Trabajo práctico N° 3CROMATOGRAFÍA

Docentes:• Elalle, Claudia• Salerno, AlejandraIntegrantes:• Amondaray, Mariano• Martín, Aldana

Química Orgánica I – ISP Dr. Joaquín V. González

Introducción teórica:Es una técnica que permite la separación de los componentes de una mezcla debido a la influencia de dos efectos contrapuestos.a) Retención. Efecto producido sobre los componentes de la mezcla

por una fase estacionaria, que puede ser un sólido o un líquido anclado a un soporte sólido.

b) Desplazamiento. Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por una fase móvil, que puede ser un líquido o un gas.

c) La mezcla a separar se deposita sobre la fase estacionaria, mientras que la móvil atraviesa el sistema desplazando a los componentes de la mezcla a distinta velocidad, dependiendo de la magnitud de sus interacciones relativas con ambas fases. Las dos fases se eligen de forma que los componentes de la muestra se distribuyan de modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase móvil; los que se unen débilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cuantitativamente y cualitativamente.

Cromatografía en columna

La fase estacionaria se deposita en el interior de una columna de vidrio que termina con una placa porosa que impide su paso y en un estrechamiento con una llave. La mezcla se deposita sobre la parte superior de la fase estacionaria mientras que la fase móvil atraviesa el sistema. Los compuestos van saliendo por separado de la columna y se recogen en fracciones, los mas polares quedan mas retenidos y para que salgan generalmente hace falta aumentar la polaridad del disolvente. El tiempo necesario para eluir un compuesto de la columna se llama tiempo de retención.El adsorbente más utilizado (y el que se utilizó en este caso) es el gel de sílice. Se hizo la elución por gravedad. Cuanto más pequeñas sean las partículas del adsorbente mas eficaz será la separación. Las variables a tener en cuenta en la eficacia de esta técnica son:• Diámetro de la columna y cantidad de gel de sílice (cuanto mas alta

la columna y mas gel se utilice mas lenta será la separación)• Elección del disolvente. El mismo tiene que conducir a una buena

separación de los componentes de la mezcla en capa fina. En ocasiones se utiliza mezcla de disolventes (como en este caso) y se realiza una elución en gradiente.

Objetivos:Comprender el fundamento y las aplicaciones de las diferentes técnicas cromatografíasSeparar una mezcla de colorantes por cromatografía en columnaIdentificar cada uno de los colorantes por cromatografía analítica en placa delgada (TLC)

Materiales y reactivos:Bureta (columna), vaso de precipitados, soporte universal, doble nuez, matraz Erlenmeyer, cubas cromatográficas (se utilizó vaso de precipitado), agarradera, algodón, probeta, papel de filtro, balanza.Rojo de metilo, Azul de metileno, Cloruro de metileno, silicagel, metanol.

Procedimiento Primera parte: elección de la fase móvil

por TLCa) Se preparan cuatro cubas cromatográficas (vasos de precipitados) con 4 ml

cada una de las siguientes fases móviles:1. Diclorometano2. Metanol3. Diclorometano:metanol 3:14. Diclorometan:metanol 30:1b) Se preparan 4 capilares para la siembra. La mezcla líquida asciende por capilaridad.c) Se siembra en cuatro placas la mezcla a separar (depositando el liquido del interior del capilar en un punto medio superior de cada placa)d) Se hace eluir una placa en cada cuba, tapando las cubas con vidrio de reloj.e) Según los resultados obtenidos se elije la fase móvil. LA FASE MÓVIL MAS CONVENIENTE RESULTA SER LA DE DICLOROMETANO:METANOL 3:1, PORQUE SE OBSERVA LA MEJOR SEPARACIÓN POSIBLE DE LOS DOS COMPONENTES (SIN QUE ALGUNO DE ELLOS SE HAYA DESPLAZADO MÁS ALLÁ DE LA PLACA)

Placas sembradas con la mezcla a separar (tinta de marcador)

Siembras en las cubas con distintas fases móviles

Separación de la mezcla con diclorometano:metanol 3:1

Segunda parte: separación de los componentes de la mezcla por cromatografía en columna

a) Se preparan 40 ml de la fase móvil elegida en una probeta (FM1) – 30 ml de diclorometano y 10 ml de metanol.

b) Se prepara la bureta (columna), sostenida con doble nuez y agarradera al soporte universal, se verifica que no esté trabado el robinete. Se recarga la bureta con dos medidas de tapa de gaseosa de silicagel (golpeando suavemente la bureta a fin de evitar la formación de columnas de aire) y se coloca un trocito de algodón encima de la columna de silicagel y otro por debajo, con ayuda de varilla de vidrio.

c) Se humedece la columna de silicagel con la FM1, verificando que no se seque en ningún momento.

d) Se toma con una pipeta 0,5 ml de la muestra de colorantes a separar disuelta en el solvente apropiado (diclorometano:metanol 3:1), se introduce en la columna haciendo deslizar la muestra por las paredes internas de la misma dejando que se deposite en la silicagel. Luego se abre el robinete para que eluya ligeramente la fase móvil de manera que se vaya absorbiendo el liquido en la superficie, sin que se seque. Luego de sembrar se coloca otro trocito de algodón sobre la sílica para evitar que por agregado de la fase móvil se resuspenda la sílica.

Cargado de la columna (bureta)

con silicagelColumna de

silicagel

Columna de silicagel humedeciéndose

con la FM1

Evolución de la cromatografía, separación de los colorantes de la mezcla

Se continúa agregando en porciones la FM1, se deja eluir recogiendo el eluato 1 en un Erlenmeyer (o tubo de ensayo), continuando agregando fase móvil para que no se seque la columna. Luego, se toma la segunda fase móvil (FM2) – DICLOROMETANO:METANOL:ÁCIDOACÉTICO 30:10:4- en la probeta graduada y se agrega en porciones a la columna del mismo modo que en el paso anterior, recogiendo el eluato 2 en otro tubo de ensayo. Eso sirve para aumentar la eficiencia de la elución del segundo, al aumentar la polaridad de la fase móvil.Como los compuestos son coloreados, las bandas observadas en la columna que avanzan con diferente movilidad se ven a simple vista. Por lo tanto se pueden recoger tres fracciones: la que corresponde al primer colorante (eluato 1), la fracción intermedia entre ambos y la que corresponde al segundo colorante (eluato 2). A fines prácticos, solo se recogieron la primer y tercera muestra.

Eluatos recogidos para la posterior

identificación Eluato 1

Tercera parte: identificación de los colorantes separados con los testigos

adecuados por tic:

a) Se utilizan dos placas cromatográficas para sembrar cada una con los eluatos con el testigo correspondiente (azul de metileno y rojo de metilo)

b) Se desarrolla el cromatograma utilizando la FM1.

Coincidencia en la identificación de los eluatos (con rojo de

metilo y azul de metileno)

Conclusiones• El eluato 1 (color anaranjado) se identifica con el testigo rojo

de metilo. Esto se puede afirmar porque ambos corren del mismo modo en la placa. Lo mismo sucede con el eluato 2 (color azul) y el testigo azul de metileno. Si fueran sustancias distintas, se observaría diferencias en el corrimiento de las mismas por el contacto con la fase móvil en la placa.