Animal trangenesis

Animales transgénicos, presente y futuro

González, G.

1

1Animales transgénicos, presente y futuro

Transgenic animals, present and future

González, G. ¹

RESÚMEN

La investigación actual en bioingeniería de animales, se orienta hacia el interés particular de aumentar el conocimiento sobre su genética y fisiología, a través del estudio de rasgos complejos controlados por muchos genes y del proceso biológico en cual participan, además, es importante conocer la interrelación con otros genes. Una vez se conoce sus funciones, se aplican técnicas de transferencia de genes, con el objeto de expresar caracteres en animales que representen beneficios para la producción agropecuaria y de material biológico de alto valor Industrial y medico. En la actualidad, se utilizan animales como biorreactores en la producción de proteínas plasmáticas, producción de anticuerpos, modelos para enfermedades en humanos y hasta xenotransplantes de órganos porcinos a pacientes humanos.

PALABRAS CLAVES: Bioingeniería, transferencia de genes, biorreactores, xenotransplantes.

1 D.M.V. Coordinador de Investigación, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, FUSM


González, G.

2

ABSTRACT

The current investigation in bioengineering of animals is orientated towards the particular interest of increasing the knowledge on genetics and physiology across the study of complex features controlled by many genes and the biological process in which they take part; in addition it is important to know the interrelationship with other genes. Once we know the functions, there are applied techniques of transfer of genes, in order to express characters in animals that should represent benefits for the farming production and biological material of high Industrial and medicate value. At present animals are in use as bioreactors in the production of plasmatic proteins, production of antibodies, models for diseases in human beings and up to xenotransplants of porcine organs to human patients. KEY WORDS: Bioengineering, transfer of genes, bioreactors, xenotransplants


González, G.

3

INTRODUCCIÓN Los organismos genéticamente modificados o más comúnmente denominados transgénicos son organismos vivos (plantas, animales o bacterias) manipulados genéticamente mediante la inserción de un gen que habitualmente no formaba parte de su material genético. La finalidad de esto es proporcionar a la planta o animal nuevas características productivas y hacerlos más eficientes y competitivos (Clark, 2002). Cameron et al. 1994 afirma que la definición de animal transgénico ha sido ampliada para incluir los animales que son resultado de la manipulación molecular de ADN endógeno genómico, incluyendo todas las técnicas de la microinyección de ADN de células madre embrionarias (ES) la transferencia de célula y la producción de ratón 'de golpe de gracia, en Concordancia con ello Chien, 1996; Majzoub y Muglia, 1996; Houdebine, 1998; Houdebine, 2002; Murray et al. 1999; Rao, 2000; Felmer, 2004 confirman que la Transgénesis es un procedimiento en el cual un gen o la parte de un gen de un individuo son incorporados al genoma del otro, la técnica transgénesis proviene de principios de los años 80, cuando varios grupos de investigación relataron el éxito en la transferencia génica y el desarrollo de ratones transgénicos (Gordon et al. 1980; Palmiter et al. 1982; Murray et al. 1999), a partir de la técnica de microinyección de ADN en el pronúcleo de cigotos, esta ha sido la

técnica más productiva y extensamente usada. Unos de los principales avances tecnológicos desde la producción inicial de transgénicos tanto plantas como animales han sido el desarrollo de métodos para la maduración vitro de oocitos (IVM), en la fertilización vitro (IVF) y el cultivo subsecuente de embriones inyectados antes de la transferencia a hembras de recipiente (Houdebine, 1998; Murray et al. 1999; Rao, 2000; Wall, 2002). Las prácticas en bioingeniería animal también abren la perspectiva de una producción más abundante de alimentos y material biológico de alto valor médico. Los animales transgénicos ofrecen potencialmente una vía para obtener proteínas terapéuticas (Velander, Lubon, Drohan, 1997) y suministrar los órganos necesarios para transplantes en seres humanos (Lanza, Cooper, y Chick, 1997). La manipulación genética permite diseñar modelos animales con el fin de estudiar y reproducir los síntomas de enfermedades humanas como la fibrosis cística y el enfisema pulmonar (Wilmut, 1998). Sin embargo, en la actualidad , aparte de la producción de productos farmacéuticos, los objetivos de la transgénesis animal han sido los mismos objetivos que para la genética cuantitativa y la cría selectiva: la producción eficiente (la eficacia de conversión alimenticia, la resistencia a las enfermedades parasitarias, mejorar el índice de crecimiento en condiciones de producción normales), la seguridad


González, G.

4

de alimentos (la resistencia a encefalopatías esponjiformes transmisible (TSEs), donde los resultados son preocupantes; mirar Houston et al., 2003)

Usando tecnología transgénica en el ratón, como el ARN de antisentido que codifica transgénesis, es ahora posible añadir un nuevo gene al genoma, aumentar el nivel de expresión o cambiar la especificidad de tejido de expresión de un gen, y disminuir el nivel de síntesis de una proteína específica. El retiro o la alteración de un gen existente vía la nueva combinación homóloga requirieron el empleo de células ES y fueron limitados con el ratón hasta el advenimiento de transferencia nuclear que reproduce procedimientos (Houdebine, 1998; Murray et al. 1999; Rao, 2000). Sin embargo, a pesar de los esfuerzos de muchos laboratorios, no se han descrito aún células madre embrionarias en otras especies distintas al ratón (Stice, 1998), lo que ha frenado muchas aplicaciones potenciales de esta tecnología en animales de granja. Esta situación se revirtió recientemente después del nacimiento de Dolly (Figura 1), el primer animal obtenido por transferencia nuclear de una célula adulta (Wilmut et al., 1997). Sin embargo, Polly la primera oveja transgénica obtenida por transferencia nuclear (Schnieke et al., 1997), y George y Charlie, los primeros terneros transgénicos obtenidos de la misma forma (Cibelli et al., 1998), son los que han marcado el curso de las investigaciones en este campo y conducirán el camino en el futuro. La

investigación con transgénicos se ha extendido para el beneficio de la salud humana y el mejoramiento de la producción pecuaria (Van Reenen et al., 2001).

FIGURA 1. Dolly: El primer mamífero clonado por transferencia nuclear desde una célula adulta.

METÓDOS DE TRASGÉNESIS Transformación genética mediante

microinyección

Niemann y Kues 2000 definen a la microinyección como la inyección física de una solución de ADN en el pronúcleo de un cigoto. Los primeros animales transgénicos fueron producidos hace ya casi 30 años mediante la microinyección de ADN viral (SV40) en la cavidad del blastócele de embriones de ratón (Jaenish y Mintz, 1974). En contraste, con estudios de transferencia nucleares, los experimentos de microinyección de ADN primero fueron realizados en el ratón


González, G.

5

(Izquierdo, 2001).En la década del 80 ocurrió un importante avance en la tecnología de animales transgénicos que marcó el curso de la investigación en este campo por al menos dos décadas. Gordon et al., 1981 describieron una técnica donde el ADN desnudo fue inyectado en el pronúcleo de un ovocito de ratón recientemente fertilizado, el que posteriormente se transfirió a hembras receptoras sincronizadas, este experimento demostró que era posible usar un plásmido recombinante como vector para transferir genes foráneos directamente hacia el embrión. El ADN inyectado de esta forma se integró en el genoma y pudo ser heredado por la descendencia de los animales transgénicos fundadores. Esto conllevo el acercamiento de La microinyección de embriones con el ADN para generar ganadería transgénica. La experimentación preliminar en ratones ha sido un componente crucial de cualquier experimento de transferencia génico en animales domésticos (Kerr y Wellnitz, 2003). La microinyección también es un método probado y relativamente simple para introducir el ADN en gusanos (Mello et al., 1991; Mello y Fuego, 1995). Además, la microinyección es un acercamiento muy eficaz a la interferencia de ARN y puede ser usado entregar mRNAs sintético u otras moléculas directamente a células (Kimble et al., 1982; Bossinger y Schierenberg, 1992; Evans et al., 1994). Este método fue ampliado por Hammer et al., 1985 a conejos, cerdos y oveja y más tarde a cabras,

vacas y ratas. En vertebrados inferiores e invertebrados, el pronúcleo no puede ser visualizado y el ADN debe ser inyectado en el citoplasma. Este acercamiento ha demostrado que es bastante eficiente para salmónidos. Rokkones et al., 1998 trasfirió un gen de una metaloproteína humana a huevos de salmón fertilizado.

Microinyección pronuclear Van Reenen et al., 2001 afirma, Con esta tecnología copias múltiples de un gen externo son introducidas en el pronúcleo de un óvulo o huevo fertilizado y es el método mas utilizado para la generación de trangénicos en animales domésticos. Algunas de las manipulaciones que se dan en esta metodología son: Colección y maduración in Vitro de oocitos, Fertilización in Vitro de los oocitos antes de la microinyección Cultivo in Vitro de los embriones después de la microinyección y transferencia de los embriones a los recipientes. Aquí el ADN es inyectado en un cigoto fertilizado, el estado genético es confirmado después del nacimiento y sólo una pequeña proporción de animales nace con la modificación genética. Gene target (ES cells): Células madre embrionarias (disponibles sólo en el ratón), son modificadas in vitro y luego microinyectadas en blastocistos, la modificación genética es transmitida por un ratón quimérico. Transferencia nuclear: Las células donantes de núcleo son primero transformadas y seleccionadas previo a la transferencia nuclear, todos los animales que nacen son transgénicos y todos los animales transmiten el


González, G.

6

transgen a la descendencia. (Figura 2).

Figura 2. Rutas para la producción de animales transgénicos (tomado de Felmer 2004) Limitaciones de la microinyección La técnica de microinyección no ha sido mejorada desde 1980 y es usada como tal a pesar de sus limitaciones fundamentales. De verdad, la microinyección es seguida de una integración mal controlada de ADN que conduce a una producción variable de animales transgénicos y la expresión a menudo imprevisible del transgenes. (Houdebine, 1998) El método confía en la integración arbitraria del ADN transgénico vía el reclutamiento de senderos de reparación de ADN celulares y deja un proceso sumamente ineficaz con las tarifas de éxito de sólo el 1-4 %.

Los senderos de reparación celulares también pueden fragmentarse el ADN, separando la codificación de regiones de promotores antes de la integración (Murnane et al. 1990). La eficacia de esta técnica es inferior o mucho más baja en animales grandes ya que la manipulación de embrión es más costosa y la integración de ADN foráneo es menos frecuente. La ineficiencia de este proceso es costosa, además hay pérdida deliberada de tiempo. Se tiene una estimación de 500,000 dólares (EE.UU) para generar una vaca que expresa un transgen (Wall et al. 1992). Además no hay ningún control del sitio de inserción o el número de


González, G.

7

las copias del transgen insertado en el genoma, ambos de cual puede variar enormemente entre individuos del mismo experimento. A pesar de todas estas desventajas el proceso todavía es usado generar animales transgénicos (Baldassarre et al. 2003; Behboodi et al. 2001) y está siendo mejorado por el empleo de tales técnicas como el coinyección de enzimas de restricción con el ADN para mediar la incorporación del transgen en el cromosoma (Thermes et al. 2002).

Uso de transposones o virus retrovirales

Los trasposones son descubiertos por Barbara McClintock Nobel en 1983 , son secuencias de DNA que pueden moverse en diversas posiciones dentro del genoma de una célula, causando un proceso de transposición. En el proceso, pueden causar mutaciones y cambiar la cantidad de DNA en el genoma. Los Transposones también se llaman los “genes que saltan” o los “elementos genéticos móviles”. Hay una variedad de elementos genéticos móviles, y pueden ser agrupados basándose en su mecanismo de la transposición. Se pueden Clasificar los elementos genéticos móviles de clase I, o los retrotransposones, los cuales tiene un movimiento en el genoma por la transcripción del RNA y entonces de nuevo obtiene un DNA por transcriptasa reversa mientras que los elementos genéticos móviles de la clase II se mueven directamente a partir de una posición a otra dentro del genoma usando un transposasa al “corte y empalme”. Los Transposones son muy útiles a los

investigadores como los medios de alterar la DNA adentro de un organismo vivo.

Transposones y retrovirus tienen la capacidad natural de integrarse en diferentes genomas bastante diferente. Los vectores, transposones y retrovirus al principio son transformados para retirar sus genes. Esto previene una diseminación incontrolada del vector y crea el espacio para introducir los genes de interés (Houdebine 2002) Houdebine 2002 reportó tres aplicaciones generales: transgénesis de la línea germinal, transgénesis de la célula somática/terapia del gene, y mutagénesis al azar. además los transposones son también una herramienta ampliamente utilizada para la mutagénesis en melanogaster del Drosophila, y una variedad amplia de bacterias para estudiar la función del gene. Una de esas transformaciones es la mariner mediada por la línea germinal del pollo, donde un elemento autónomo activo de la DNA fue inyectado.

Ventajas y limitaciones de los transposones

La capacidad de transposones de entregar un fragmento específico de la DNA en un sitio de la blanco sin la alteración de secuencias endógenas, con excepción de la inserción del vector del transposon, se podía así considerar una ventaja. Una desventaja de transgenesis por la transposición, podría ser el hecho de que las copias múltiples de un transgene no se pueden integrar en una posición por transgenesis, y así


González, G.

8

que puede ser difícil en algunos casos alcanzar la expresión muy alta de transgenes con este método. La presencia del transposon proporciona medios directos de identificar el alelo del mutante, concerniente a métodos químicos de la mutagénesis. La inserción de un transposon en un gene puede interrumpir a veces la función de ese gene de una manera reversible.

Otra técnica sumamente eficiente para transgenesis recientemente ha sido desarrollada basada en el empleo de vectores lentivirales para transformar oocytes de la vaca y el cerdo (Hofmann et al. 2003; Hofmann et al. 2004). Estos vectores son más eficientes que la microinyección en términos de tarifas de expresión y transformación. Una limitación es que el tamaño del transgene y el promotor interno tiene que ser menos de 8.5 kilobytes en el tamaño.

Utilización en Animales domésticos

El principal uso en animales domésticos es utilizarlos como birreactores con un único y exclusivo interés de expresar proteínas biomédicas en el tejido mamario, con la secreción de la proteína exógena en la leche. La colección de la proteína deseada envuelve la colección de la leche y la purificación de la proteína de la leche. También se ha estado aplicando a otros fluidos corporales como la orina o sangre (Van Reenen et al., 2001). otro es animales domésticos como donadores de órganos (xenotransplantes) Esto envuelve la donación de órganos a partir de animales “humanizados” por

transgenesis. Una de las principales estrategias es la prevención del rechazo de los órganos en los humanos como resultado de la activación del sistema inmune (Van Reenen et al., 2001).

Animales domésticos mejores productores. Esto va sujeto a los índices de producción como son el crecimiento y composición corporal, conversión alimenticia, calidad y cantidad en la leche, calidad y terneza en la carne, cantidad de pelaje o de la lana y resistencia a enfermedades. Otros aspectos de suma importancia en la transgenesis animal contemporánea es la introducción de genes que codifican la hormona del crecimiento o IGF-1 (Insulin growth factor 1) por otro lado se ha trabajado en la calidad de la lana en ovejas se ha intentado modificar mediante la introducción de genes que son utilizados en la síntesis de la lana, incluyendo keratina y enzimas utilizadas en la síntesis de cisteína e IGF-1, otro es transferir genes que modulan la respuesta inmune es la principal estrategia que se está utilizando en el área de la generación de animales genéticamente modificados para la resistencia a ciertas enfermedades (Van Reenen et al., 2001).

Tecnología de eliminación de genes (gene knock out).

La modificación genética que conduce a la pérdida de función de un gen, o más comúnmente conocida como gen knock out, ha sido utilizada extensivamente en el ratón para obtener un mayor entendimiento de la función génica y como modelo para ciertas enfermedades (Shastry, 1998;


González, G.

9

Kolb y col., 1999; Wallace y col., 2000).

En la actualidad existen serios problemas en la adquisición de donadores de órganos para transplante en humanos, la inmunología innata del receptor del órgano presenta una fuerte reacción de histocompatibilidad, esta es la principal barrera que consiste en el fenómeno de rechazo hiperagudo debido a la presencia de anticuerpos naturales contra epítopes del disacárido galactosa 1-3 galactosa presente en las superficies celulares de mamíferos, pero que estarían ausentes en las superficies celulares de humanos y monos (Gallili y col., 1985). El trasplante de órganos de animales hacia humanos (xenotrasplantes) podría ser la solución. La reciente generación de cerdos transgénicos en los que se eliminó el gen 1-3 galactosiltransferasa y que permitiría la producción de animales que carecen del epítope responsable del rechazo hiperagudo, es una clara demostración del poder de esta tecnología (Phelps y col., 2003).

CONCLUSIÓN

La producción de animales transgénicos nos representa muchos beneficios, el principal es que podemos estudiar, como los genes son regulados y como afectan la función y el desarrollo normal del cuerpo, así de esa forma, podemos emplear este conocimiento adquirido y darle el máximo del valor agregado, utilizando a los animales como potenciales biorreactores productores de proteínas de alto valor medico y

industrial, también creando modelos de mejora en la productividad o la resistencia de enfermedades humanas y animales, Muchos beneficios se pueden derivar del uso de animales genéticamente modificados, sin embargo debemos trabajar en la regulación del uso de esta tecnología concerniente principalmente al bienestar de los animales.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Bossinger, O., and Schierenberg, E. (1992). Cell-cell communication in the embryo of Caenorhabditis elegans. Dev.Biol. 151: 401–409.

Cameron, E.R.; Harvey, M.J. And Onions, D.E. 1994. Transgenic science. The British Veterinary Journal. 150(1): 9-24.

Chien, N., Kenneth, R. 1996. Genes and physiology: Molecular physiology in genetically engineered animals. Journal of Clinical Investigation. 97( 4): 901-909.

Cibelli, J., S. Stice, P. Golueke, J. Kane, J. Jerry, C. Blackwell, F. Ponce de leon, J. Robl. 1998. Cloned transgenic calves produced from nonquiescent fetal fibroblasts. Science 22:1256-8.

CLARK, A. 2002. Generation of transgenic livestock by pronuclear injection. Methods Mol. Biol. 180: 273-87.

Evans, T.C., Crittenden, S.L., Kodoyianni, V., and Kimble, J. 1994. Translational control of maternal glp-1 mRNA establishes an asymmetry in


González, G.

10

the C. elegans embryo. Cell 77: 83–194. Felmer, R. Animales transgénicos: pasado, presente y futuro. 2004. Archivos de Medicina Veterinaria. 36(2):105-117. Gallili, U., B. Macher, J. Buehler, S. Shohet. 1985. Human natural anti-alpha-galactosyl IgG. II. The specific recognition of alpha (1-3)-linked galactose residues. J. Exp. Med. 162: 573.

Gordon, J., W. Scangos, A. George, Plotkin, Diane J.; Barbosa, James A. And Ruddle, 1980.,Frank H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77(12): 7380-7384.

Phelps, C., C. Koike, T. Vaught, J. Boone, K. Wells, S. Chen, S. Ball, S. Specht, J. Polejaeva, J. Monahan, P. Jobst, S. Sharma, A. Lamborn, A. Garst, M. Moore, A. Demetris, W. Rudert, R. Bottino, S. Bertera, M. Trucco, T. Starzl, y. Dai, D. Ayares. 2003. Production of alpha 1,3-galactosyltransferase-deficient pigs. Science 299: 411-4.

Roberto E. Hammer, de vernon G. Pursel, caird E. Rexroad jr, pared de roberto J., perno de douglas J., karl M. Ebert, richard D. Palmiter y ralph I. Brinster. 1985. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature 315:680 – 683.

Honore, Bent; Ostergaard, Morten And Vorum, Henrik. 2004. Functional genomics studied by proteomics. Bio Essays. vol. 26, no. 8, p. 901-915.

Houdebine, L. 2002. Transgenesis to improve animal production. Livestock Production Science. 74(3):255-268.

Houston F, Goldmann W, Chong A, Jeffrey M, González L, Foster J, Parnham D, Hunter N. 2003. BSE in sheep bred for resistance to infection. Nature .423: 498.

Jaenish, R. 1976. Germline integration and Mendelian transmission of the exogenous Molonkey leukaemia virus. Proc. Natl. Acad. Sci. 73: 1260.

Kimble, J., Hodgkin, J., Smith, T., and Smith, J. (1982). Suppression of an amber mutation by microinjection of suppressor tRNA in C. elegans. Nature 299:456–458. Kolb, A., R. Ansell, J. Mcwhir, S. Siddell. 1999. Insertion of a foreign gene into the betacasein locus by Cre-mediated site-specific recombination. Gene. 227: 21-31. Lanza, R.P., Cooper, D.K Y Chick, W.l. 1997. Xenotransplantation, Scientific American, 54-59

Majzoub, J.A. and Muglia, L.J. 1996. Knockout mice. The New England Journal of Medicine.334(14): 904-907.

Mello, C., and Fire, A. 1995. DNA transformation methods. Cell Biol. 48: 451–482. Mello, C.C., Kramer, J.M., Stinchcomb, D., and Ambros, V. 1991. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10: 3959–3970


González, G.

11

Murray, J.D.; Oberbauer, A.M. and mcgloughlin, M.M. 1999. Transgenic animals in Agriculture. Davis CABI 304 p Palmiter, R.D.; Brinster, R.L.; Hammer, R.E.; Trumbauer, M.E.; Rosendfeld, M.G.; Birnberg, N.C. and Evans, R.M. 1982. Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothionein-growth hormone fusion genes. Nature. 300(5893): 611-615.

RAO, D.A. Introduction to transgenesis, an Overview. In: Proceedings of the 7th International Conference on Goats, Tours, (15th-18th May, 2000, Tours, France), INRA, IGA, ITOVIC eds. 2000, vol. 1, p. 30-35.

Rokkones E, Alestrøm P, Skjervold H and Gautvik K. M. 1988. Microinjection and expression of a mouse metallothionein human growth hormone fusion gene in fertilized salmonid eggs. Journal of Comparative Physiology B: Biochemical, Systemic, and Environmental Physiology. 158(6): 751 – 758.

Schnieke, A., A. Kind, W. Ritchie, K. Mycock, A. Scott, M. Ritchie, J. Wilmut, A. Colman, K. Campbell. 1997. Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts. Science 19: 2130-3.

Shastry, B.S. 1998. Gene disruption in mice: models of development and disease. Mol. Cell. Biochem. 1: 163-79.

Stice, S., J. Robl. 1988. Nuclear reprogramming in nuclear transplant rabbit embryos. Biol Reprod. 39: 657-64.

Stice, S. 1998. Opportunities and challenges in domestic animal embryonic stem cell research. In: Animal Breeding: Technology for the 21st Century. AJ. Clark, ed. Harwood Academic Press. 64-71.

Van Reenen. G.C., T.H.E. Meuwissen, H. Hopster, K. Oldenbroek, Th. A. M. Kruip, and H. J. Blokhuis. 2001. Transgenesis may affect farm animal welfare: A case for systematic risk assessment. J. Anim. Sci. 79:1763.

Velander, W.H., Lubon, H. Y Drohan, W.N. 1997. Transgenic Livestock as drug factories, Scientific American, 70-74. Wallace, H., R. Ansell, J. Clark, J. Mcwhir. 2000. Pre-selection of integration sites imparts repeatable transgene expression. Nucleic. Acids. 28:1455-64. Wilmut, I. 1998, Cloning for Medicine, Scientific American. 58-63 Wilmut, J., A. Schnieke, J. Mcwhir, A. Kind, K. Campbell. 1997. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 385: 810-3.


González, G.

12

Education

Animal trangenesis