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Doctoral thesis final exposition. IIB-INTECH 29/9/2010 10:30-12:30by Martin Blasco.Degree: Ph. D. in Molecular Biology and Biotechnology.Theme, sex differentiation, temperature sex determination, steroidogenesis, androgen biosynthesis. LC-MS.
Citation preview
Esteroidogénesis y diferenciación sexual en el pejerrey
Lic. Martín BlascoDirector: Dr. Gustavo Somoza1
Co-Directora: Dra. Denise Vizziano2
1. IIB-INTECH2. Dpto. Oceanología. UdelaR.URUGUAY
1
2
Composición de la tesis
Síntesis de andrógenos en órganos del pejerrey
Perfiles de expresión de marcadores
Cuantificaciónde andrógenos
Introducción. Determinación sexual y diferenciación gonadal
Devlin & Nagahama, 20023
Determinación sexual Diferenciación gonadal
4
Introducción. Mecanismos de determinación sexual
GSD GSD ESDXXXY
ZWZZ
Temperatura
pH
Strüssmann et al. 1997, Ito 2005
Introducción. TSD en el pejerrey bonaerense
5
Odontesthes bonariensis
17 C
29 C
TFM (29 C)
TFH (17 C)
semanas post-eclosión
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
EST Diferenciación
Gonadalec
losi
ón
TFMix (25 C)
Introducción. Determinación sexual y diferenciación gonadal
6
7
Introducción. Diferenciación morfológica en el pejerrey
Determinación Primeros signos de diferenciación
8
Introducción. Marcadores tempranos de la diferenciación
sox9
nr5a1 sf-1
nr0b1 dax1 dmrt1
amh
foxlfst
cyp19a1a
Introducción. Sensibilidad a los esteroides
9 Adaptado de Piferrer, 2002
Introducción. Hipótesis los esteroides como mediadores de la dif.
Estrógenos
Inh. Arom
Andrógenos
10
Estrógenos
¿Andrógenos?
Determinación sexual Diferenciación gonadal
Yamamoto, T-O ,1969
11
Introducción. Biosíntesis de esteroides sexuales en peces
Estudiar el rol de los andrógenos 11-oxigenados en el proceso de determinación-diferenciación sexual del pejerrey
Objetivo general
-Análisis de la androgénesis testicular y de otros órganos.
-Caracterización de enzimas clave para la síntesis de andrógenos.
-Expresión temprana de las enzimas de la androgénesis.
-Análisis cuantitativo de los andrógenos.
12
Objetivos particulares
La producción de esteroides es muy difícil de estudiar en los estadíos tempranos
Biología molecular para el estudio de la capacidad androgénica.
¿Qué andrógenos son importantes?
¿Qué enzimas están involucradas?
Elección de genes.
Desarrollo de la estrategia de estudio
13
14
Capítulo I. Introducción. Estudio de la esteroidogénesis
Espermatogénesis
Caracteres sexualessecundarios
T. indif.
Extracción
T. juv.
Etc.
HPLC
Identificación definitiva
DPMs/mgDPMs/pico
Fraccionamiento
15
Capítulo I. Materiales y métodos. “Bioquímica clásica”
TLCIncubación
Muestras
Resolución
Cap. I. Resultados. Testículos analizados
16
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
I II III IV-A IV-B IV-C
Experimento
IGS%
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
I II III IV-A IV-B IV-C
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
I II III IV-A IV-B IV-C
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
I II III IV-A IV-B IV-C
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
I II III IV-A IV-B IV-C
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
I II III IV-A IV-B IV-C
Juveniles Adultos
Indiferenciado
Diferenciación
mpe
Semana 5 (TFM)Incubado con A4
17
Cap. I. Resultados. Síntesis de 11-KT en la gónada indiferenciada (TFM)
11-KT
18
Cap. I. Resultados. Esteroidogénesis en testículos de juveniles
Meses 6,5 Incubados con 17P
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
I II III IV-A IV-B IV-C
19
Cap. I. Resultados. Esteroidogénesis en testículos maduros (17P)
Incubados con 17P
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
I II III IV-A IV-B IV-C
Cap. I. Resultados. Identificación de 11-KT, 11β-OHA4 y 11-KA4
20
Incubados con A4 ó 17P
Cap. I. Resultados. Esteroidogénesis en ovarios (P.V.)
21
Cap. I. Resultados. Esteroidogénesis en riñón
Riñón
11β-OHA4
22
Cap. I. Discusión y conclusiones.
23
Semana 5 TFM 11-KT
11-KTJuveniles
¿Hígado?
¿Sangre?
11-KT11β-OHA4Adultos
24
Cap. I. Discusión y conclusiones.
A4 11β-OHA4 11-KA4
11-KT
Cap. I. Discusión y conclusiones. Androgénesis en otros órganos
25
Riñón
11β-OHA4
HígadoSNC
Ovario
1. Enzimas clave en la síntesis de andrógenos (P450-scc y P450-11b)2. Estudio de la expresión en tejidos3. Expresión temprana durante el TSD y la diferenciación a TFM y TFH
Potencial androgénico durante el desarrollo gonadal
26
¿Andrógenos?
27
Capítulo II. Patrones de expresión génica
Testículos
Caracterización de las secuencias de cyp11a1
y cyp11b1Oligos qPCR
Tejidos
Sitios de expresión
t= 1, 2, ..9 spe
TFH TFM
Perfiles de expresión
Capítulo II. Troncos y gónadas pre- y post-diferenciación
28
(A) Región de unión a esteroide (Tsujita et al, 1993).
(B) Región de unión a adrenodoxina (Wada et al, 1992).
(C) Región de coordinación del grupo hemo.
Cap. II. Resultados. Secuencia y características de la cyp11a1
29
(A)Sitio de unión a esteroides
(B) Unión a oxígeno (C) Región de Ozol
(D) Sitio aromático, (E) Sitio de unión al hemo
Cap. II. Resultados. Secuencia y características de la cyp11b1
30
Cap. II. Resultados. P450-scc y P450-11b por ClustalW
31
Cap. II. Resultados. Sitios de expresión de cyp11a1 y cyp11b1
32
Cap. II. Resultados . Expresión de cyp11a1 y cyp11b1 en troncos (1-8)
33
Cap. II. Resultados . Expresión de cyp11a, 11b1, 19a1a en gónadas
34
35
Cap. II. Resultados . Marcadores de la diferenciación gonadal
Cap. II. Discusión y conclusiones
36
sox9
nr5a1
dmrt1
amh
cyp11b1
11-KT
cyp19a1a
nr5a1
cyp19a1a
37
¿ESTEROIDES?RIAsEIAs •Trazadores (radiactivos o enzimáticos)
•Disponibilidad comercial (síntesis a medida)
Capítulo III. Introducción. Determinación cuantitativa de esteroides
LC + fraccionador + extracción + RIA(3 días)
+ RIA(EIA)
Bioquímica clásica Métodos directos
•Anticuerpos específicos
•Necesidad de conjugación (haptenos)
•Reactividad cruzada
38
HPLC-ESI-MS
Capítulo III. Estrategia
Carassius auratus
Esteroides de interés medidos por RIA en un modelo conocido
Cap. III. Materiales y métodos. Iones moleculares y linealidad
LC-MS
Estándares de esteroides 11β-OHT
11-KT
11-KA4
11β-OHA4
T
A41 ppm
0,2-50 ppb
287
573595
0
20
40
60
80
100
120
101 276 347 406 472 597 684 789
A4
m/z, amu
% R
elat
ivo
y = 1550x R² = 0.9993
0.00
2000.00
4000.00
6000.00
8000.00
10000.00
12000.00
0 10 20 30
11-KT
11β-OHA4
T
SCAN
ENFOCADO
39
Evaporación
Cap. III. Materiales y métodos. Determinaciones en plasma
Centrifugación 30 min x 350 rcf
Extracción por punción del pedúnculo caudal
Extracto en fase móvil (CH3CN:H2O)
Histología gonadal
[HE:E]
Extracción orgánica [Partición-Congelación]
LC-MS40
Cap. III. Resultados. Espectros de masa en modo SCAN
305
327 631
0
20
40
60
80
100
120
101 150 210 305 438 607 681 773 868
11β-OHT
m/z, amu
% R
elat
ivo
303
605
0
20
40
60
80
100
120
100 166 237 305 378 439 503 586 686
11β-OHA4
m/z, amu
% R
elat
ivo
301
323 623
0
20
40
60
80
100
120
100 185 301 427 549 714 835
11-KA4
m/z, amu
% R
elat
ivo
287
573595
0
20
40
60
80
100
120
101 276 347 406 472 597 684 789
A4
m/z, amu
% R
elat
ivo
303
605627
0
20
40
60
80
100
120
101 157 232 304 350 400 630
11-KT
m/z, amu
% R
elat
ivo
289
577 599
0
20
40
60
80
100
120
100 134 180 224 301 353 455 741
T
m/z, amu%
Rel
ativ
o
41
Cap. III. Resultados. Resolución, LD, LQ en modo enfocado (SIM)
42
LD
LQ
43
Cap. III. Resultados . Concentraciones séricas en goldfish
Código de muestraPT
(g) Sexo EstadioPG
(g)
IGS
%
T
(ng/mL)
11-KT
(ng/mL)
11β-OHA4
(ng/ml)
GF102_11/03/08 66,57 H Ma 4,76 7,15 3,74 < 0.3 < 0.5
GF106_11/03/08 59,35 H Ma 3,64 6,14 1,62 5,78 1,89
GF107_11/03/08 50,90 H Ma 3,02 5,92 1,22 3,07 < 0.5
GF205_22/04/08 113,94 H Ma 10,30 9,04 2,51 < 0.3 1,38
GF206_22/04/08 103,30 H Ma 12,10 11,71 3,58 < 0.3 0,50
GF103_11/03/08 61,08 M Ma 1,46 2,40 4,28 12,34 3,36
GF104_11/03/08 60,68 M Ma 0,85 1,40 4,94 14,54 6,63
GF105_11/03/08 60,48 M Ma 1,69 2,80 5,93 11,70 1,27
GF201_22/04/08 81,11 M Ma 3,28 4,04 5,92 13,60 1,47
GF202_22/04/08 65,44 M Ma 1,60 2,44 5,21 19,38 < 0,5
GF203_22/04/08 98,12 M Ma 1,85 1,88 5,38 12,57 0,87
GF204_22/04/08 68,05 M E 3,21 4,72 13,25 18,66 0,86
44
GC-MS Derivatización(2 días)LC-MS (1 día)
LC + fraccionador + extracción (acondicionamiento) + RIA(3 días)
+ RIA
Cap. III. Discusión. Comparación con otros métodos
EIA-RIA
•Anticuerpo•Reacción cruzada•Trazador
Cap. III. Conclusiones
45
Cuantificación simultánea de T, 11-KT y 11β-OHA4.
Los niveles de detección y cuantificación permiten estudiosfisiológicos.
Compatible con otros sistemas (por ej. MS/MS).
Estudio de bioquímica de esteroides (metabolómica).
46
Cap. III. Proyecciones
Relación gónada Circulación
Aplicación
Análisis de 11-KT/11β-OHA4 en otros vertebrados
Estudio de vias metabólicas completas
47
Cap. III. Proyecciones. Anticipo.
Macho espermiante
T
(ng/mL)
11-KT
(ng/mL)
11β-OHA4
(ng/ml)
3,8 2,4 4,7
Suero
48
Conclusiones generales
Identificación de los principales andrógenos testiculares.
Machos en diferenciación molecular
Herramientas para estudio de andrógenos (cuali-cuantitativo)
Dimorfismo en cyp11a1 y cyp11b1
A4 11β-OHA4 11-KA4
11-KT
11-KT
Desarrollo testicular temprano
49
¿?
¿?
¿?
¿?
¿Preguntas?