Qu’est-ce que c’est une protéine ?Des molécules

biologiques

De faible masse moléculaire

Macromolécules

Acides gras sucres nucléotides Acidesaminés

Protéines Acides nucléiques

polysaccharides

toutes formées d'un squelette carboné

ADN, ARNAmidon

Glycogène

http://fr.wikipedia.org/wiki/Fichier:Human_alfa2beta2_hemoglobin.gif

Primaire

Secondaire

Tertiaire

Quaternaire

Acides aminés

Hélice alphaFeuillet bêta

Fonctions des protéines

Structurale Le collagène. C’est une protéine qui forme des fibres. Celles-ci se trouvent dans tous les animaux. Elles sont secrétées par les cellules le tissu conjonctif comme les fibroblastes, ainsi que par d’autres types des cellules. Le collagène est le composant le plus abondante de la peau les tendons et les os. Le collagène représente le 25% de la masse totale de protéines chez les mammifères.

Fonctions des protéinesImmunitaire Les anticorps

Groupe A

Groupe B

Groupe AB

Groupe O

Globules rouges

Anticorps

AntigènesA B A et B Aucun

AucunAnti-B Anti-A Anti-A Anti-B

Paratope

Fonctions des protéines

Catalytique Les enzymes. Ces protéines ont la propriété de catalyser ou accélérer les réactions chimiques qui ont lieu dans les cellules et dans les milieux extracellulaires. Si les enzymes n’étaient pas présents, les réactions chimiques se feraient à une vitesse si faible que la vie ne serait pas possible.

Biosynthèse de protéines

Le code génétique universel

Production de protéines thérapeutiquesLa déficit de production de certaines protéines ou la production de certaines protéines non fonctionnelles dans l’organisme amène fréquemment à des maladies qui peuvent être graves.

Ces maladies peuvent parfois être traitées par l'administration clinique de la protéine provenant de sources externes.

Cependant, de nombreuses protéines humaines ayant une valeur pharmaceutique importante sont obtenues difficilement à partir de leur source naturelle.

La technologie de protéines recombinantes, apparue à la fin des années 70, offre une plateforme technique très puissante pour la production contrôlée de protéines d'intérêt par des procédures relativement bon marché.

Recombinaison génétiqueLes protéines recombinantes sont des protéines produites par des cellules dont l'ADN a été modifié par recombinaison génétique.

Un gène codant une protéine d'intérêt est introduit dans le génome de l'espèce productrice.

Les protéines recombinantes peuvent être purifiées et utilisées à des fins thérapeutiques, industrielles ou bien encore dans les activités de recherche.

La recombinaison génétique est un échange d‘information génétique entre deux génomes différents.

Production de protéines recombinantes

Construction d’une molécule recombinante

Plasmide recombinant

Gène de PqsD

Gène de PqsD provenant de Pseudomonas aeruginosa

Plasmide d’expression

Notre plasmide d’expression

PqsD

KanOri

pET28

6His

Transformation de notre souche d’expression

E. Coli BL21

Étapes pour la production de notre protéine recombinante

Pré-culture Culture CentrifugerCulot : Cellules

Milieu

Inoculer notre bactérie (souche d’expression) dans 5 ml de milieu LB ou TSB + kan 30 µg/ml

Incuber à 37°C/over night/sous agitation

Inoculer 100 ml de milieu LB avec notre pré-culture de façon à obtenir une D0600

initiale de 0,05.

Incuber à 37°C/240rpm

Lors qu’une DO600 de 0,6 est atteinte, induire avec 1 mM d’IPTG final

Incuber 2h de plus

Collecter les cellules par centrifugation à 7000 rpm/15min/4°C

Laver le culot cellulaire avec 70ml de tampon de lavage.

Recollecter les cellules par centrifugation à 7000 rpm/15min/4°C

Garder le culot cellulaire à -20°C jusqu'au jour de la lyse.

Culot : Cellules Lyse cellulaire

Fraction Cytoplasmique (surnageant)Fraction

Membranaire (culot)

Séparation de fractions cellulaires

Étapes pour la purification de notre protéine recombinante

Lyse: Resuspendre le culot cellulaire congelé à 20°C dans 6ml de tampon de lyse Bugbuster®.

Vortexer pour détacher le culot des parois du tube en plastique.

Incuber sous agitation douce à température pièce pendant 20 minutes.

Séparation des fractions cellulaires: Centrifuger à 20000xg/30min/4°C pour décanter la fraction membranaire.

Diluer le surnageant obtenu avec 6 ml de tampon d’imidazole 10mM.

Filtrer avec un filtre de 0,2µm pour éliminer les débris cellulaires en suspension.

Étant donné que notre protéine recombinante se trouve soluble dans le cytoplasme, on purifiera donc notre protéine à partir de cette fraction.

Chromatographie d’absorption ou d’affinité

Les chromatographies d'adsorption est un méthode de séparation où la molécule d'intérêt d'un mélange complexe est isolée des autres constituants parce qu'elle se lie spécifiquement à la résine ou matrice sur laquelle on fait la chromatographie.

FPLC Fast protein liquid chromatography

Beaucoup d’affinité

Peu d’affinité

Mélange complexe

Élimination de protéines non-spécifiques du mélange

Élution de la protéine d’intérêt pure

Étapes de la chromatographie d’affinité1. Lavage de la colonne de nickel. Laver la colonne en passant 25ml de

l’eau distillée à débit de 5ml/miné. Cette étape permet d’éliminer l’éthanol qui est présente dans la colonne.

2. Équilibration de la colonne: Équilibrer la colonne en passant 25ml d’une solution d’imidazole 10mM à débit de 5ml/min.

3. Injecter l’échantillon contenant notre protéine à débit de 1ml/min.

Imidazole

5. Lavage de la colonne: Laver la colonne avec une solution d’imidazole 10mM pour éliminer les protéines non spécifiques liées à la colonne. Débit 2ml/min pendant 7,5 minutes.

6. Élution: Éluer notre protéine recombinante en faisant un gradient linéaire d’imidazole de 10mM à 250mM. Débit 2ml/min pendant 50 minutes.

Fractions d’élution collectées de 2ml

Étape d’élution. Concentration croissante

d’imidazole (Gradient)

Imidazole 250mM

Étape d’injection et lavage. Concentration constante

d’imidazole (10mM)

Collecte le volume mort

Électrophorèse de protéines en conditions dénaturantes ou SDS-PAGEL'électrophorèse a pour but de séparer des molécules chargées au travers d'un gel (un polymère)

sous l'effet d'un champ électrique.

On fait bouillir un mélange de protéines en présence :

•d'un agent réducteur : le β-mercaptoéthanol qui réduit les ponts disulfure.

•d'un détergent anionique fort : le SDS qui enveloppe les chaînes polypeptidiques des protéines de charges négatives.

Ces charges se repoussent et déplient les chaînes polypeptidiques.

En conséquence : •les protéines sont dénaturées : elles ont perdu leur structure tridimensionnelle native

•les protéines n'ont plus de ponts disulfure : elles sont sous une forme monomérique

Électrophorèse SDS-PAGEFractions à analyser:Volume mort, fraction 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, contrôle positif.

Préparation des échantillons:Volume de fraction: 80µlVolume de loading buffer (5x) 20µlVolume final: 100µl

Chauffer l’échantillon préparé à 95°C/5min.

Déposer entre 60 à 80µl dans les puits.

Migrer à 70 volts/over night

Lorsque le gel aura migré complètement, colorer à l’argent

Vérifier le présence d’une bande correspondant à notre protéine d’intérêt.

Direction de l’électrophorèse