Лабораторна робота №1

Частина2. Методи мікроскопіювання

Метод фазово-контрастної мікроскопії дозволяє перетворити невидимі фазові зміни, що супроводжують проходження світлової хвилі через мікробну клітину, у видимі амплітудні і тим самим підвищити контрастність зображення.

Мікроскопія в темному полі заснована на висвітленні об'єкта косими променями світла. Спостерігач бачить на чорному тлі інтенсивно світні об'єкти, навіть якщо їхній діаметр у 10 разів менший, ніж роздільна здатність об'єктива.

Методи мікроскопії:

Люмінесцентна мікроскопія заснована на здатності ряду речовин біологічного походження і деяких барвників світитися під впливом падаючого на них світла. Викликати люмінесценцію можна або короткохвильовою частиною видимого спектра (синьо-фіолетові промені, = 460 нм), або ультрафіолетовими променями (= 360-380 нм). В обох випадках виникає кольорове зображення об'єкта.

Електронна мікроскопія. Електронні мікроскопи застосовують для вивчення об'єктів і структур, що знаходяться за межами видимості звичайних мікроскопів. Роль світлових променів в електронному мікроскопі грає пучок електронів, випромінюваних спеціальним джерелом - електронною гарматою. Зображення фокусується на спеціальному екрані.

Методи мікроскопії:

Інші сучасні методи дослідження клітин

Метод рентгеноструктурного аналізуМетод рентгеноструктурного аналізу заснований на явищі дифракції рентгенівських променів і дає можливість визначити просторове розташування молекул. Застосовується для вивчення структури білків, нуклеїнових кислот та інших речовин, що входять до складу цитоплазми і ядра клітини.

Методи цито- і гістохіміїМетоди цито- і гістохімії засновані на здатності барвників вибірково зафарбовувати хімічні речовини. Методи використовуються для вивчення хімічного складу тканин і клітин із збереженням їх структури, а також для визначення локалізації хімічних речовин. Наприклад, реакція Фельгена на ДНК або фарбування метиловим- зеленим-піроніном на нуклеїнові кислоти (метод Браше). В основі реакції Фельгена лежить кислотний гідроліз ДНК на зрізі фіксованої тканини, у процесі якого від ДНК відокремлюється альдегідна група, що і реагує з реактивом Шиффа (фуксинсерністою кислотою). У результаті ДНК хроматину надобуває яскравого червоно-фіолетового забарвлення. Під час фарбування за методом Браше піронін зв'язується із РНК, зафарбовує її в рожевий колір, а метиловий зелений зв'язується тільки із ДНК, зафарбовучи її в синьо-зелений колір.

Інші сучасні методи дослідження клітин

Метод диференціального центрифугуванняМетод диференціального центрифугування заснований на різній швидкості осадження (седиментації) окремих частинок під дією відцентрової сили й використовується для розділення внутрішньоклітинних структур. Коефіцієнт седиментації (S) визначається швидкістю руху макромолекул у полі із прискоренням, рівним І, виміряюється в одиницях, що мають назву СВЕДБЕРГИ (1 S = 110-13с). Для визначення S використовується центрифугування за умов високої швидкості (30 000...60 000 обертів/хв). Досліджуваний матеріал попередньо подрібнюють у гомогенізаторі. Для швидкісної седиментації використовується середовище однакової щільності (наприклад з СsCl2). Компоненти клітини, спочатку рівномірно розподілені по всьому обсязі пробірки (А), під час центрифугування осідають кожний зі своєю швидкістю (В). У результаті, уміст пробірки розділяється на фракції (шари), з яких нижній представлений найважчими структурами, а верхній – найлегшими (С).

Метод цитоспектрофотометріїМетод цитоспектрофотометрії заснований на тому, що інтенсивність поглинання променів прямо пропорційно концентрації речовини. За допомогою спеціального приладу (мікроспектрофотометра) вимірюється оптична густина пофарбованих цито- і гісто- хімічними методиками субстратів (нуклеїнових кислот, білків, вуглеводів, ферментів). Величина оптичної густини характеризує концентрацію досліджуваної речовини в структурах. Для кількісного аналізу необхідно знати площу й об’єм структур (ядер, цитоплазми), у яких вимірюється оптична густина субстрату. Кількість речовини виражається в умовних одиницях (ДНК можна виразити в одиницях плоїдності, якщо прийняти як стандарт сперматиди сім’яників (n) або лімфоцити крові (2n)). Метод застосовується для вивчення плоїдності ядер, для вивчення концентрації РНК, полісахаридів, білків та інших речовин в умовах розвитку патологічного процесу або за експериментального впливу.

Інші сучасні методи дослідження клітин

Метод гістоавторадіографії (авторадіографії)Метод гістоавторадіографії (авторадіографії) заснований на використанні радіоактивних ізотопів: тритію (Н3), сульфуру S35, карбону С14 та ін. Коли будь-яку речовину, що містить радіоактивний атом, вводять у живу клітину, то клітина використовує її нарівні з нерадіоактивними ізотопами для синтезу нових речовин. Сліди радіоактивних частинок реєструють шляхом нанесення світлочутливої емульсії на гістологічний препарат. У місцях проходження частинок світлочутлива емульсія засвічується, а після проявлення ці ділянки виглядають як чорні крапки (треки). Метод використовується для вивчення обмінних процесів (реплікації ДНК, синтезу білка) на клітинному й тканинному рівнях.

Інші сучасні методи дослідження клітин

Метод культивування клітин і тканинМетод культивування клітин і тканин заснований на вирощуванні (експлантації) ізольованих клітин, шматочків тканин, органів поза організмом (іn vіtro). Розрізняють клітинне, тканинне й органне культивування. При клітинному й тканинному культивуванні окремі клітини або шматочки тканини вирощують зануреними в поживне середовище Такий спосіб дозволяє зберегти морфологічну структуру клітин і тканин, що культивуються. Культури клітин дають можливість одержати однорідний клітинний матеріал у великих кількостях. На клітинних культурах можна вивчати фізичні й хімічні впливи. На культурах клітин розроблений комплекс спеціальних методів, у тому числі гібридизація соматичних клітин і утворення гетерокаріонів. При органному культивуванні клітини шматочки тканини або органа (найчастіше взяті в ембріона) вирощують на поверхні поживного середовища. Органне культивування дозволяє зберегти морфологічну структуру органу, що вирощується, властиву йому в умовах цілого організму. При цьому зберігається не тільки морфологічна структура, але й функціональні властивості тканини, що дозволяє спостерігати процеси диференціювання, виявляти дію біологічно активних речовин на культуру, простежити за динамікою змін, що виникають.

Інші сучасні методи дослідження клітин