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Clase dictada hasta el 2010 a los alumnos de la Fac. de Ciencias Biológicas de la Univ. Nac. Mayor de San Marcos.
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Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM
FISIOLOGÍA Y GENÉTICA DE LA
FIJACIÓN DE NITRÓGENO
Prof.Mag.Débora E. Alvarado
Curso: Genética Microbiana
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM
La Fijación de nitrógeno es una cualidad exclusiva de los
procariontes.
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM
N2 atmosférico total 1015 ton
Ciclo transforma 3 x 109 ton N2 / año
diazotrofos
Importancia de la Fijación del Nitrógeno en la naturaleza
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM
El gas Nitrógeno (N2) conforma el 79% de la atmósfera pero no es directamente utilizable por la mayoría de organismos.
El Nitrógeno es requerido por todos los organismos vivos, pero solamente unos pocos pueden fijarlo de la atmósfera.
El Nitrógeno es con frecuencia un nutriente limitante en los ecosistemas de suelo.
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM
Colonización de pelo radical por Azospirillum brasilense
Marcación con sonda alfa1b marcado con rodamina y microfotografía de epifluorescencia con imagen de rastreo confocal
Microfotografía de transmisión
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Árbol NifH mostrando los diferentes grupos microbianos diazotrofos.
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM
Los microorganismos procariónticos fijan el 85% del N2 atmosférico, del cual se fijan… – 60% en el suelo– 40% en el océano
15% restante es fijado por:– Combustión– Relámpagos– Producción industrial de fertilizantes
(síntesis de Haber-Bosch).
Bioquímica de la Fijación de Nitrógeno
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM
N2 + 4H+ + 4NADPH + 16-24ATP 2 NH3 + 4NADP+ + 16-24ADP + 6Pi
Dinitrogenasa
N N______
945 KJ/molNo reactivo
No disponible metabolicamente
Altamente estable
Fijadores de N2 Diazotrofos
Sistema Nitrogenasa
Complejo enzimático reductasa
Pasos para la fijación del N2:reducción de
N2 a 2NH3
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Versatilidad del Complejo Nitrogenasa
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Bacteria Fijadora de Nitrógeno
Bacteria nitrificante
Nitrate reductase (Fe, Mo)
Nitrite reductase (Fe)
Nitrogenase(Fe, Mo or V)
Bacteria denitrificante
N2 NH4+
NO3-NO2
-
Nitrogen
Las más importantes enzimas para la asimilación del N requieren Fe.
Complejo enzimático Nitrogenasa Éste rompe el triple enlace de la molécula N2 para
producir nitrógeno atómico y subsecuentemente NH3.
Dos proteinas están involucradas en el complejo, cada una con subunidades múltiples. – Dinitrogenasa, es una proteína que contiene Molibdeno y
Fierro (2 Mo/molécula, 22-24 Fe/molécula) – Dinitrógeno reductasa, es una proteína que contiene
Fierro y Azufre (4 Fe/molécula, 4 S/molécula). En células que fijan nitrógeno, 10 al 40% de las
proteinas celulares pueden ser nitrogenasas. El proceso es relativamente lento y requiere 1,25 seg
para formar dos moléculas NH3.Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM
La energía requerida para romper la molécula de N2 (16 ATP aprox), es una inversiónsignificativa de energía por las células.– Cerca de 15 mg N2 es fijado por cada gramo de carbono
consumido para energía. – Los organismos aeróbicos son algo más eficientes que los
organismos anaeróbicos. La producción de amonio industrial requiere altas
temperaturas (500oC), alta presión (~200 atm), y un catalizador (usualmente Niquel). – La producción de una tonelada métrica de NH3
requiere energía e hidrógeno de combustibles tales como gas natural (31,000 ft3 ), o petróleo (5.5 bls) o carbón mineral (2 Tm).
La enzima nitrogenasa funciona a temperatura y presión ambiental.
Cianobacterias y la diazotrofía
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM
Berman-Frank 2003 Res Microbiol 154:157–
164
Adaptaciones morfológicas y de comportamiento de cianobacterias en relación a la fijación del N2
Berman-Frank 2003 Res Microbiol 154:157–
164
Evolución de las vías metabólicas de la fotosíntesis oxigénica y la fijación de N2.
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM
Dos árboles propuestosGen nif vs spp
Nódulo Legumbre/Rhizobium
Células lignificadas
Sacos vasculares
Células fijadoras de N2
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Los nódulos proveen un ambiente para los microorganismos. La planta provee los substratos orgánicos necesarios y protege a los organismos del oxígeno por la presencia de leghemoglobina (compuesto rojo parecido a la hemoglobina).
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM
Straight, 2009 Annu. Rev. Microbiol.. 63:99
Intercambio de señales químicas en
la comunicación entre la leguminosa y
la bacteria de la familia Rhizobiaceae
Azotobacter vinelandii.
Sabra, 2000 Appl Environ Microbiol
66:4037
Mecanismos de protección de la nitrogenasa contra el O2
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM
Vista superficial, en microfotografía electrónica, de células de Azotobacter
vinelandii crecidas a 2.5 y 20% de saturación de aire en un quimiostato con limitacion de
fosfato. PHB, poli-b-hidroxibutirato.
Genética de la Fijación de Nitrógeno.
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM
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Fijación de Nitrógeno en presencia de Oxígeno
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM
Streptomyces thermoautotrophicus
Str2 Str1
N2
2NH3
CO
CO 2
CO deshidrogenasa
Nitrogenasas
O2
O2 -
e-e-
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Uridililtransferasa
NifL, regulador negativo de expresión genes nif (inhibe NifA) en proteobacterias.
Nif A, activador transcripcional cataliza actividad de RNA polimerasa con factor sigma 54 (regulación dual)
O2
FlavoproteinaOxida
NifL
Inhibición por O2
Vía de regulación de nitrógeno global
Efector alostérico
Vía de regulación de oxígeno global
N
Regulación de la Fijación del N2
Filogenia de bacterias fijadoras de nitrógeno en Reticulitermes speratus, utilizando secuencias de aminoácidos NifH.
Observación microscópica del contenido intestinal de termites
Perspectivas de investigación Plantas transgénicas con genes de nitrogenasa,
particularmente de aquellas no sensibles al oxígeno. Identificación, selección y mejoramiento genético de
bacterias diazotróficas asociadas a plantas.– Con más motilidad y con mayor capacidad de adherencia.– Con mayor tolerancia a estreses edáficos: acidez, salinidad
y alta temperatura.– Reto, asociación con otra flora simbionte como las
micorrizas. Uso de diazotrofos en la remediación de derrames de
petróleo. Búsqueda de nuevos productores de nitrogenasas.
– Reto, búsqueda de enzimas con menor requerimiento energético y menor sensibilidad al oxígeno.