Bioquímica de AlimentosProteasesPROF. DRA. ADRIANA DANTASCIÊNCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOSCAXIAS DO SUL, RS

Introdução Proteinases

Principal função é a hidrólise de proteínas;Envolvidas no processo de digestão, ativação

de enzimas e no transporte de proteínas pelas membranas;

A posição da ligação da cadeia polipetidica e o tamanho da cadeia influenciam na sua atividade;

Apresentam grau de especificidade em relação aos aminoácidos envolvidos na ligação e na sua posição na molécula.

As enzimas são proteínas, cadeias de aminoácidos.

Enzimas que catalisam a quebra das ligações peptídicas em proteínas através da utilização de água são chamadas hidrolases.

Hidrólise das proteína

Favorece a digestão e absorção pelo organismo Formação de compostos responsáveis pelo aroma e textura

especificos; Proteases (EC 3.4) são enzimas que pertencem ao grupo das

hidrolases Catalisam a reação de hidrólise das ligações peptídicas das

proteínas Atividades também nas ligações éster e amida.

Especificidade das Proteases

Diferentes proteases resultam em diferentes produtos de hidrolises

Enzimas proteases produzidas em escala comercial

75% são hidrolases;Destas, 60% são proteases

25% proteases alcalinas10% quimiosina3% tripsina21% outras;

Modo de ação

As proteases são classificadas pelo modo de ação pelo seu sítio catalítico:

Exopeptidasesatuam nas extremidade da cadeia polipeptidica

Endopeptidasesagem nas ligações no interior da cadeia proteica

Exopeptidases

1. Aminopeptidases Proteases que agem na

extremidade N-terminal da cadeia polietitidaica

Liberam aminoacidos livres, dipeptidios ou tripepetidios

Geralmente são metalo-proteases

Exopeptidases

2. Carboxipeptidases

Proteases que agem na extremidade C-terminal da cadeia polipeptidica

Liberam aminoacidos livres ou dipeptidios; São as serina-proteases, metalo-proteases ou cisteina-proteases Classificadas pela natureza quimica de seu sitio ativo.

Carboxipeptidase

A carboxipeptidase é uma enzima digestiva. A hidrólise completa de uma proteína leva à separação dos

resíduos dos aminoácidos componentes dessa proteína.

Serina-proteases (EC 3.4.21)

Presença do aminoácido serina no sitio ativo Inibidas irreversivelmente:

3,4-dicloroiscocumarina (3,4-DCI)Disopropilfluorofosfato (DFP)Fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF)

Serina-proteases

Ativas em pH neutro e alcalino. Principais exemplos: tripsina, quimiotripsina e subtilisina.Classe Exemplo Aminoácidos do Sítio

AtivoSerina-Protease Quimitripsina

SubstilisinaHis57, Asp102, Ser195

His32, His64 Ser221

Histidina, Ácido aspártico, Serina.

Cisteína-proteases ou proteases sulfidrilicas (EC 3.4.22)

Apresentam em seu sitio ativo cisteina conjugada com histidine Mais ativas em meios de pH neutron do que ácido Ativadas na presença de agentes oxidantes e substância

reagem com grupo sulfidril, p-cloromercuriobenzoato (PCMB) Bromelina, ficina e papaina são as principais cisteina-proteases

Classe Exemplo Aminoácidos do Sítio Ativo

Cisteína-Protease Papaína Cys25, His159,Asp158

Císteina, Histidina, Ácido aspártico

Proteases aspárticas ou acidas(EC 3.4.23)

Contém ácido aspartico em seu sitio ativo; Inibidas por 1,2-epoxy-3-p-nitrofenoxipropano (EPNP) na presencça de íons cobre; Maior atividade em valores de pH ácido e maior afinidade por ligações que envolvem

aminoacidos apolares e aromáticos Pepsina e a renina Proteases microbianas fungicas

gêneros Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Neurospora, Endothia e Rhizomucor

Classe Exemplo Aminoácidos do Sítio Ativo

Protease aspártica Pepsina de Peniciluim sp. Asp33 , Asp213

O mecanismo geral de base-ácido para a hidrólise do polipeptidio catalisado por proteases aspárticas (Figura),

Requer um resíduo Asp, a fim de ser protonado, enquanto o segundo não é ionizado; Os dois aspartatos compartilhar um protões a um pH fisiológico; A ligação amida sofre ataque por uma molécula de água que é ativado pelo resíduo de ácido

aspártico catalítico desprotonado.

Metalo-Proteases

Dependem de íons metálicos divalentes para sua atividade; Inibidas por agentes quelantes, como ácido etilinodiaminotetracético (EDTA)

Classe Exemplo Aminoácidos do Sítio Ativo

Metalo-protease Carboxipeptidase Zn , Glu270, Try248

Neutras: colagenases de Costridium bystoliticum elastases de Pseudomonas aeruginosa Termolisina - protease neutra comercial de alta termoresistência

Alcalinas: gêneros Serratia e Myxobacter, com atividade pH 7,0 a 9,0

Proteases Vegetais

Mais empregadas na indústria de alimentos

Consideradas seguras para consumo humano

Papaina, bromelina e ficina

Papaina (EC. 3.4.22.2)

É uma cisteína-protease extraída do látex dos frutos do mamoeiro (Carica papaya) Comercializada a forma de extrato bruto que contem:

Papainas (QP-A) Quimopapaina (QP-B)

Apresenta atividade proteolítica em valores de pH 5,0 a 9,0 Enzima permanece estável até 90º C Apresenta atividade sobre ligação éster e amida e boa atuação na síntese de

peptídeos

Bromelina (EC. 3.4.22.4)

É uma cisteina-protease extraída do pendúnculo do fruto do abacaxizeiro (Ananas comusus) Atividade ótima pH 6,0 a 8,0 Perda atividade > 70º C

Ficina

Extraída do látex de diversas espécies do gênero Ficus

Apresenta maior atividade: pH 6,0 a 8,0

Temperatura estável até 60º C Baixa especificidade de substrato e

hidrolisa ligações que envolve diversos aminoácidos

Proteases microbianas

São excelentes fontes de enzimas em razão da grande diversidade e produção em escala

Representam 40% do total utilizado no mercado de enzimas

Origem bacterianas

Gênero Bacillus e Geobacillus Proteases neutras:

Ativas pH 5,0 a 8,0 Baixa estabilidade térmica Preferência ligações hidrofóbicas

Proteases alcalinas: pH 8,0 a 11,0 – temperatura 50 a 60º C Baixa especificidade de substrato mais utilizadas na

indústria de detergentes

Origem fúngica

Aspergillus oryzae produz três proteases extracelulares

Extrato é obtido por fermentação Atividade proteolítica pH 4,0 a 11,0 Temperatura ótima 40º C Inativas a 50º C

Clarificação de cerveja

Após fermentação alcóolica a cerveja passa por um período de maturação (cerca de C)

A duração da maturação depende do tipo de cerveja Varia de poucos dias a varias semanas Finalidade é a destruição de diacetil (substância de sabor

desagradável que se acumula durante a fermentação) O diacetil é transformado em acetoína pela adição de enzimas

como acetolactato-descaboxilases e diacetil-redutases

Turvação da cerveja

Interação de compostos fenólicos e polipeptídios provenientes do malte e de cerais não-maltados, que insolubilizam em temperatura baixa;

A simples filtração não garante nova precipitação portanto é necessário tratamento com proteases;

As proteases hidrolisam os peptídeos e impedem que eles se insolubilizem, evitando a turvação;

Em geral é usado papaínas pois tem baixa especificidade e hidrolisam peptídeos de diferentes fontes e tem baixo preço no mercado;

Uso de proteases na cerveja

Seu uso é permitido em alimentos Apresenta alta estabilidade térmica

permanecendo ativa após a operação e pausterização e ao longo de vida ativa ao longo da vida de prateleira

Chamado, no qual o uso de papaína vem sendo substituído pela aplicação de proteases microbianas

Formação de espuma na cerveja

A presença de proteínas é vital a formação de espuma em cervejas com alta massa molécula.

A adição de papaina não afeta a formação de espuma, pois as substâncias envolvidas nesse processo são moléculas complexas formada por resíduos de polipeptideos e polifenóis e carboidratos, além de fosfato, não constituindo substrato para a papaina.

Panificação

As farinhas de trigo para uso industrial são classificadas de acordo com seu conteúdo de proteínas Variam de 5 a 20% Essa variação deve-se a fatores genéticos. Ambientais e de manejo do trigo

Fração proteica do trigo: chamada glúten A força do glúten é uma função da concentração dessas proteínas e da sua composição Formada por dois constituintes básicos: Glutelina – proteína fibrilar se dispõem em forma de rede Gliadina – proteína globular que interage com a glutelina

Essas proteínas são a farinha a propriedade de formar uma massa visco elástica com capacidade de reter o ar.

GLÚTEN

A rede de glúten é formada por ligações do tipo de dissulfeto e quanto maior o numero dessas ligações mais difícil será trabalhar a massa;

A quantidade de proteína na farinha e a proporção de seus constituintes determinam as características de extensibilidade e de elasticidade da massa e do produto final;

Uma massa de pão que contem pouco glúten gerará um produto pouco macio incapaz de se expandir pela ação do gás produzido pelo fermento químico.

Com glúten

Sem glúten

Modificação do GLUTEN

As propriedade do glúten e redução da força pela adição de metabissulfito de sódio que torna a farinha mais adequada a finalidade desejada (produção de bolos, biscoitos, etc)

A utilização deste produto é regulamentada por legislação especifica para cada pais

Uma alternativa é utilizar proteases

Uso das proteases na panificação

As proteases modificam a rede proteica pela quebra das ligações peptídicas

A extensão da quebra depende do tipo de protease utilizada, sua concentração e do tempo de reação Fornece produto mais macio Menor densidade Aparência agradável Eliminina o sabor (after taste) provocado pelo metabissulfito

Uso de proteases na panificação

Na etapa de maceração mecânica a finalidade é o rompimento das cadeias polipeptídicas do glúten para que essa rede formada por essas proteases não impeçam o crescimento da massa;

As protease hidrolisa os constituintes do glúten reduz o tempo de trabalho mecânico em até 30%

As proteases utilizadas Aspergillus oryzae e A. ninger Consideradas seguras para o consumo; Apresentam baixa especificidade São menos ativas que as protease vegetais o que garante a

integridade do glúten

A aplicação das proteases é feita durante a fase de fermentação para que haja tempo para sua ação, uma vez que são inativas na temperatura do forno.

Cheiro e sabor de pão

A hidrólise enzimática permite a liberação de grupos –NH2 e –COOH pelo rompimento da ligação peptídica entre eles;

Esses grupos reagem com o açúcar usando da formulação ou o produzido pelo por -amilase responsável é o desenvolvimento do sabor e da cor

característico do pão (reação de Maillard) Utilizado a papaína ou bromelina, sendo a ultima mais efetiva, e

proteases neutra de Bacillus subtilis

Valor proteico das farinhas

Uso de proteases em farinhas com alto teor proteico, dará origem a produtos com valor

nutricional Em biscoitos do tipo cracker o uso de proteases de A. oryzae

permite a abertura homogênea da massa e evita deformação do pão no formo

Produção de bolos e waffers, que exigem farinhas com baixo conteúdo de proteínas o uso de proteases vegetais pode substituir a aplicação de metabissulfito de sódio