aproveitamento das propriedades funcionais das uvas cultivadas no Brasil e de
seus produtos.
8.2. OBJETIVO
Avaliar o efeito de alta pressão hidrostática em uvas Isabel sobre o teor de
compostos fenólicos no suco e no resíduo da produção do suco.
8.3. MATERIAL E MÉTODOS
Uvas da variedade Isabel, em estádio de maturação comercial, foram
higienizadas, removidas dos engaços, embaladas a vácuo e submetidas a tratamentos
por APH a 400 e 600 MPa, por cinco minutos, em três repetições. Considerando a
limitação de volume para processamento do equipamento de APH (150 ml), foi
desenvolvido protótipo de equipamento para a extração do suco a vapor em pequena
escala (Figura 8.1). Após pressurização das uvas, estas foram utilizadas para preparo de
suco por extração a vapor durante 60 min. Amostras do suco e do resíduo, obtido após
extração deste, foram coletadas para análise.
Figura 8.1. (a) Protótipo de equipamento para a extração do suco a vapor em
pequena escala, (b) Foto comparativa entre protótipo e o equipamento utilizado para
extração em escala laboratorial.
A determinação do teor de compostos fenólicos solúveis (CFS) e hidrolizáveis
(CFH) foi realizada conforme descrito no item 5.2.5.
Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo
teste de Tukey, com auxílio do programa Graphpad Prism (versão 5.0, 2007).
(a) (b)
66
8.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os teores de CFS e CFH foram semelhantes nos sucos obtidos por extração a
vapor preparados com uvas pressurizadas a 400 e a 600 MPa. Os teores desses
compostos foram maiores nos resíduos, quando comparados aos sucos. Na comparação
entre os dois tratamentos por APH, tanto os teores de CFS quanto o de CFH foram
maiores nos resíduos de uvas pressurizadas a 600 MPa (Figura 8.2). É importante
destacar, ainda, que, ao contrário das demais amostras, em que o teor de CFS foi inferior
ao de CFH, não houve diferença significativa entre o teor desses compostos nas amostras
de resíduo de uvas pressurizadas a 600 MPa.
S40
0
S60
0
R40
0
R60
0
S40
0
S60
0
R40
0
R60
0
0
1000
2000
3000
4000
5000CFH
CFS
A
B
C C
ab
cc
GA
E.k
g-1
Figura 8.2. Teor de compostos fenólicos solúveis (CFS) e hidrolizáveis (CFH) em suco (S)
e resíduo (R) obtidos a partir de uvas pressurizadas a 400 ou 600 MPa/5min (n=9).
Barras com letras minúsculas ou maiúsculas diferentes representam médias
significativamente diferentes (p < 0,05) de CFH e CFS, respectivamente.
O maior teor de compostos fenólicos obtido nas amostras pressurizadas a 600
MPa pode estar relacionado ao aumento da extração desses compostos, resultante do
tratamento por APH. O processamento por APH promove rearranjo na estrutura dos
tecidos, aumentando a permeabilidade destes e favorecendo a extração de diversos
compostos (RASTOGI et al., 2007). Em estudo realizado por CORRALES et al. (2008), foi
demonstrado aumento de até 50% na extração de antocianinas de resíduos de uvas
submetidos a tratamentos por APH e campos elétricos pulsados. Outro estudo
67
demonstrou, também, que tratamentos por APH (400 a 600 MPa) foram eficientes na
preservação da capacidade antoxidante, compostos fenólicos e flavonoides em suco de
uvas tintas (CHAUHAN et al., 2011).
Os teores de CFS e CFH obtidos para as amostras de suco preparadas utilizando o
protótipo do equipamento para extração a vapor, neste ensaio, foram respectivamente
50 e 60% inferiores aos encontrados em outros estudos do nosso grupo de pesquisa,
com sucos produzidos por extração a vapor em escala laboratorial, usando a mesma
variedade de uva. Foi, também, observado, visualmente, que a cor dos sucos foi menos
intensa, indicando a necessidade de ajustes no equipamento, o que está sendo
providenciado, de forma a melhorar a proporção entre a quantidade de amostra a ser
extraída e o vapor produzido.
Os resultados demonstram que não houve diferença no teor de compostos
bioativos nos sucos preparados a partir de uvas pressurizadas a 400 e a 600 MPa por 5
min. O maior nível de pressão aplicado permitiu maior extração de compostos fenólicos
do resíduo da uva, indicando que a pressurização da uva pode ser uma alternativa para
obtenção de resíduos ricos em compostos bioativos.
68
9. CONSIDERAÇÕES FINAIS
A extração do suco de uva a vapor resultou em produto com maior teor de
compostos fenólicos solúveis e maior capacidade antioxidante quando comparado aos
sucos obtidos por métodos de extração que não envolvem a aplicação de calor.
O aumento da duração do processo de extração a vapor por 5h resultou em
redução do teor de sólidos solúveis totais e antocianinas. Por outro lado, foi observado
aumento no teor de compostos fenólicos solúveis e na capacidade antioxidante entre 1 e
2h de extração.
O suco extraído a vapor apresentou boa aceitação por parte dos provadores na
análise sensorial.
Os sucos obtidos por extração a vapor mantiveram-se microbiologicamente
estáveis durante 24 meses de estocagem. No entanto, houve redução no teor de
compostos fenólicos, especialmente nos primeiros cinco meses.
Foram identificadas 15 antocianinas nas amostras de casca da uva Isabel, suco e
resíduo e 14 na uva, enquanto a polpa não contém antocianinas. Os derivados de
malvidina estão presentes em maior teor nas amostras.
A casca da uva foi a fração que apresentou maior teor de antocianinas, enquanto
o resíduo apresentou maior teor de compostos fenólicos e capacidade antioxidante,
demonstrando o potencial deste como fonte desses compostos.
O processamento para elaboração do suco a vapor promoveu alteração no perfil
de antocianias, sendo o teor de derivados de delfinidina e de petunidina presentes em
maior proporção nas amostras de suco e resíduo, quando comparadas à casca e à uva
inteira.
Sucos de uva da variedade Concord, produzidas pelos sistemas orgânico e
convencional, diferiram em relação à cor. O teor de antocianinas foi maior no suco
convencional, não havendo, entretanto, diferença significativa no teor de compostos
fenólicos totais entre os sucos. A capacidade antioxidante foi maior no suco orgânico,
quando avaliada pelo método FRAP.
O processamento de uvas por alta pressão hidrostática pode alterar o teor e o
perfil de compostos fenólicos em resíduos obtidos a partir dessas uvas.
69
10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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84
11. ANEXOS
85
Anexo I. Grape juice obtained by four small-scale extraction methods:
physicochemical characteristics, phenolic content, antioxidant capacity and
stability during storage
Maria Lucia Mendes Lopes a,*
aInstituto de Nutrição Josué de Castro, Universidade Federal do Rio de Janeiro (INJC-
UFRJ). Av. Carlos Chagas Filho, 373, 21941-902, Ilha do Fundão, Rio de Janeiro - RJ,
Brazil.
*Corresponding author: Phone: 55 21 39386449; Fax: +55 21 22808343; e-mail:
86
Abstract
Grape juices produced in small scale are widely consumed as an alternative to
commercial products. Extraction procedure, however, can affect bioactive compounds
and antioxidant capacity in the final product. In this study, juices prepared by four
different extraction methods (steam, extractor, juicer, and blender) were evaluated for
soluble and hydrolysable polyphenols content, total monomeric anthocyanins content,
antioxidant capacity, physicochemical characteristics and colorimetric parameters.
Acceptance of steam extracted juices and stability during extraction and storage for 24
months were also evaluated. Steam extracted juice resulted in higher soluble phenolics
content (1073 ± 58 mg gallic acid.L-1), anthocyanins content (138 ± 22 mg cyanidin.L-1)
and antioxidant capacity (2560 ± 239 and 4539 ± 456 μM Trolox by DPPH and FRAP,
respectively) when compared to the juices prepared by other methods. Color
parameters (L* a* b*) of the steam extracted juices were the most similar to
industrialized juices. Extension of steam extraction for 5h reduced total soluble solid
content and acidity as well as monomeric anthocyanins, while soluble phenolics and
antioxidant capacity increased specially from the first to the second hour. Steam
extracted juices had good overall acceptability being rated higher in color. Although
these juices had remained microbiologically stable during 24 months storage, changes in
phytochemical compounds and antioxidant capacity occurred mainly throughout the
first five months. Grape processing and juice storage have to be taken into account when
estimating the intake of phytochemicals.
Keywords
Grape juice, Juice extraction, Microbiology, Color, Grape juice stability, Sensory analysis.
87
1. Introduction
Reduced risk of non-communicable diseases associated with a diet rich in fruit
and vegetables is attributed to the complex mixture of phytochemicals present in these
foods (Liu, 2003 and Oyebode et al., 2014). Additive and synergistic effects of these
phytochemicals are responsible for their potent health effects (Liu, 2003). In this
context, grapes and grape products, rich in phenolic compounds such as anthocyanins,
catechin, epicatechin, and stilbenes, have been associated with in vitro and in vivo
antioxidant, anti-inflammatory, and anticancer properties (Jung et al., 2006 and Xia et
al., 2010). Human, consumption of red grape juice has been shown to confer antioxidant
protection, to increase HDL cholesterol and to reduce the concentration of inflammatory
biomarkers, resulting in the reduction of cardiovascular disease risk (Khadem-Ansari et
al., 2010 and Xia et al., 2010). There is also evidence that red grape juice consumption
can have a protective effect against certain types of cancers such as breast cancer and
colon cancer (Jung et al., 2006 and Xia et al., 2010).
Quantity and quality of phenolic compounds in grapes vary with variety, species,
season, and environmental and agricultural management factors (Yang et al., 2009 and
Cazarin et al., 2013). Brazil produces mainly American and hybrid grape varieties among
which the black skinned grape cultivar Isabel is the most used for juice production
(Cazarin et al., 2013). However, juice processing methods can also affect bioactive
compounds in the final product (Patras et al., 2010). Mechanical extraction methods that
use masticating, centrifugal, and triturating juicers are commonly used domestically or
in small commercial establishments to prepare “fresh juices”. Industrially, heat
treatments are used to preserve and extend the products shelf life (Wang and Xu, 2007)
88
and has high impact on juice yield, color components, total phenolics and anthocyanins
contents of the juices (Threlfall et al., 2005).
Steam extraction is widely used to prepare red grape juices in small- and
medium-scale (Bresolin et al., 2013 and Häkkinen et al., 2000). This system is reported
to inactivate enzymes, pasteurize and exclude oxygen during extraction, providing
unusual good color and flavor retention to the juice produced (Bates et al., 2001).
However, the time used for steam extraction is not standardized, which may lead to
variations in the quality of the juice (Bresolin et al., 2013; Cazarin et al., 2013 and
Pinheiro et al., 2009).
Therefore, the aim of this study was to evaluate phytochemical content and color
parameters of grape juices produced by different extraction methods, as well as
chemical and microbial stability during storage.
2. Materials and Methods
2.1. Chemical reagents
Gallic acid, Folin–Ciocalteu reagent, 2,2-di-phenyl-1-picrylhydrazil (DPPH), 6-
hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylicacid (Trolox), and 2,4,6-tris (2-
pyridyl)-s-tri-azine (TPTZ), methanol, acetone, acetic acid and anhydrous sodium
carbonate, were purchased from Sigma–Aldrich (St. Louis, USA). Plate count agar, potato
dextrose agar, Man, Rogosa and Sharpe agar medium, brilliant green lactose broth
(Merck, Germany). All other chemicals were of analytical grade.
89
2.2. Sample acquisition and characterization
Grapes (Vitis labrusca) of the Isabel cultivar were harvested in the state of Rio
Grande do Sul, Brazil’s main producing region, and acquired in Rio de Janeiro, Brazil at
commercial maturity stage. Fruits and stalks were manually separated and weighted as
well as skin, pulp and seeds to determine the contribution and proportion of each part.
Fruits dry weight was determined after drying the samples at 105 °C until constant
weight. Data concerning characteristics of the sample are listed in Table 1.
Table 1. General characteristics of the grapes from cultivar Isabel.
Parameter Value
Average weight of bunchesa (g)
Components of bunchesa
Grapes (g.kg-1)
Stalks (g.kg-1)
Average weight of grapesb (g)
Components of grapesb
Pulp (g.kg-1)
Skins (g.kg-1)
Seed (g.kg-1)
Grapes moisture content (g.100g-1)
107.66 ± 35.33
989.31 ± 27.09 (98.0%)
19.93 ± 3.30 (2.0%)
3.27 ± 0.18
563.2 ± 88.6 (56.3%)
401.8 ± 71.6 (40.2 %)
35.1 ± 1.3 (3.5%)
83.95 ± 0.67
Values are expressed as means ± SD
a average from 100 bunches.
b average from 3 representative aliquots of 50 berries.
90
2.3. Grape juice preparation
Juices were extracted from grapes produced in the same harvest, in three
repetitions, by four different methods: steam with a stainless steel steam juicer (Cook N
Home, USA), domestic blender (Walita, Brazil), masticating juice extractor (Samsom,
USA) and centrifugal juicer (Walita, Brazil). Steam extraction was conducted for five
hours using 5.0 Kg of fruit and aliquots were taken from juice collected in each hour
interval of the extraction (fractions A: 0-1 h, 1-2 h, 2-3 h, 3-4 h and 4-5 h), and juice
collected from the beginning of the extraction process (fractions B: 0-1 h, 0-2 h, 0-3 h, 0-
4 h and 0-5 h). For preparing juices by mechanical methods (blender, extractor and
juicer), 1.0 kg of fruits was used. Yield was determined and expressed as volume (mL) of
juice recovered / kg of fruit. Three lots of three brands of industrialized grape juice
(100% red grape juice) were also acquired in the local market (named as I1, I2 and I3) for
comparison. Sensory analyses were performed with steam extracted juices and aliquots
of all juices were stored at -80 °C until the other analyses were performed.
2.4. Juice storage and stability
Steam extracted grape juices were stored for 24 months and evaluated for
microbial quality, total monomeric anthocyanin and total phenolic contents and
antioxidant capacity. As the juices prepared by other methods were not expected to be
shelf stable, they were not stored. Immediately after steam extraction, juice samples
were collected into sterile 50 mL screw-capped vials and stored at room temperature
(28 °C) protected from light. Samples were collected at 0, 5, 12, 20 and 24 months and
91
subjected to microbiological analyses and stored at -80 °C until phytochemical analyses
were performed.
2.5. Determination of titratable acidity, pH, and total soluble solids
The total titratable acidity (TTA) was determined by titrating 10 mL of juice + 50
mL of distilled water with 0.1 N NaOH to pH 8.2 using a pHmeter (Micronal, Brazil) and
expressed as g of tartaric acid.100 mL-1. Measurement of the pH was done on 2 mL of
each sample using a pHmeter. The total soluble solid content (TSS) was determined on
the supernatant obtained after centrifugation at 4000g for 5 min using a refractometer
(Atago 0–32 °Brix, Japan) with correction for temperature (20 °C), and results were
expressed in °Brix according to the Association of Official Analytical Chemists methods
(AOAC, 1995). All analyses were performed in triplicate.
2.6. Color evaluation
Color measurements were performed using a colorimeter Konica Minolta (CR-
400, Japan) calibrated with a white reference tile. The coordinates L*, a* and b* were
that represent the different chromatic characteristics were measured. L* representing
the brightness, ranging from total black to total white, a * the position between green
and red and b *, the extent between blue and yellow. Based on these data, C* (chroma or
saturation), h° (hue angle or color tone) were calculated using the following equations:
C* = (a *2 + b *2 )1/2, h° = arctan (b */a*). Total color difference (ΔE*) was calculated using
the equation: Δ E *= ( Δ a *2 + Δ b *2 + Δ L *2 ) 1 / 2 . Where Δ a * = a * - a * 0 , Δ b * = b * - b * 0 ,
and subscript 0 indicates color at time zero. Measurements were performed in triplicate.
92
2.7. Determination of total phenolic content
Polyphenols extraction was adapted from Vinson et al. (2001). Briefly, 100 μL
aliquots of each juice were extracted using 500 μL of methanol 50% (methanol:water,
50:50, v:v) for soluble polyphenols (SP), and methanol 50% (methanol:water, 50:50,
v:v) acidified with 1.2 M HCl for hydrolyzable polyphenols (HP), in screw-capped vials.
The vials were placed in a water bath at 90 °C for 3h with constant shaking, cooled at
room temperature and the volume was adjusted to 1 mL with methanol. The vials were
centrifuged at 12,000 g for 5 min and the supernatants were used for the determination
of SP and HP contents using the Folin-Ciocalteu reagent, according to Karou et al.
(2005).
In microvials, 150 L of the Folin-Ciocalteu’s reagent diluted in distilled water
(50:50, v/v) was added to 60 L of either the SP or HP extract. After 5 min, 840 L of
water and 150 L of 20% anhydrous sodium carbonate solution were added and
incubated at room temperature for 30min; the absorbance was measured at 750nm in a
spectrophotometer (Zenyth, UK). Polyphenol content was calculated using a standard
curve of gallic acid (0 – 500 mg.L-1) and results were expressed as mg of gallic acid
equivalents, GAE.L-1. Analyses were performed in triplicate.
2.8. Determination of total monomeric anthocyanins content
The pH-differential methodology was used to quantify total monomeric
anthocyanins (Giusti and Wrolstad, 2001). Appropriate dilution factors for the samples
were determined by diluting them with potassium chloride buffer, pH 1.0 and
measuring the absorbance at 520nm. Aliquots of samples were diluted with both
93
potassium chloride buffer, pH 1.0, and sodium acetate buffer, pH 4.5 and the absorbance
was read at 520 (A520) and 700 nm (A700) after 15 min. Total monomeric anthocyanins
content (TA) was determined as cyanidin 3-O-glucoside equivalent (mg Cy.L-1) using as
molar extinction coefficient (ε) = 26900 L.mol−1.cm−1 and molecular weight (MW) =
449.2 g.mol-1, as follows: TA (mg.L-1) = A x MW x DF x 103 / ε x 1. Where: A = (A520 –
A700)pH1.0 – (A520- A700)pH4.5, DF = dilution factor, and 1 = pathlength (1cm). Analyses
were performed in triplicate.
2.9. Antioxidant capacity
Antioxidant capacity of the samples was evaluated by DPPH and FRAP asays. The
ability to scavenge the stable free radical DPPH was conducted according to Brand-
Williams et al. (1995), as modified by Kim et al. (2002). The absorbance was measured
at 517 nm without addition of samples and 30 min after their addition. Trolox was used
as standard and results were expressed in µmol Trolox.L-1. The FRAP (Ferric reducing
ability of plasma) assay was performed according to Pantelidis et al. (2007). FRAP
reagent was freshly prepared from 300 mM acetate buffer (pH 3.6), 20 mM ferric
chloride and 10 mM TPTZ made up in 40 mM HCl in the ratio 10:1:1. Samples (20 μL)
were previously diluted in water (80 μL) and 15 μL of this solution was added to 285 μL
of FRAP reagent. The absorbance was read at 593 nm after 30 min in the absence of
light. A calibration curve of Trolox (0.1–2 mM) was used, and results were expressed as
µmol Trolox.L-1. Analyses were performed in triplicate.
2.10. Sensory analysis
94
Sensory evaluation of steam extracted grape juice was conducted after approval
of the protocol (145/2011) by the Ethic Committee of the Hospital Universitário
Clementino Fraga Filho. Steam extracted juices were the only subjected to sensory
analysis due to their shelf stability. Inclusion criteria for participants were like grape
juice and not be intolerant to it. A panel of 50 untrained panelists, being 20 males and 30
females, aged from 18 to 64 years, participated in a hedonic evaluation of the juice.
Samples (50 mL) were served at room temperature and the panelists scored color, taste,
aroma and overall acceptability on a hedonic scale of 1 to 9 in which 1 denotes “dislike
extremely” and 9 stands for “like extremely”. Consumers were also asked demographic
questions including gender; age group; intent to purchase, measured on a 5-point scale;
and grape juice consumption habits, measured on a 4-point scale.
2.11. Microbiological stability during storage
Microbiological stability of steam extracted juices was evaluated during storage
at 0, 5, 12, 20 and 24 months. Total aerobic mesophilic counts (colony forming units
CFU/mL), molds and yeasts (CFU/mL), lactic acid bacteria (CFU/mL) and coliforms
(most probable number MPN/mL) were investigated. Analyses were conducted
according to the methodology described by the Compendium of Methods for the
Microbiological Examination of Foods (Vanderzant and Splittstoesser, 1992). Microbial
counts were made from samples of the juice serially diluted (1 x 100 to 1 x 10-3) in
peptone saline solution (1 g peptone and 8.5 g NaCl.L-1) in duplicate. Aerobic mesophilic
bacteria counts were determined by standard plate count using plate count agar after
incubation at 37 °C/48 h, molds and yeasts on potato dextrose agar medium after
incubation at 25 °C/48 h and lactic acid bacteria on Man, Rogosa and Sharpe agar
95
medium after incubation at 37 °C/24 h in microaerobic condition. Total coliform
bacteria were determined using MPN technique on Brilliant Green Lactose Broth with
Durham tubes incubated at 37 °C/24 h.
2.12. Statistical analysis
Three independent experiments were carried out and the assays were
performed in triplicate. Differences between means were analyzed by one-way analyses
of variance (ANOVA) followed by Tukey’s post hoc test to determine the significant
differences between samples using Graph Pad Prism v5 (GraphPad Software, 2009). A p
value <0.05 was considered statistically significant. To determine whether the bioactive
compounds contributed to the antioxidant capacity, Pearson’s correlation coefficients
were calculated.
3. Results and discussion
In order to evaluate the influence of time during steam extraction on some
characteristics of the grape juice, the extraction was conducted for five hours. The
highest yield of juice was obtained during the first hour (534 mL.kg-1). The volumes of
juice obtained at each 1 h interval decreased as the extraction process continued up to 5
h (138, 101, 87, 75 mL.kg-1). Bresolin et al. (2013) observed that exogenous water is
incorporated to Bordô grape juice during steam extraction for 3 h. According to the
authors it happens during the first 30 min and at 2.5 and 3 h. Our results showed that
although pH and the ratio TSS/TTA had remained stable as the extraction time was
96
prolonged, the TSS content and TTA decreased, showing the influence of the duration of
extraction on the juice quality.
Extraction time over 2h, resulted in an increase in the L*, probably due to the
lower concentration of compounds extracted. The major changes in a*, b*, C and h° were
observed from 1 to 2 h (data not shown). An increment in the hue values (h°) observed
for juices obtained from 2 to 5 h extraction indicates a color deviation of the juice from
purple-red hues to more red-orange hues. The total color differences (∆E*), calculated in
relation to the juice obtained in the first hour extraction resulted in a visually
perceivable difference since values ranged from 1.6 to 4.0 for juices collected from 2 to 5
h (Gonnet, 1999).
Variation in HP, SP and total monomeric anthocyanin contents and antioxidant
capacity during the 5 h steam extraction is shown in Figure 1. The HP content of the
fractions A remained stable from the first to the second hour, followed by a decrease
towards the end of the 5 h period. The SP content of the fractions A significantly
increased from the first to the second hour and reduced in the fourth and fifth hours.
These variations in fractions A were not enough to alter contents of HP and SP contents
in fractions B.
97
0 2 4 60
1000
2000
3000m
g E
q g
all
ic a
cid
.L-1
Extraction time (h)
0 2 4 60
500
1000
1500
2000
Extraction time (h)
mg
Eq
gall
ic a
cid
.L-1
0 2 4 60
50
100
150
200
Extraction time (h)Cyan
ind
in 3
-O-g
luco
sid
e E
q (
mg
.L-1
)
0 2 4 60
1000
2000
3000
Extraction time (h)
M
Eq
Tro
lox
0 2 4 60
1000
2000
3000
4000
5000
Extraction time (h)
M
Eq
Tro
lox
Fig.1. Variation in hydrolyzable phenolic compounds (a), soluble phenolic compounds
(b) and anthocyanins content (c), antioxidant capacity evaluated by DPPH (d) and FRAP
(e) during grape juice steam extraction. fractions A: aliquots collected in each one hour
interval of extraction, ■ fractions B: aliquots collected from the accumulated sample.
Heat degradation of anthocyanins is primarily caused by oxidation, cleavage of
covalent bonds or enhanced oxidation reactions due to thermal processing (Patras et al.,
2009). The monomeric anthocyanin content of Isabel juice was reduced as the extraction
time was extended. This decrease, which reached 89% in fraction A after 5 h extraction,
(e)
(a) (b)
(d) (c)
98
may be due to both thermal degradation and dilution caused by incorporation of water
into the juice. Wang and Xu (2007) showed that thermal (60-90 °C) degradation of
anthocyanins in blackberry (Rubus fruticosus L.) juice follows first-order reaction
kinetics during processing.
A significant increase in antioxidant capacity of juices was observed from the 1 h
to 2 h of extraction for both fractions A and B by DPPH. Although antioxidant capacity by
FRAP had increased from 1 to 2 h extraction, it was not significant. The results for SP
and antioxidant capacity, as well as, for pH and ratio SST/acidity in the second hour
extraction, indicates that the juice obtained during this time interval has potential as a
source of functional compounds. However, sensory evaluation would be needed to verify
the acceptability of the juice collected after one hour of extraction.
In order to compare juices prepared by different methods, the time used for
steam extraction was one hour. This is when the highest yield of juice was obtained and
the extraction time usually used (Cazarin, 2013). The results for juice yield and the
physicochemical analysis of the grape juices are shown in Table 2. Juices extracted by
mechanical methods had highest TSS contents whereas steam extracted juice and one
brand of industrialized juice had TSS content lower than the minimum established by
the Brazilian legislation (14°Brix) (Brasil, 2000). Other researchers found similar results
for grape juices prepared by steam extraction using grapes cv. Benitaka (Pinheiro et al.,
2009) and cv. Isabel (Rizzon and Link, 2006). In juices prepared by steam extraction
process, incorporation of water to the juice and reduction in the concentration of soluble
compounds can occur (Bresolin et al., 2013), contributing to the lower TSS values in
these juices. All grape juice samples had TTA values above the minimum established for
grape juice by the same legislation (0.41 g tartaric acid.100mL-1). The TSS/TTA ratio
99
represents the balance between the acid and sweet taste of grape juice. The values for
ratio varied between 15.5 and 32.6 for commercial grape juices and for juices obtained
by both mechanical and steam extraction. Although samples for each repetition were
acquired at the same time, in order to guarantee that samples would be uniform, these
differences may be related some heterogeneity of the raw material.
Table 2. Juice yield, pH, total soluble solids, acidity and TSS/acidity ratio of grape juices
obtained by different extraction processes and industrialized grape juices.
Red grape
juices
Juice yield* pH TSS1 TTA2 Ratio
TSS/ Acidity
Steam
Extractor
Juicer
Blender
I1
I2
I3
534 ± 24 b
679 ± 13 a
459 ± 23 d
601 ± 8 c
ND
ND
ND
3.34 ± 0.08 ab
3.38 ± 0.02 ab
3.37 ± 0.19 ab
3.22 ± 0.08 b
3.51 ± 0.02 a
3.30 ± 0.05 ab
3.46 ± 0.06 ab
12. 7 ± 0.3 c
18.1 ± 1.2 a
17.7 ± 0.4 a
15.0 ± 0.6 b
12.0 ± 0.5 c
15.9 ± 0.2 b
16.0 ± 0.3 b
0.69 ± 0.01 ab
0.89 ± 0.07 b
0.54 ± 0.01 f
0.82 ± 0.01 c
0.76 ± 0.01 d
1.17 ± 0.01 a
0.74 ± 0.04 de
15.5 ± 0.2 c
20.2 ± 0.9 b
32.6 ± 1.0 a
18.4 ± 1.1 c
15.7 ± 0.1 d
12.8 ± 0.1 e
21.4 ± 0.1 b
* Juice yield (mL.kg-1); 1 TSS: Total soluble solids (°Brix); 2 TTA: Titratable acidity (g
tartaric acid.100mL-1). I1, I2 and I3: three brands of industrialized red grape juices. Values
are expressed as means ± SD (n = 9). ND: not determined. Means in the same column
followed by different letters are significantly different (One-way ANOVA with Tukey post
hoc test, p <0.05).
100
Color is one of the most important attribute observed by the consumer as an
indicator of the quality (Waterhouse, 2005). Although a few grape varieties contain
color compounds in the pulps, the color of the red grape juice is essentially due to the
release of anthocyanins from the skins (He et al., 2010). The tonality and intensity of
color can vary according to the origin and region where the grapes are harvested, and
due to the particular technology applied for juice production (Burin et al., 2010 and
Downey et al., 2006). The perceptible and overall color impression of the juices depends
on the relative amount of red and yellow color, which is expressed as an angle of hue
(Table 3) in the CIELAB color space system. Among 78 red grape cultivars L*, a* and b*
was found to vary between 17.7 to 60.2, -18.9 to 19.6, and -0.77 to 31.8, respectively
(Liang et al., 2011). In general, color parameters of the steam extracted juices were the
most similar to industrialized juices.
The method used to extract the grape juice influenced the content of HP and SP,
total monomeric anthocyanins and antioxidant capacity (Table 4). HP comprise a
greater proportion of the polyphenols present in all grape juices (72-90%), when
compared to soluble polyphenols, probably due to the prominent presence of
hydrolysable tannins. The content of HP was variable among the juices (2727 to 3765
mg GAE.L-1). The industrialized juice I3 had the highest content of hydrolyzable
polyphenol compounds. However, there is no information on labels regarding grape
cultivars and extraction method used to prepare these juices. The mechanical extraction
methods produced juices with higher HP contents when compared to steam extracted
juice probably due to disruption of food matrix yielding greater extraction of phenolic
compounds from the seeds, which contain higher levels of phenolic compounds than
grape skin or pulp (Rockenbach et al., 2011).
101
Table 3. Colorimetric parameters of red grape juice obtained by different extraction
processes and industrialized.1
Red grape juice L* a* b* C* h°
Steam
Extractor
Juicer
Blender
I1
I2
I3
19.7 0.4 cd
24.4 1.0 b
34.0 2.2 a
25.1 1.7 b
18.9 0.3 cd
20.2 0.3 c
18.5 0.2 d
7.9 1.3 b
13.1 1.5 a
7.8 1.4 b
12.6 2.1 a
1.2 0.4 c
2.0 0.3 c
1.6 0.4 c
1.6 0.5 c
0.6 0.3 cd
9.0 1.5 a
3.3 0.8 b
0.4 0.3 d
0.6 0.3 cd
0.4 0.2 d
8.0 1.4 b
13.1 1.5 a
11.9 1.9 a
13.1 1.9 a
1.3 0.3 c
2.1 0.2 c
1.7 0.4 c
10.5 2.1 c
2.7 0.8 d
48.9 4.3 a
15.0 5.2 bc
16.5 1.9 b
16.7 0.9 b
12.1 1.1 c
1 Values are expressed as means ± SD (n = 9). I1, I2 and I3: three brands of
industrialized red grape juices. L*, a*, b*, C*, and h°: colorimetric parameters. Means in
the same column followed by different letters are significantly different (One-way
ANOVA with Tukey post hoc test, p <0.05).
Steam extracted juices showed higher SP and anthocyanins contents and higher
antioxidant capacity by both assays among the prepared juices. Average content of SP
compounds in steam extracted juice was also higher than that of the industrialized juice
I2. Heat extraction probably helped causing matrix softening and increased extractability
of compounds (Ferracane et al., 2008). Our results for SP are in agreement to total
phenolic content found by Malacrida and Mota (2005) among twelve commercial red
102
grape juices (210 to 2410 mg.L-1) and by Cazarin et al. (2013) in steam extracted juices
prepared with grapes cv. Isabel (around 800 to 1000 mg.L-1).
Table 4. Hydrolyzable and soluble phenolic contents, total anthocyanins contents and
antioxidant capacity evaluated by DPPH and FRAP assays of red grape juices produced
by small scale extraction processes and industrialized grape juices.
Red grape
juice
HP1
mg GAE.L-1
SP2
mg GAE.L-1
TA3
mg Cy.L-1
DPPH4
µmol Trolox.L-1
FRAP5
µmol Trolox.L-1
Steam
Extractor
Juicer
Blender
I1
I2
I3
2727 ± 94 d
3514 ± 241 b
3477 ± 63 b
3128 ± 182 c
3474 ± 30 b
3216 ± 18 c
3765 ± 35 a
1073 ± 58 c
497 ± 63 e
195 ± 23 g
361 ± 7 f
1510 ± 14 a
972 ± 14 d
1358 ± 12 b
138 ± 22 b
65 ± 15 c
3 ± 1 e
42 ± 7 d
58 ± 8 cd
56 ± 6 cd
232 ± 10 a
2560 ± 239 c
1221 ± 180 d
454 ± 32 f
756 ± 77 e
3692 ± 10 a
2541 ± 30 c
3400 ± 27 b
4539 ± 456 c
2058 ± 160 e
492 ± 66 g
1220 ± 64 f
6272 ± 55 a
3231 ± 87 d
5545 ± 156 b
1 Hydrolyzable phenolics: HP; 2 Soluble phenolics: SP; 3 Total anthocyanins: TA; 4
Antioxidant capacity: DPPH; 5 Reducing power: FRAP. I1, I2 and I3: codes for three brands
of industrialized red grape juices.
Values are expressed as means ± SD (n = 9). Means in the same column followed by
different letters are significantly different (p < 0.05).
Anthocyanins are responsible for black, red and purple colors in grapes, mostly
accumulated in the skins (Yang et al., 2009). The content of total monomeric
103
anthocyanins found in the steam extracted juice (138 mg Cy.L-1) was similar to values
observed in another study using steam extracted juice from Isabel grape which varied
from around 45 to 130 mg.L-1 during different seasons (Cazarin et al., 2013). Although
heat has been shown to degrade anthocyanins (Patras et al., 2010 and Wang and Xu,
2007), our results demonstrated that hot extraction resulted in juices with higher
anthocyanins contents compared to cold extraction. Other studies also demonstrate that
heat helps extracting phenolic compounds during grape juice processing (Fuleki and
Ricardo-Da-Silva, 2003). Threlfall et al. (2005) also observed that the anthocyanin
content of juice obtained from heated Black Beauty and Sunbelt grape musts were
higher than those obtained from non-heated musts. As a result of higher SP and
anthocyanins contents steam extracted juices had more than twice the antioxidant
capacity by DPPH and FRAP assays when compared to juices prepared by mechanical
extraction.
The sensory attributes of grape juice largely depends on the balance among the
sugars, acids, phenolic compounds and color components (Sims and Morris, 1987) and
they need to be taken into account when launching a new product in the market. Results
of sensory evaluation revealed that the steam extracted juice had good overall
acceptability (8.0 ± 1.0). It received 85% of best scores in hedonic scale (8 = “like very
much” and 9 = “like extremely”) among people that are used to consume grape juice and
68% among those that are not used to consume this juice. Means of the consumers’
hedonic rating on attributes color, taste and aroma were 8.4 ± 0.9, 7.7 ± 1.3 and 7.8 ± 1.2,
respectively. Considering the importance of color as attribute of quality, the highest
score on color confirms that steam extraction of Isabel grapes can provide juices with
good market acceptance. In another study, sensory evaluation of Isabel grape juice using
104
the same process and SST adjusted to 15 °Brix with sucrose showed satisfactory
acceptance but lower ratings (overall acceptability: 6.7; color 7.4; aroma 6.8; taste 6.6)
(Borges et al., 2011). Sensory perceptions are associated with food quality, so they have
great influence in consumer acceptance and purchase intent. In our study 88% of the
panelists stated they would purchase the products if commercially available.
Some processed grape juices have a 24 months shelf life, according to their labels.
Our results showed that the steam extracted juice remained microbiologically stable
during this period. The estimated counts of aerobic mesophilic bacteria, molds and
yeasts and lactic acid bacteria were less than 1.0 x 100 UFC.mL-1 and total coliforms were
not detected. These results show that steam extraction followed by hot-filling into sterile
bottles with minimum head space was efficient in maintaining microbial stability of
juices throughout the storage period.
During the first five months of storage, HP and SP contents of the steam extracted
juice reduced around 14 and 27%, respectively, and thereafter, the content of these
compounds remained stable for up to 24 months (< 4% losses) (Table 5). In other study,
concentrated Isabel juice of grapes showed a 19% decrease in total phenolic content
during 10 months storage despite being under refrigeration (5 °C) and in the absence of
light (Gollücke et al., 2009).
Total monomeric anthocyanins content decreased 83% after five months and the
storage for 12 months resulted in the loss of up to 97% of these compounds. The
stability of anthocyanins during storage is reported to be affected by several factors such
as types of glycosylation and acylation (He and Giusti, 2010), pH environment, juice
matrix, concentration, temperature, light, oxygen, and the presence of enzymes, and
flavonoids (He and Giusti, 2010; Hellström et al., 2013 and Patras et al., 2010).
105
Table 5. Stability of hydrolyzable phenolics, soluble phenolics, total anthocyanins and
antioxidant capacity of red grape juice obtained by steam extraction during storage.
Storage time
(months)
HP1
mg GAE.L-1
SP2
mg GAE.L-1
TA3
mg Cy.L-1
FRAP4
µmol Trolox.L-1
DPPH5
µmol Trolox.L-1
0
5
12
20
24
3097 ± 268 a
2694 ± 154 b
2683 ± 134 b
2724 ± 250 b
2592 ± 107 b
1465 ± 202 a
1071 ± 83 b
1106 ± 124 b
1051 ± 145 b
1063 ± 88 b
235 ± 8 a
38 ± 18 b
7 ± 7 c
8 ± 9 c
5 ± 3 c
7050 ± 907 a
5554 ± 409 b
5287 ± 707 b
5198 ± 492 b
5618 ± 315 b
4802 ± 772 a
4457 ± 374 a
4689 ± 334 a
4551 ± 526 a
4681 ± 197 a
1Hydrolyzable phenolics: HP; 2Soluble phenolics: SP; 3Total anthocyanins: TA;
4FRAP, µM Trolox; 5DPPH µM Trolox. Values, are expressed as means ± SD (n = 9). Means
in the same column followed by different letters are significantly different (p < 0.05).
Studies related to the influence of the temperature during storage on
anthocyanins stability are controversial. Some studies show that temperature plays
critical role for anthocyanin loss during storage, with cold storage resulting in much
lower degradation of these compounds (Hellström et al., 2013 and Patras et al., 2010).
However, other studies demonstrated that anthocyanins suffer significant losses even
under refrigeration. Anthocyanins of blueberry juices degraded about 83% during
refrigeration for 10 d with all anthocyanins showing practically the same degradation
rate (Reque et al., 2014). Grape pomace was found to retain only 52% anthocyanins
after storage during 16 days at 4 °C (Augustine et al., 2013). Use of vacuum-closed
106
packages and heat treatment to inactivate enzymes has been suggested as preventative
measures against the loss of anthocyanins (Reque et al., 2014). However these
conditions did not avoid anthocyanins degradation in the present study.
Antioxidant capacity evaluated by FRAP assay reduced 21% after the first five
months and remained stable from five to 24 months while the antioxidant capacity
evaluated by DPPH assay remained stable during all storage period. Hager et al. (2008)
did not find significant loss in the antioxidant capacity of blackberry juices stored at 25
°C for 6 months. Similarly, concentrated Isabel grape juices stored under refrigeration
for 10 months retained 86% of antioxidant capacity (Gollücke et al., 2009). Some studies
show that antioxidant capacity is retained by the polymers derived from anthocyanin
degradation formed during storage resulting in minimal changes in antioxidant capacity
during storage (Hager et al., 2008 and Reque et al., 2014).
High positive correlations were found between antioxidant capacity evaluated by
FRAP and DPPH assays (r = 0.955, P<0.0001). Thus monitoring the antioxidant capacity
of phenolic compounds by their ability to scavenge DPPH radical was demonstrated to
give good prediction of their reduction power. When the antioxidant capacity was
measured with the FRAP and DPPH assays, a high positive correlation was found
between them and the content of soluble phenolics (r = 0.931 and 0.951, respectively
and P<0.0001). There was no statistical significance between the other correlations: HP
and SP, TA, FRAP or DPPH and between TA and FRAP or DPPH.
107
4. Conclusion
In our study, steam extraction of Isabel grape juice resulted in higher soluble
polyphenols, anthocyanins and antioxidant capacity when compared to juices obtained
by cold extraction. Steam extraction also provided a product with good sensory
acceptance. As the steam extraction was extended, the contents of TSS and anthocyanin
were reduced and antioxidant capacity increased in the juices. Changes in
phytochemical compounds and antioxidant capacity occurred mainly throughout the
first five months of storage, remaining stable until 24 months except for anthocyanins
content that reduced drastically up to 12 months. No microbiological alteration was
observed during the 24 months storage period. Processing and storage conditions of
fruits have to be taken into account in order to better estimate intake of phytochemicals.
Acknowledgements
This work was supported by Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa
do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) and Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq).
There are no conflicts of interest in this study.
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112
Anexo 2. Effect of steam extraction on anthocyanin profile of Isabel grape (Vitis
labrusca) juice and pomace
Maria Lucia Mendes Lopes a,*
aInstituto de Nutrição Josué de Castro, Universidade Federal do Rio de Janeiro (INJC-
UFRJ). Av. Carlos Chagas Filho, 373, 21941-902, Ilha do Fundão, Rio de Janeiro - RJ,
Brazil.
*Corresponding author: Phone: 55 21 39386449; Fax: +55 21 22808343; e-mail:
113
Abstract
Anthocyanins are responsible for the color of grape juices and possess health
promoting properties. However, thermal processing may alter phenolic content of
these compounds in grape products. Therefore, the aim of this study was to assess
content and profile of anthocyanins, total phenolic compounds and antioxidant
capacity in red grape cv. Isabel, its skin, pulp and juice obtained by steam extraction,
as well as in the byproduct obtained after juice processing (pomace). The
anthocyanins were analyzed by high-performance liquid chromatography with
photodiode array detection (HPLC–DAD), HPLC-electrospray ionization tandem mass
spectrometry (ESI–MS/MS) and by pH differential method. Phenolic content was
determined using Folin Ciocalteu reagent and antioxidant capacity as free radical
scavenging activity (DPPH assay) and ferric reducing ability of plasma (FRAP assay).
In grapes cv. Isabel, the vast majority of anthocyanins are present in the skin. This
fraction had the highest content of this compound among samples. A total of 15 major
anthocyanins were identified and malvidin derivatives dominated in all samples. In
contrast to other anthocyanins, the content of delphinidin and petunidin derivatives
was higher in juice and in pomace when compared to skin. Pomace had the highest
content of total phenolic compounds and antioxidant capacity. The results showed
that juice processing led to change in the anthocyanin profile.
Keywords
Grape juice, Anthocyanin profile, Antioxidant capacity, Grape residue, Steam
extraction, Pomace, Skin.
114
1. Introduction
Grapes are among the most consumed fruits in the world and are rich in
phenolic compounds which have been reported to be important to human health
(Lago-Vanzela et al., 2011 and Xia et al., 2010). Phenolic compounds have been
described in the literature mainly for wine grapes (Vitis vinifera). However, American
cultivars and their hybrids with V. vinifera cultivars are also rich in phenolic
compounds. These cultivars represent more than 80% of the volume of grapes
processed in Brazil (IBRAVIN, 2014) being Isabel, also named Isabella, a black skin
seeded grape, one of the most commonly used to elaborate juices on their own or in
blends with other cultivars (Cazarin et al., 2013 and Nixdorf and Hermosín-Gutiérrez,
2010).
Steam extraction is used to prepare red grape juices in small- and medium-
scale (Bresolin et al., 2013 and Häkkinen et al., 2000) and has meaningful economic
and social importance for grape growers and their families in Brazil (Bresolin et al.,
2013).
Red, purple and black grapes are rich in anthocyanins, which are present
mainly in the skins (Lago-Vanzela et al., 2011). Delphinidin, cyanidin, petunidin,
peonidin, and malvidin are the main antocyanidins in red grapes. Pelargonidin was
also reported to be present in some grape varieties (J.-J. He et al., 2010 and Zhao et al.,
2010). They are either monoglucosylated at the 3-OH, or diglucosylated at both the 3-
and 5-OH positions. The glucose residue can be linked to an acetyl, p-coumaroyl, or
caffeoyl group (Flamini, 2013).
115
Anthocyanins are considered potential substitutes for synthetic colorants
owing to their bright, attractive colors and water solubility, which allow their
incorporation into a variety of food systems (Bordignon-Luiz et al., 2007). Their use
as food coloring responds a growing demand for colorants from natural sources in
the face of increasing public concern about synthetic food dyes. The interest in
anthocyanins has also intensified because of their potential health benefits related to
its antioxidant and antimicrobial activity, possible role in hypertension prevention,
risk reduction of coronary heart disease, cancer and stroke (He and Giusti, 2010) and
neuroprotective effects (de Pascual-Teresa, 2014).
Anthocyanins are labile compounds and their stability is variable depending
on factors such as their structure, pH, concentration, storage temperature, light,
oxygen, and the presence of enzymes, flavonoids, proteins and metal ions (Rein and
Heinonen, 2004). Methods and treatments used for fruit juice production may affect
anthocyanins and other compounds in the final product (Fuleki and Ricardo-Da-Silva,
2003; Patras et al., 2010 and Threlfall et al., 2005).
Grape pomace, the residue of wine and grape industries, consists
predominantly of skins and seeds that remains after grapes processing and are rich in
phenolic compounds due to their incomplete extraction during processing
(Kammerer et al., 2004 and Rockenbach et al., 2011). It has been considered a
potential source of phenolic compounds. The utilization of the residue or its
components could have economic benefits to producers and an important
environmental impact in waste reduction (Ayala-Zavala et al., 2011). Studies have
been focusing mainly pomace resulting from winemaking (Kammerer et al., 2004;
Rockenbach et al., 2011; Rubilar et al., 2007 and Yu and Ahmedna, 2013). However, as
116
grape juice production has increased during the past years in Brazil, studies
regarding pomace resulting from juice processing are needed.
Although the literature abounds with reports about phenolic composition and
antioxidant capacity of wine or juice samples, there are very few papers that report
data about grape, skin, juice and pomace from the same sample. Knowledge on the
phenolic composition of these fractions may be useful in the assessment of both the
grapes industry potential and their potential for biological activity.
The aim of this study was to assess the anthocyanins profile, total phenolic
compounds, total anthocyanins and in vitro antioxidant capacity of grape cv. Isabel, its
skin and pulp, as well as grape juice produced by steam extraction and the pomace
obtained after juice processing.
2. Materials and Methods
2.1. Chemical reagents
Folin–Ciocalteau reagent, 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-
carboxylicacid (Trolox), and anhydrous sodium carbonate were purchased from
Merck (Darmstadt, Germany). Gallic acid, 2,4,6-tris (2-pyridyl)-s-tri-azine (TPTZ), 2,2-
di-phenyl-1-picrylhydrazil (DPPH), and formic acid were from Sigma Aldrich (St.
Louis, MO, USA). Ferric chloride hexahydrate, potassium chloride, and sodium acetate
were from Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ, USA). Optima-grade solvents were used for
all analyses involving mass spectrometry and HPLC-grade solvents were used for all
other analyses (Fisher Scientific; Pittsburgh, PA, USA).
117
2.2. Sample preparation
Grapes (Vitis labrusca) belonging to cv. Isabel were harvested in Rio Grande do
Sul, Brazil, at commercial maturity and were acquired at a market center in Rio de
Janeiro, Brazil. Around 15 kg of grapes were sanitized, split from bunches and used to
process the juice using a steam juicer, in three repetitions. Samples of whole berries,
juice and pomace were collected. Three batches of 100 g of grapes were used to
manually separate the skin (yield, 40.2% of fresh weight fruit), pulp (yield, 56.3% of
fresh weight fruit) and seeds (yield, 3.5% of fresh weight fruit) in an environment
protected from light and under refrigeration to prevent oxidation. All samples were
freeze dried and kept at -80 °C for subsequent analyzes. Berries moisture was
determined after drying the grapes at 105 °C until constant weight (83.95 ± 0.67
g.100 g-1).
Comparative extractions of anthocyanins were tested with methanol:formic
acid (95:5, v:v), methanol:water (50:50, v:v) and methanol:water:formic acid
(70:25:5, v:v:v) in order to obtain the highest yields. Extraction with
methanol:water:formic acid (70:25:5, v:v:v) yielded around 50% more anthocyanins
than methanol:formic acid (95:5, v:v) and 120% more than methanol:water (50:50,
v:v) (data not shown).
Lyophilized samples (approximately 1 g) were crushed in liquid nitrogen and
extracted in 10 ml methanol:water:formic acid 70:25:5, v:v:v solution. After vortexing
for 30 s the extraction tubes were sonicated (Fisher Scientific, NJ, USA) for 5 min in a
dark environment and centrifuged 10,000 rpm for 10 min. Supernatant was collected
118
and residues were re-extracted three times. The extracts were combined and the
volume was completed to 50 mL in a volumetric flask with the extraction solution.
Three independent extractions were carried out. Extracts were kept at -80 °C until
they were used for spectrophotometric analyses.
2.3. HPLC and LC-ESI-MS/MS analyzes
Identification of anthocyanins was performed in a Waters 2695 HPLC with a
Waters 996 photodiode array detector (Waters, Milford, MA, USA) combined with a
Waters Q-Tof Premier (Micromass MS Technologies, Manchester, UK). Extracts were
dried in a Speedvac Concentrator (Savant SPD131 DDA, Thermo scientific, USA), and
the residue was dissolved in a water:methanol:formic acid (80:18:2, v:v:v) solution
and filtered through a 0.45 µm polytetrafluoroethylene (PTFE) syringe filter before
injection. Separation was carried out on a Gemini C6 phenyl column (250 mm x 4.6
mm, 5 μm, Phenomenex) (Torrance, USA) kept at 35 °C. The mobile phase consisted
of a gradient of 5% aqueous formic acid (eluent A) and 5% formic acid in acetonitrile
(eluent B). Prior to injection, the column was equilibrated with 0%B. After injection of
sample, this proportion was increased to 30%B in 30 min, 95%B in 35 min, this
proportion was remained until 39 min, and decreased to 0% from 39.01 to 48 min.
Between injections, 20 min intervals were used to re-equilibrate the column. The flow
rate was 1 mL/min. Mass spectrometry was performed on a quadrupole/time-of-
flight mass spectrometer (QTof Premier, Micromass Limited, Manchester, UK)
equipped with an electrospray ionization (ESI) source. The MS analysis was
performed in positive and negative ion modes. Capillary voltage was 3.2 kV for
positive mode, 2.8 kV for negative, cone voltage of 35 V, ion guide at 1 V, source
119
temperature of 100 °C, and nitrogen desolvation gas temperature of 400 °C flowing at
600 L/h. For MS/MS analysis, the same instrumental parameters were used except
that collision energy was set to 25 eV.
Quantification of anthocyanins in all samples was carried out using an Agilent
1100 series (Agilent, Waldbronn, Germany) equipped with an autosampler/injector
and a photodiode array detector. Chromatographic separation was performed with
the same column and method as those in the identification step. Samples were
injected with a volume of 10 μL and spectra were scanned from 280 to 600 nm. The
content of anthocyanins was calculated from the total area of the peaks obtained in
the chromatograms of five-point calibration curves obtained with cyanidin 3-O-
glucoside recorded at 520 nm.
2.4. Quantification of total phenolics and total monomeric anthocyanins
The total phenolics content was determined according to Waterhouse (2005).
The sample extracts were diluted to the appropriate concentration for analysis, mixed
with diluted Folin-Ciocalteu reagent and 20% sodium carbonate. Absorbance of the
blue-coloured solution was recorded at 750 nm after incubation for 2 h at room
temperature. The results were expressed as mg of gallic acid equivalents (GAE) per
kilogram or liter of fresh weight, using the equation obtained for the standard curve
of gallic acid (0 to 750 mg.L-1).
The pH-differential methodology was used to quantify total monomeric
anthocyanins (Giusti and Wrolstad, 2001). Appropriate dilution factor for the extracts
was determined by diluting them with potassium chloride buffer, pH 1.0 and
measuring the absorbance at the 520 nm. Extracts were diluted according previously
120
determined dilution factor with both potassium chloride buffer, pH 1.0, and sodium
acetate buffer, pH 4.5. Absorbance of each dilution was read after 15 min at the 520
(A520) and 700 nm (A700) on a Shimadzu UV visible spectrophotometer (UV 160 U,
Kyoto, Japan). For comparison purposes, pigment content was calculated as cyanidin
3-O-glucoside equivalent per kilogram (mg cy.kg-1) using an extinction coefficient (ε)
of 26,900 L.mol−1.cm−1 and molecular weight (MW) of 449.2 g.mol-1, as follows: TA
(mg.L-1) = (A × MW × DF × 103)/(ε x 1), where: A = (A520 – A700)pH1.0 – (A520- A700)pH4.5;
DF = dilution factor; 1 = pathlength (1cm). Measurements were replicated three
times.
2.5. Determination of antioxidant capacity
The antioxidant capacity was determined as free radical scavenging activity
(DPPH assay) and ferric reducing antioxidant power (FRAP assay). The ability to
scavenge the stable free radical DPPH was determined according to Brand-Williams,
Cuvelier, and Berset (1995), as modified by (Kim et al., 2002). Briefly, 2.9 mL of 100
µM of DPPH dissolved in 80% aqueous methanol were added in duplicate to 100 µL of
water (control), and 100 µL of the extracts or 100 µL of Trolox standard solutions (0
to 1000 µmol.L-1). The absorbance was measured at 517 nm before addition of
samples and after 30 min. The results were expressed in µmol Trolox equivalents
(µmol TE)/kg or L of fresh sample.
The reducing capability of the extracts was measured as ferric reducing ability
of plasma (FRAP) (Benzie and Strain, 1996). In this assay changes in color caused by
the ability of antioxidant to reduce ferric tripyridyltriazine complex (Fe+3-TPTZ) to
ferrous complex (Fe+2-TPTZ) at low pH are measured. Briefly, 90 µL of the extracts or
121
90 µL of Trolox standard solutions (0 to 1000 μmol.L-1) were added to 2.7 mL of FRAP
reagent freshly prepared by mixing 300 mM acetate buffer, pH 3.6, 10 mM TPTZ in 40
mM HCl and 20 mM ferric chloride at a ratio of 10:1:1. The absorbance was read at
593 nm after 30 min in the absence of light. The extracts were adequately diluted to
fit within the linearity range. The results were expressed as μmol TE.kg-1 or mol
TE.L-1. Analyses were carried out in duplicates for each repetition.
2.6. Statistical Analysis
Three independent experiments were carried out. Data were subjected to
analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey’s post hoc test to determine the
significant differences between samples (p< 0.05). Quantitative data are presented as
mean values with the respective standard deviation. Analyzes were carried out with
Graphpad Prism 5.0 software (CA, USA).
3. Results and Discussion
Steam extraction is reported to inactivate enzymes, pasteurize and exclude
oxygen during extraction, providing unusual good color and flavor retention to the
juice produced (Bates et al., 2001). Juices obtained by steam extraction in laboratory
scale yields 534 ± 23 mL of juice / kg of grape. Mean of pomace obtained after juice
extraction corresponded to 430± 31 g/ kg of grape.
Total anthocyanin, total phenolic compounds, and antioxidant capacity of
whole grape, pulp, skin, juice and pomace are presented in Table 1. Anthocyanins in
122
Isabel grape are almost exclusively present in the skin. This grape fraction had the
highest content of this compound among all samples analyzed. It is important to
consider that factors as environment and agricultural practices influence the content
of phenolic compounds in grape berry (Teixeira et al., 2013). In other studies
anthocyanins content ranged from 69 to 151 mg.kg-1 of fresh weight grapes in seven
table grape cultivars (Cantos et al., 2002) and 128 to 1118 mg.kg-1 among V. vinifera
and V. labrusca grapes (Abe et al., 2007). Isabel grape skin was reported to contain
821 mg cianidin.kg-1 (Soares et al., 2008).
Although heat treatments during juice processing has been shown to degrade
anthocyanins (Patras et al., 2010; Wang and Xu, 2007) they are also reported to help
extracting these compounds contributing to improve the color of the products (Fuleki
and Ricardo-Da-Silva, 2003; Threlfall et al., 2005). Our results show that juice
obtained by steam extraction retained substantial amount of anthocyanins. In other
study, anthocyanins content of Isabel grape juice produced by steam extraction in two
different seasons were 44.3 ± 2.0 and 129.5 ± 2.8 mg cianidin.L-1 (Cazarin et al., 2013).
Among 12 brands of commercial red grape juices, athocyanins content varied
between 1.2 to 66.8 mg malvidin.L-1 (Malacrida and Mota, 2005). However, grape
varieties and juice processing methods are not described on juice label.
Pomace had the highest content of total phenolic compounds (3096 mg
GAE.kg-1). The content of these compounds was also higher in grape juice when
compared to the whole grapes. The values obtained in this study for phenolic
compounds were similar to those found by Soares et al. (2008) in Isabel skin (1968
mg GAE.kg-1). However, when compared to those reported by Santos et al. (2011),
they were 25% lower in grape skin (2460 mg GAE.kg-1) and 46% higher in pulp (110
123
mg GAE.kg-1). As skin is the edible grape fraction with higher content of phenolic
compounds, the consumption of unpeeled grapes should be stimulated. A serving of
unpeeled Isabel grapes (200 g) could provide around 200 mg of total phenolics. The
total phenolic content in commercial red grape juices from Spain varied between 705
and 1170 mg GAE.kg-1 (Dávalos et al., 2005). Red grape juices from Brazil had
phenolic content between 210 and 2410 mg.L-1 (Malacrida and Mota, 2005).
Table 1. Total monomeric anthocyanin, total phenolic compounds, and antioxidant
capacity of whole grape, grape fractions and grape products.
Sample Total Anthocyanin
(mg cy.kg-1 or
mg cy.L-1)
Total
Phenolics
(mg GAE.kg-1
or mg GAE.L-1)
DPPH
(mol TE.kg-1 or
(mol TE.L-1)
FRAP
(mol TE.kg-1 or
(mol TE.L-1)
Grape 196.8 ± 13.0 bc 1031 ± 205 d 5533 ± 809 cd 4959 ± 533 c
Skin 509.2 ± 92.5 a 1823 ± 146 b 7824 ± 1459 bc 8275 ± 604 b
Pulp 0.1 ± 1.0 c 161 ± 106 e 2808 ± 726 d 638 ± 85 d
Juice 236.2 ± 40.9 b 1485 ± 362 c 8943 ± 326 b 7833 ± 426 b
Pomace 276.1 ± 45.0 b 3096 ± 308 a 14050 ± 2068 a 15190 ± 1724 a
Values are expressed as means ± SD (n = 9). Means in the same column followed by
different letters are significantly different (p <0.05).
Phenolic compounds can act in synergy, antagonism or can independently
affect the total activity of mixtures (Iacopini et al., 2008). The beneficial health effects
related to grape products consumption is mainly associated with the antioxidant
124
activity of the phenolic compounds (Xia et al., 2010 and Yadav et al., 2009). Pomace
showed the highest antioxidant capacity by DPPH and FRAP assays among samples,
being around three times the values observed in the grapes and 1.5 to 2 times those
observed in the juice. This result may be due to the presence of compounds that were
not extracted by steam and to the loss of water caused by processing. Pulp had the
lowest antioxidant capacity when compared to the other samples. In other study, the
antioxidant capacity evaluated by DPPH was not detected in Isabel pulp (Santos et al.,
2011).
Grape pomace resulting from winery industry has been shown to contain
substantial amount ofphenolic compounds with potential to be used in the food
industry as antioxidants, antimicrobials, flavoring and colorants (Kammerer et al.,
2004 and Rockenbach et al., 2011; Yu and Ahmedna, 2013). Our results showed that
Isabel grape pomace resulting from juice production by steam extraction also
retained substantial amount of these compounds and may also be used as source of
phenolic compounds or as food ingredient.
A typical 520 nm chromatogram of Isabel juice anthocyanins is shown in
Figure 1. The identification of individual anthocyanins were accomplished by
comparing their HPLC order of elution and UV-visible spectral characteristics to
previous literature and confirmed by molecular masses (m/z), and fragmentation
pattern (Table 2) (Favretto and Flamini, 2000 and Giusti et al., 1999). Peak 1 was not
detected in whole grape sample. For the other samples, a total of 15 anthocyanins
were identified and, although thirteen major peaks were visible, mass spectrometry
analysis revealed that peaks 2 and 9 corresponded to two structurally different
coeluting anthocyanins.
125
= 520nm Time, min
Fig. 1. HPLC-DAD Chromatogram at =520nm of anthocyanins in grape juice.
The elution order of anthocyanins in reverse phase was related to their
polarity, the more polar compounds eluting first. Polarity is directed related to the
degree of hydroxylation, methylation and conjugation of anthocyanidins. Anthocyanin
diglucosides are more polar than monoglucosides and non-acylated are more polar
than corresponding acylated compounds (Hebrero et al., 1989). Further structural
information was obtained from anthocyanin spectroscopic data. Anthocyanins whose
hydroxyl groups at C-5 position were not glycosylated showed a shoulder around 440
nm. This characteristic permitted differentiation between the 3-monoglucosides and
3,5-diglucosides (McCallum et al., 2007). Low absorbance in the 310–360 nm region,
suggests that anthocyanins are not acylated with cinnamic acids (Waterhouse, 2005).
126
Table 2. LC-ESI-MS/MS data of anthocyanins extracted from Isabel grape, skin, juice
and pomace.
Peak
number
Retention
time
min
[M]+
m/z
MS/MS fragments
m/z
Neutral Loss
Da
Anthocyanins
1 15.75 465 303 162 Dp-g
2 17.26 + 17.28 625 + 449 463, 301 + 287 162, 324 + 162 Pn3,5-g+ Cy-g
3 17.73 655 493, 331 162, 324 Mv 3,5-g
4 18.18 479 317 162 Pt-g
5 19.75 463 301 162 Pn-g
6 20.35 493 331 162 Mv-g
7 25.7 535 331 204 Mv-ac-g
8 25.87 611 303 308 Dp-cou-g
9 26.87 + 26.96 771 + 801 609, 301 + 639, 331 162, 470 + 162, 470 Pn-470 + Mv-470
10 27.35 595 287 308 Cy-cou-g
11 27.76 625 317 308 Pt-cou-g
12 29.38 609 301 308 Pn-cou-g
13 29.58 639 331 308 Mv-cou-g
Abbreviations: Dp, delphinidin; Pn, peonidin; Cy, cyanidin; Mv, malvidin; Pt,
petunidin; g, glucoside; ac, acetyl; cou, coumaroyl. Peak numbers correspond to those
shown in the chromatogram reported in Fig. 1.
ESI ionization method is known to produce, under positive mode, protonated
molecules with null fragmentation, so the molecular masses or the compounds are
inferred from the ESI spectrum of each fraction (Favretto and Flamini, 2000). LC-ESI-
MS/MS allowed the identification of individual compounds, based on the ratio of mass
127
to charge (m/z) of the positively charged molecular ion ([M - H]+) and the MS2
fragmentation (Table 2). Five of the most widespread anthocyanidins, namely,
delphinidin (m/z 303), cyanidin (m/z 287), peonidin (m/z 301), petunidin (m/z 317)
and malvidin (m/z 331) were found in the samples. Although pelargonidin 3-
glucoside has also been found in some non-vinifera or hybrid grape cultivars (Lima et
al., 2014; Wang et al., 2003) it was not detected in any of the samples analyzed. In
spite of some of the aforementioned anthocyanins coeluted under the
chromatographic conditions applied, it was possible to identify the majority of
compounds based on fragmentation data (De Rosso et al., 2012 and Flamini, 2013).
Anthocyanins in Isabel grape are present as 3-glucosides and 3,5-diglucosides
anthocyanidins in acylated and non-acylated forms. Hybrid grapes are characterized
by the presence of anthocyanin 3,5-O-diglucoside contents, which are practically
absent in grapes V. vinifera. The presence of 3,5-O-diglucoside anthocyanins may be
used to distinguish between V. vinifera and hybrid grape varieties (Flamini 2013). The
fragmentation patterns of monoglucosilated anthocyanins contain two signals, the
original M+ molecular ion and the fragment [M − 162]+ resulting from the elimination
of glucose. The fragmentation patterns obtained for diglucoside derivatives had three
signals, the original M+ molecular ion and the fragments [M − 162]+ and [M − 324]+
resulted from the loss of diglucoside (De Rosso et al., 2012). Besides 3-glucosides and
3,5-diglucosides, 3-acetyl glucosides ([M -204]+) and 3-p-coumaroylglucosides ([M-
308]+) were also present. The presence of [M-470]+ probably refers to 3-p-coumaroyl
diglucosides (diglucoside 324 Da + p-coumaric acid 146 Da) (Nixdorf and Hermosín-
Gutiérrez, 2010 and Wu and Prior, 2005).
128
Anthocyanin profile is shown to be related to color, an important
characteristic of quality of grape products (F. He et al., 2010; He and Giusti, 2010 and
Tiwari et al., 2009), to the stability during storage (Boido et al., 2006) as well as to
consumer’s health (de Pascual-Teresa, 2014). The average contents of major
anthocyanins in Isabel grape, skin, juice and pomace are presented in Table 3.
The color of cyanidin-3-O-glucoside and delphinidin-3-O-glucoside greatly
depends on the number of hydroxyl groups on the B-ring. The greater the number of
hydroxyl groups, the stronger the blue hue (He and Giusti, 2010). Metylation of
hydroxyl-groups in the anthocyanin B-ring has a slight reddening effect on the color
of anthocyanins (J.-J. He et al., 2010). Anthocyanins methylated on the B-ring include
petunidin, peonidin, and malvidin derivatives. Glycosylation and acylation are
reported to improve anthocyanin stability. However there is inconsistency related to
the effect of methylation of the aglycone on pigment stability (Hellström et al., 2013;
Mazza and Brouillard, 1987 and Rein, 2005). Structural differences in anthocyanins
have also an impact on their interaction with molecular pathways that are involved in
their potential health effects. More specifically, mechanisms related to the
inflammatory response, endothelial function, fatty acid metabolism or glucose
metabolism and their interaction with microflora (de Pascual-Teresa, 2014).
129
Table 3. Major anthocyanin average contents in Isabel grape, skin, juice and pomace.
Anthocyanins Grape Skin Juice Pomace
mgEq Cy.Kg-1 or L-1 ± SD
Dp-g ND 1.51 ± 0.64 11.10 ± 2.71 10.24 ± 0.24
Pn 3,5-g+ Cy-g 4.04 ± 0.26 14.48 ± 1.14 5.94 ± 1.58 5.39 ± 0.07
Mv 3,5-g 6.12 ± 0.71 21.42 ± 2.08 11.92 ± 3.83 10.07 ± 1.43
Pt-g 0.17 ± 0.14 2.78 ± 1.63 13.04 ± 2.84 11.41 ± 0.42
Pn-g 9.69 ± 0.63 34.11 ± 7.02 14.94 ± 3.22 13.71 ± 0.78
Mv-g 37.86 ± 1.46 136.22 ± 18.95 77.77 ± 17.02 65.93 ± 4.83
Mv-ac-g 0.96 ± 0.06 4.68 ± 1.52 1.87 ± 1.01 1.93 ± 0.50
Dp-cou-g 0.31 ± 0.44 2.25 ± 1.19 2.82 ± 1.05 2.99 ± 0.36
Pn-470 + Mv-470 1.58 ± 0.12 8.74 ± 1.18 4.76 ± 1.58 4.83 ± 0.74
Cy-cou-g 0.19 ± 0.04 3.10 ± 0.86 0.84 ± 0.04 1.11 ± 0.12
Pt-cou-g 0.32 ± 0.07 5.37 ± 1.63 5.10 ± 1.10 5.33 ± 0.19
Pn-cou-g 5.01 ± 0.54 25.69 ± 2.15 7.76 ± 1.17 8.09 ± 0.41
Mv-cou-g 14.35 ± 0.62 71.17 ± 6.14 30.24 ± 6.84 30.16 ± 2.29
Abbreviations: Dp, delphinidin; Pn, peonidin; Cy, cyanidin; Mv, malvidin; Pt,
petunidin; g, glucoside; ac, acetyl; cou, coumaroyl. ND, not detected.
Evaluating total peak area, malvidin derivatives were the major anthocyanins
in all fractions (63 to 73%), followed by peonidin derivatives (12 to 18%) (Figure 2).
These results are in accordance to those found by (Flamini and Tomasi, 2000) who
showed that malvidin derivatives are the anthocyanins predominant in skin of V.
labrusca grapes, followed by peonidin-type anthocyanins. Malvidin-3-O-glucoside is
130
also the major anthocyanin present in V. vinifera grapes along with its acylated forms
(Teixeira et al., 2013). Juice and pomace showed similar anthocyanin profiles.
Interestingly, unlike the other anthocyanins that were present in greater quantities in
the grape skin, the amount of delphinidin and petunidin derivatives was higher in
juice and pomace samples. The proportion of these anthocyanins in whole grape and
skin was, on average, 0.9% and 3.5%, respectively, and after juice extraction these
proportion increased to 17% and 17.5%, respectively. Other authors also revealed
changes in anthocyanin profiles due to heat treatment. However, these changes were
different from our results. The proportion of malvidin-glucosides in blueberries
increased from 51% of total anthocyanins in fruits to 60% in pasteurized juices with a
concomitant decrease in delphinidin and petunidin-glycosides. The authors also
observed an increase in cyaniding glucoside contents (Lee et al., 2002). In grape
juices, the proportion of malvidin-glucosides also increased after pasteurization
(Gollücke et al., 2009). Del Pozo-Insfran et al. (2006) observed that thermal
pasteurization decreased total anthocyanins in Muscadine grape juices by 16%, with
greater losses occurring for ortho-dihydroxy-substituted anthocyanins (delphinidin
and cyanidin) with respect to the methoxylated anthocyanins (peonidin and
malvidin).
131
Dp-g
Pn3,
5-g +
Cy-
g
Mv3
,5-g
Pt-g
Pn-g
Mv-
g
Mv-
ac-g
Dp-c
ou-g
Pn-4
70 +
Mv-
470
Cy-
cou-g
Pt-c
ou-g
Pn-c
ou-g
Mv-
cou-g
0
5
10
15
20
2535
40
45
50Grape
Skin
Juice
Pomace
Anth
ocyanin
%
Fig. 2.Anthocyanins (%) in Isabel grape, skin, juice and pomace. Abbreviations: Dp –
delphinidin, Pn-peonidin, Cy-cyanidin, Pt-petunidin, Mv-malvidin, g-glucosides, and
ac-acetylated or cou-coumaroylated derivatives.
The content of 3’,5’-substituted anthocyanins (cyanidin and peonidin
derivatives) in Isabel grape, skin, juice and pomace was 3.2, 3.2, 5.2 and 4.9-fold
higher than that of 3’-substituted ones (delphinidin, petunidin and malvidin
derivatives). The ratio of 3’,5’-substituted to 3’-substituted anthocyanins in juice and
pomace was significantly higher than that observed for grape and skin, indicating
that these samples might contribute with different chromatic characteristics (He et
al., 2010).
132
In order to further investigate this change in anthocyanins profile, samples of
black grapes Autumn Royal, were used to produce juice by steam extraction. Fresh
and lyophilized samples of skin and juice were extracted as described in Section 2.2.,
and analyzed by HPLC as described in Section 2.3. However, no change in anthocyanin
profile was observed for both fresh and lyophilized samples when comparing grape
skin and juice (data not shown). Further research is needed to investigate the
mechanisms involved in this change.
4. Conclusion
The results showed that the skin of Isabel grape is the edible fraction with
higher content of phenolic compounds, indicating that the consumption of unpeeled
grapes should be stimulated. Juice produced by steam extraction is rich in
anthocyanins and the pomace has potential applications as a source of phenolic
compounds. The juice processing leads to change in the anthocyanin profile,
especially related to the content of delphinidin and petunidin derivatives. Further
research in this field is necessary to investigate the impact of these changes to the
health of consumers.
Acknowledgements
This work was supported by Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à
Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) and Coordenação de Aperfeiçoamento
de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
133
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Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ Centro de Ciências da Saúde – CCS
Instituto de Nutrição Josué de Castro – INCJ Programa de Pós-Graduação em Nutrição – PPGN
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Efeito de diferentes métodos de extração e do processamento por alta pressão hidrostática sobre a capacidade antioxidante e o teor de compostos bioativos de uva
(Vitis labrusca)
Você está sendo convidado para participar de uma pesquisa. A seleção foi realizada de forma casual e sua participação não é obrigatória. As informações obtidas serão analisadas em conjunto com as informações, obtidas de outros participantes, não sendo divulgada a identificação de nenhum participante. O objetivo deste estudo é avaliar o efeito de diferentes tempos de extração a vapor sobre a aceitação do suco de uva. Sua participação nesta pesquisa ajudará a identificar o suco com melhor característica sensorial, de acordo com o processamento, para embasar a seleção de amostras que serão posteriormente analisadas quanto à composição química. Sua participação consistirá em responder ao teste sensorial de preferência, não havendo riscos relacionados. Além disto, não haverá despesas pessoais em qualquer fase do estudo e não haverá compensação financeira relacionada à sua participação. Em qualquer etapa do estudo, você terá acesso ao profissional responsável pela pesquisa, Profa. Maria Lucia Mendes Lopes, que poderá ser encontrada pelo telefone (21) 25626449 ou no 2º andar do bloco J do CCS, sala 16. Se você tiver alguma dúvida sobre a ética da pesquisa, entre em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho/HUCFF/UFRJ - Sala 01D-46/1° andar; telefone 2562-2480 – Email: [email protected]. É garantida a liberdade de querer não participar deste projeto ou de retirar o consentimento a qualquer momento, no caso da aceitação, sem qualquer prejuízo em sua relação com o pesquisador ou com a instituição. Acredito ter sido suficientemente informado a respeito do estudo acima citado que li ou que foram lidas para mim. Ficaram claros para mim quais são os propósitos do estudo, os procedimentos a serem realizados, seus desconfortos e riscos, as garantias de confidencialidade e de esclarecimentos permanentes. Ficou claro também que minha participação é isenta de despesas. Concordo voluntariamente em participar deste estudo e poderei retirar o meu consentimento a qualquer momento, antes ou durante o mesmo, sem penalidades ou prejuízo ou perda de qualquer benefício que eu possa ter adquirido. Além disso, estou ciente de que eu e o pesquisador responsável por essa pesquisa deveremos rubricar todas as vias (uma via com o voluntário da pesquisa e outra com o pesquisador) desse Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – TCLE. __________________________________ Data: ____/____/____ Nome do Sujeito da Pesquisa.
___________________________________ Assinatura do Sujeito da Pesquisa
____________________________________ Data: ____/____/____ Nome do Pesquisador Responsável
___________________________________ Assinatura do Pesquisador Responsável
Rio de Janeiro, 26 de outubro de 2011
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