Curso de Genómica - UAT (VHIR) 2012 - RT-qPCR

Programa del Seminario RTqPCR-2012

Definición de la técnica

Terminología asociada a qPCR

qPCR Workflow

Validación de un ensayo de qPCR

Servicio de qPCR en la UCTS

Bibliografía muy recomendada

Definición de la Técnica

R Q

Sonda

A G C

dNTPsTaq

polimerasa

Tampón dereacciónCebadores

Ácido nucléico

PCR en tiempo real o qPCR o RT-qPCR

http://www.appliedbiosystems.com/support/apptech/#rt_pcr

UNG(opciona

l)

ROX

TTU

Termociclador

con sistema de detección

Agentes intercalantes

RT-qPCR

Cualitativa y cuantitativa.

Elevado rango dinámico de detección

Capaz de detectar cambios 2-fold. No requiere procesado post-PCR

PCR Convencional

Semi-cuantitativa:

Rango dinámico pequeño ›2 logs Baja Precisión; baja resolución y

poco Sensible. Manipulación post-PCR . Baja Resolución No-automatización Discriminación basada sólo en

tamaño Los resultados no están

expresados en números. El BrET no es muy cuantitativo

A tiempo real(fase exponencial)

Cuantificación Absoluta

Cuantificación Relativa

A tiempo final(fase plató)

Plus/Minus

Discriminación Alélica

Definición de la Técnica

http://www.wpclipart.com/science/eppendorf_open.png




qPCR Workflow




Escala semi-logarítmica

Cycle Number


Plató

Lineal

BaselineCt value= 15.5

ThresholdExpo

nenc

ial

Log

Fluore

scence

Rn

+ ROX - ROX

Δ R

n

Ciclos Ciclos

Desv St= ± 0.059

Desv St= ± 0.306

Fluoróforo referente pasivo más comúnmente utilizado para normalizar la fluorescencia específica en instrumentos de ABI y

Stratagene.

ROX (6-carboxy-X-rhodamine) como referente pasivo


mRNAmiRNAncRNAsiRNAsaRNACNA

SNPCNVMutacionesAnálisis Metilación

Análisis en Células StemAnálisis en célula Única

MicoplasmaPatógenos en la comida

Aplicaciones RTqPCR

Proteína

Tejido

Célula Eucariota

RNA

DNA

Virus

Bacteria

Target

5´oligo3´oligo

Validación Microarrays





qPCR Workflow




qPCR Workflow

Slope= -1.365Slope= -2.276

qPCR Workflow

qPCR Workflow

PreparaciónMuestra

RNA cDNAProducto Amplifica

do

MuestraDNA

Diseño Experimental

Extracción Ác. Nucléicos

Transcripción Reversa (RT)

qPCR AnálisisEstadístico

Estrategia Cuantif.

Definir el experimento y los grupos control Número muestras de cada grupo Réplicas Experimentales (Biológicas y Técnicas) Distribución de placa (genes vs muestras)

PreparaciónMuestra


do

MuestraDNA





Estrategia Cuantif.

qPCR Workflow: Diseño experimental


Diseño experimental


BIOLÓGICAS

TÉCNICAS

RÉPLICAS

Descripción de la muestra (Microdisección o macrodisección) Manipulación (si congelación o FFPE; cómo, que y cuando) Condiciones de almacenamiento

PreparaciónMuestra


do

MuestraDNA





Estrategia Cuantif.

qPCR Workflow: Preparación de la muestra

Método de extracción Tratamiento con DNasa Calidad (Pureza & Integridad) & Cantidad Almacenamiento (-80ºC)

PreparaciónMuestra


do

MuestraDNA





Estrategia Cuantif.

qPCR Workflow: extracción de ác. nucléicos


Como afecta el método de extracción de RNA a los resultados qPCR

PUREZA: Libre de contaminación por:

Proteínas, sales caotrópicas y fenoles (Absobancia A260/A280 >1.8-2.0; A260/A230=2) gDNA (Tratamiento con DNAsa Inhibidores (SPUD assay (Nolan, 2006)

INTEGRIDAD: No degradado

rRNA (28S:18S=2:1) RIN (Fleige & Pfaffl, Mol. Aspects Med. 27(2006): RIN › 5) PCR test: Ensayo 3´:5´(alrededor de 1 indica elevada integridad; ›5 degradado)

CANTIDAD: Usar el mismo método de cuantificación en muestras que se quieren comparar. (Expert Rev. Mol. Diagn. 5, 493-498 (2005))

2:1

28S

18S

Intacto

Degradado

qPCR Workflow: extracción ác. nucléicos

FT-20ºC

FT-80ºC

4ºC

RT

-20ºC


FT-20ºC

FT-80ºC

4ºC

RT

-20ºC


Inhibición de la RT-qPCR en qué muestras

Material de partida: Muestras fecales Cartílago, hígado. Córnea, etc... Sangre total: heme Anticoagulante: Heparina

Causada por el método de extracción/protocolo erróneo: Etanol en el eluido por una insufiente centrifugación en el

segundo lavado puede inhibir las reacciones de RT y qPCR

cDNA o gDNA demasiado concentrado: Más del 10% de cDNA, gDNA en la qPCR inhibe la

reacción.

Como afecta la calidad del RNA a los resultados qPCR:


http://biomedicalgenomics.org/RNA_quality_control.html


PreparaciónMuestra


do

MuestraDNA





Estrategia Cuantif.

qPCR Workflow: Transcripción Reversa

One-Step vs Two Step Cantidad de RNA y vol de reacción CDNA Priming Transcriptasa Reversa y concentración Pérfil Térmico Controles Réplicas

Es la etapa mas variable de todo el proceso

One-Step RT-PCR

Two-Step RT-PCR

RNA cDNA AmplicónRT qPCR

RNA cDNART

cDNA Amplicón

qPCR

NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006

Descripción

Pros

Contras

Minimiza tiempo de preparación y el riesgo de contaminación.

Menos Background en ensayos SYBRGreen

No es posible la optimización por separado de ambas reacciones

AmpErase UNG, para prevenir contaminación, no se puede usar

Menos sensible debido a la menor eficiencia de la actividad RT de la polimerasa

.

Posibilidad de almacenar cDNA para la cuantificación de varios tragets.

Más eficiente porque se pueden usar Random primers y oligo(dT) a la vez.

Más flexible (Permite la optimización por separado de ambas reacciones.

Elevado Background en ensayos SYBRGreen



cDNA Priming




PreparaciónMuestra


do

MuestraDNA





Estrategia Cuantif.

qPCR Workflow: qPCR

Diseño Amplicón y Oligonts. Reactivos, Instrumento, Perfil Térmico . Validación (Especificidad, Eficiencia, Reproducibilidad, Rango dinámico lineal). Controles Estrategia de Normalización

Las secuencias de los oligonts y del amplicón tienen que ser únicas.

No deben tener estructuras secundarias.

Los oligonts no deben amplificar DNA (diseño en la zona exon/exon)

Idealmente, deberían testarse dos parejas de oligonts.

Efecto de la Tª de anillamiento sobre la estructura secundaria del amplicón: El análisis de la secuencia del amplicón mediante el MFOLD predice elevada estructura secundaria a 60ºC y baja a 65ºC.

MFOLD

Amplicón 75-150 bp. 50-60% contenido en GC.

Oligonts TM= 55-65ºC. 50-60% contenido en GC. Evitar homopolímeros, sobretodo de G. Los 5 nts en el extr3¨no deben ser más de 2 G y/o C.

qPCR Workflow: qPCR

Aplicación

Método de Normalización

Química de detección: Sondas específicas marcadas con fluorocromos Agentes Intercalantes Fluorocromos unidos a primers

Reactivos: Core kit vs Master Mix dNTPs/dUTPs y UNG enzyme ROX como referente pasivo

Termociclador: Formato Número de canales de detección Software de análisis Duración del programa Precio y flexibilidad de la oferta

qPCR Workflow: qPCR

Perfil térmico qPCR que incluye paso de Activación UNG

1.- Activación UNG2.- Activación Taq y desnaturalización UNG3.- Desnaturalización del dsDNA4.- Anillamiento y extensión primers

qPCR Workflow: qPCR

Normalización respecto a la masa total de RNA exraído(chequeo calidad –RIN, moleculas/ng RNA)

Normalización respecto al volumen/masa de la muestra( moléculas/mg tejido; moléculas/ml sangre)

Normalización respecto al número de células( moléculas/célula)

Normalización respecto a un gen endógeno no regulable(GAPDH, tubulina, actina, albúmina, ciclofilina, micro-globulina, histonas, rRNA, ……)

Normalización respecto a más de un gen endógeno (›3) geNorm (Vandesompele et al. 2002. Genome Biology) BestKeeper (Pfaffl et. Al. 2004; Biotechnology Letters 2004) Normfinder Statistical modeling for selecting houskeeper genes (Szabo et al.2004, Genome

Biology)

Estrategias de Normalización qPCR

BMC Bioinformatics 2009, 10:110

Genes and Immunity (2005) 6, 279-284. Review

qPCR Workflow: qPCR

qPCR Workflow: qPCR

Los genes de referencia tienen que: ser de expresión constante No ser regulados por las diferentes condiciones experimentales Suficientemente abundantes entre los diferentes tejidos y tipos celulares.

Se recomienda el uso de al menos 3 genes de referencia para la normalización de datos de qPCR.

EL gen de referencia “Perfecto” NO existe.

Genes de Referencia

Softwares: genNorm Normfinder

Cuando se procesan múltiples muestras en diferentes placas, la inclusión de una muestra calibradora o curva estándar en cada placa es un control importante para medir la variabilidad inter-ensayo.

Duplicados técnicos son generalmente suficientes (Triplicados si Cts›35). Si las réplicas difieren ›0.5 Ct, las reacciones deberían repetirse. Son más importantes los duplicados biológicos.

Incluir Controles negativo (NTC) y positivos. Cargar el NTC en el pocillo que esté más distanciado de aquel que contenga mayor concentración de cDNA para evitar contaminación cruzada.

Preparar mezcla de reacción de pcr en laboratorio diferente de donde se manipule el cDNA.

Es siempre mejor no esperar demasiado en correr un run de qPCR después de la preparación de la placa. Si necesitas comparar dos placas idénticas con diferente ciclo de temperaturas, es mejor prepararlas al mismo tiempo, y guardar una de ellas a 4ºC protegido de la luz hasta 10 horas.

Especial atención en el sellado de la placa para evitar evaporaciones y evitar marcas y huellas en la parte superior del cobertor/tapa.

NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006

Real-Time PCR Aplications Guide from Bio-Rad

qPCR Workflow: qPCR




qPCR Workflow




Reproducibilidad (viene indicada por las réplicas)

Controles qPCR

NEGATIVOS NTC (Non Template Control) Detección de dímeros de primers y contaminación NAC (Non Amplif. Control) Detección de degradación de sondas No RT (No RT control) Detección de contaminación por DNA genómico

POSITIVOS Control Endógeno Testado de la calidad de los reactivos. Usado también para

normalizar. Control Exógeno Testado de la calidad de los reactivos Spiking Control Detecta presencia de inhibidores

Curva de Disociación (SYBR Green)

Curva Estándar Linealidad de los datos Distancia entre las curvas de amplificación Eficiencia de amplificación

qPCR Workflow: Validación de un ensayo de qPCR

Pendiente

EficienciaAmplificación

(E= 10-1/slope)

Convertir E enPorcentaje

%E= (E-1)100%

-3,0 2,2 115

-3,1 2,1 110

-3,2 2,1 105

-3,3 2,0 101

-3,32 2,0 100

-3,4 2,0 97

-3,6 1,9 90

-3,7 1,9 86

-4 1,8 78

Curva Estándard:

Slope= -3.73

2n=Factor de dilución

FactorDilució

n

n=LG(Factor Dil.)/LG(2)

2 1,00

5 2,32

10 3,32

OK

R2 ›0.98 o r › 0.99


SlopeR2

ΔC

t=

(Ct

gen T

arg

et

– C

t gen E

ndógeno)

Log Diluciones

Y = 0.0471x + 3.0178R2 = 0.2315

Eficiencias del Gen Target vs Eficiencia gen EC


PreparaciónMuestra


do

MuestraDNA





Estrategia Cuantif.

qPCR Workflow

UEB




qPCR Workflow




Placas-384

Servicio de RTqPCR en la UCTS

Microfluidicas(Arrays de baja densidad)

Placas-96

FAM, TAMRA, VIC, JOE, NED, SYBR, ROX

Formato 384-p: FAM, TAMRA, VIC, JOE, NED, SYBR, ROX, TET.Formato LDA: FAM, VIC, ROX.

7000 SDS 7900HT Fast SDS

Química

Softwares V1.2.3f2 con RQ studyPrimer Express 2.0

SDS 2.4.1RQ Manager 1.2

Tiras de 8 Tubos

LightCycler 480

White Plates-384

mode 9600 Emulation /Standard 9600 Emulation/StandardFast

Formato

Filtros/canales detección:500, 533, 568, 610, 640, 670 nm

Ref. Pasivo ROX ROX Ninguno

Fast

SW 1.5

Elección en el software del ensayo a realizar

Software qPCR Plantilla para el Run Análisis

7000 SDS de ABI

1.-Absolute Quantification (Standard curve)

2.-Relative Quantification

(ddCt) Plate

Absolute Quantification (Standard curve)

Relative Quantification (ddCt) Study

7900 SDS de ABI 1.- Standard Curve (AQ)

2.- ΔΔCt

LighCycler480

7000 SDS 1.1 RQ Study


LightCycler 480 II





qPCR Workflow




Direcciones de interés relacionadas con qPCR

http://qpcr.gene-quantification.info/

http://www.horizonpress.com/pcr/qPCR-machines.html

qPCR-Technical-Guide.pdf (Sigma Life Science)

http://www.eurogentec.com

http://www.dorak.info/genetics/glosrt.html

http://genex.gene-quantification.info/

Gracias

Education

Curso de Genómica - UAT (VHIR) 2012 - RT-qPCR