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Entendiendo la deconstrucción de celulosa desde una perspectiva molecular y de proceso
Monica Santa-Maria
Cultivo para bioenergía
Célula vegetal
Pared celular vegetal
LigninaHemicelulosaCelulosa
Microfibrade Celulosa Monica Santa-Maria
Tina Jeoh
Biological and Agricultural Engineering Department
aCelulosade Celulosa
Moléculas de azúcar
Glucosa The evolutionary road to biofuels, JBEI (http://www.lbl.gov/Publications/YOS/Feb/)
Biocombustiblescombustibles líquidos renovables
• Alternativa sostenible a combustibles fósiles
• Biocombustibles de 1a
generación: cultivos de azúcar y almidón
Energía solar + CO2
pre-procesamiento
cosecha
biomasa
• Biocombustibles de siguiente
generación: biomasa celulósica(residuos agrícolas y forestales, desechos municipales sólidos, cultivos para energía)
– Materia prima más barata y abundante
http://www.jgi.doe.gov/education/bioenergy/co2cycle.jpg
CO2
CO2
CO2Biocombustiblesazúcares
Microbios fermentan azúcares hacia etanol
Enzymas rompen celulosa hacia azúcares
celulosa
pre-procesamiento
Biocombustibles de biomasa celulósica
• COSTO
– Conversión de polisacáridos estructurales a azúcares fermentables
– Costo de la enzima
• Se requieren mejoras en:
La compleja y heterogénea estructura de las lignocelulosas limita el acceso a enzimas y químicos
Limitante para su utilización masiva:
• Se requieren mejoras en:
– La enzima
– El proceso
Necesitamos entender la deconstrucción de biomasa a nivel molecular para optimizar enzimas y procesos
Pared cellular primaria tipo II (Carpita et al., 1993)
Hidrólisis enzimática de la celulosa
Reacción compleja y heterogénea con diferentes actividades enzimáticas que actúan sinérgicamente
Mecanismo de hidrólisis enzimática de lacelulosa
E + Sk−1
k+1
↔ES
k2
→E + αP
d[E]
dt= −k1 E[ ] S[ ]+ k−1 ES[ ]+ k2[ES]
d[S] = −k E[ ] S[ ]+ k ES[ ]
Hidrólisis de PASC por T. reesei Cel7A
d[S]
dt= −k1 E[ ] S[ ]+ k−1 ES[ ]
d[ES]
dt= k1 E[ ] S[ ]− k−1 ES[ ]− k2[ES]
d[P]
dt= k2[ES]
Reto: Definir “S” y medir [S]
Factores que impactan la actividad enzimática
• Acceso a sitios reactivos
– Topografía de la superficie
La velocidad de reacción disminuye prematuramente. ¿Posibles causas?
• Cristalinidad de la celulosa
• Grado de polimerización
• Sinergía enzimática
• Cambios en el sustrato durante la reacción
Impedimento stérico entre enzima unida productiva y no-productivamente como posible mecanismo de disminución de la velocidad de reacción (Väljamäe et al. 1998)
Estrategia: Monitorear cambios en el sustrato durante las reacciones enzimáticas
Solución tampón
Microfibras de celulosaMicroscopía de fuerza atómica (MFA)
Enzimas
Donde en la reacción se hicieron
Medimos azúcaresliberados
50nm
25
0
Área =10x10μm
Microscopía confocal láser cuantitativa
Donde en la reacción se hicieron
las observaciones?
Cuantificamos la enzima unida vía
intensidad de fluorescencia
Muestras de celulosa usadas en nuestros experimentos
Microfibra de celulosa, Cladophora sp
0.5x0.5 μm scan
20
0
5
10
15
nm
Cladophora aegagrophila 0.5x0.5 μm scan
1x1 μm scanImáges FESEM de células de A. xylinum incrustadas en y produciendo fibras de celulosa
Cladophora aegagrophila
Microfibra de celulosa bacteriana, Acetobacter xylinum
6
10
14 nm
-2
2
T. reesei Cel7A se agregó durante el scanning
Spectral Imaging Facility (http://neat.ucdavis.edu/pages/affiliate/ccoafm_main.htm)
Observaciones estructurales en microfibras de celulosa
0
10
20
30
40
50nm
Control sin digerir
Periodicidades topográficas observadas en microfibras de celulosa bacteriana
0
20
40
60
80nm
Agregados esféricos de celulosa observados en muestras de celulosa dispersada por sonicación
Celulosa de Cladophora sp
0
5x5 μm scan
20
0
5
10
15
nm
13.44% conversión con TrCel7A
1x1 μm scan
0
Celulosa de A. xylinum
1x1 μm scan 1x1 μm scan
1x1 μm scan 1x1 μm scan
0
20
40
60
80nm20
0
5
10
15
nm
M Santa-Maria and T Jeoh (2010) Biomacromolecules.11(8): 2000 - 2007
Cambios en la microestructura de la celulosa observados durante reacciones enzimáticas
20
0
5
10
15
nm
0
5
10
15
20
25nmReacciones en el MFA
Reacciones en lote
Cel
7A u
nida
(pm
oles
)
0
5
10
15
20
25nm
5.45.86.2
nm
Con
vers
ión
de c
ellu
losa
(%)
Tiempo (h)
Tiempo (h)
M Santa-Maria and T Jeoh (2010) Biomacromolecules.11(8): 2000 - 2007
Cambios en la microestructura de la celulosa observados durante reacciones enzimáticas
Reacciones en lote 20 min después de añadir TrCel7AReaccione
s en el MFA
Se necesita incorporar estas observaciones en modelos de mecanismo de reacción actuales
Cel
7A u
nida
(pm
oles
)
0
5
10
1520
25nm
13 h después de añadir TrCel7A
M Santa-Maria and T Jeoh (2010) Biomacromolecules.11(8): 2000 - 2007
Con
vers
ión
de c
ellu
losa
(%)
Tiempo (h)
Tiempo (h)
Hidrólisis de la celulosa en la naturaleza vs en un reactor
• En la naturaleza:– Mínima humedad
– Las enzimas son secretadas por hongos o bacterias en el punto de crecimiento
– Las mezclas sinérgicas de enzimas son secretadas en proporciones óptimas
Pila de compostaje
secretadas en proporciones óptimas
• En un reactor:– Las enzimas son adicionadas en
formulaciones líquidas
– Limitaciones de transferencia de masa
– Las enzimas tienen diferente afinidad y estabilidad
– Las mezclas no son óptimas en el lugar de reacción
SEM, superficie de una pila de compostajehttp://www.organicmattersmag.com/features/313-an-introduction-to-soil-biology-part-2-compost-and-compost-tea
Estrategia: Encapsular mezclas sinérgicas de enzimas
Secado por pulverización. Formulación de solución de enzimas: Patente pendiente
Enzimas (Novozymes Corp.):Celluclast ®, Novo 188 ®, NS 5003Proporción: 2:1:1.8 (v/v)
Propiedades de las partículas secadas por pulverización
Partículas secadas por pulverización conteniendo
mezclas sinérgicas de enzimas
�Enzima encapsulada �Enzima líquida
Alginatos sin entrecruzarAlginatos entrecruzados en la toberaAlginatos entrecruzados en la tobera, con enzimaAlginatos entrecruzados antes de la tobera
Vol
umen
(%)
Tamaño de partícula (µm)
La enzima encapsulada supera a la enzima líquida en sacarificaciones de biomasa
SDE: Enzima encapsulada (rojo), LE: Enzima líquida (azul)
4% sólidos 15% sólidos
‘Switchgrass’ pre-tratado:
Incubación, 50°C
Comentarios Finales
• Nivel molecular:
– La plataforma desarrollada permite investigar cambios en la microestructura de la celulosa durante la hidrólisis enzimática
– Las observaciones hechas se correlacionan con el grado de conversión de la celulosa
– Las observaciones hechas conducen a un mayor entendimiento – Las observaciones hechas conducen a un mayor entendimiento del proceso de deconstrucción de la celulosa
• Nivel de proceso:
– Sacarificación a escala de laboratorio
– Las enzimas encapsuladas superan a las enzimas líquidas
– Posibles causas: mejor distribución en el reactor, efecto protector
Jeoh Laboratory, Biological & Agricultural Engineering, UC Davis (October 2010)
Gracias por su atención¿Preguntas?