Аналитическая биохимия: 02. Навыки экспериментатора и начала метрологии

Аналитическая биохимия / 2012

Лекция 2

Навыки экспериментатора.Количественные данныев биохимическом анализе.

Валерий Зайцев, к.б.н.ВолгГМУ, кафедра биохимии

Распространение и использование на условиях лицензииCreative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 3.0http://wiki.creativecommons.org/images/3/3a/Attribution_3.0_СС_BY-NC-SA_rus.pdf

CC BY-NC-SA 3.0 2012, В.Зайцев 2

Этапы биохимического аналитического эксперимента

• Выбор цели эксперимента

• Анализ знаний по проблеме

• Выбор объекта анализа и постановка аналитической задачи

• Выбор адекватного аналитического метода

• Выбор способа отбора (приготовления) и подготовки пробу

• Планирование хода эксперимента

• Подготовка к экспериментальным операциям

• Выполнение аналитического эксперимента

• Анализ экспериментальных данных

• Формирование выводов и оценка успешности эксперимента


Важнейшие навыки для экспериментатора

• Основные лабораторные умения

• Сохранение и передача лабораторных данных

• Поведенческие и социопсихологические аспекты

• Ситуационные умения

• Обеспечение и оценка завершенности и надежности данных

• Интеграция и прикладное применение опыта


Основные лабораторные умения

• Умение корректно и полностью выполнять рутинные лабораторные процедуры

• Умение придерживаться инструкций по технике безопасности в лаборатории, распознавать потенциально опасные ситуации и действовать соответствующим образом

• Умение обнаруживать и устранять логические несоответствия в лабораторных протоколах

• Умение проводить измерения и описывать неопределенные величины с необходимой точностью

• Умение переводить первичные экспериментальные данные в физически (биологически, клинически) значимую форму

• Умение применять приличествующие случаю методы анализа первичных экспериментальных данных

• Интеграция и прикладное применение опыта


Сохранение и передача лабораторных данных

• Умение вести ежедневный лабораторный журнал (включая необходимые документы, полученные из внешних источников) таким образом, чтобы в нем были отражены все существенные детали лабораторного процесса, необходимые для корректного воспроизведения любого из проведенных экспериментов

• Умение сообщать полученные результаты другим лицам четким и понятным образом

• Умение описывать полученные результаты с необходимой для понимания глубиной и правильным литературным стилем

• Умение находить релевантную (уместную, максимально соответствующую искомной проблеме) и современную информацию из различных (печатных, непечатных и электронных) источников


Поведенческие и социопсихологические аспекты

• Умение эффективно планировать улучшение лабораторного процесса на основании прогресса современных технологий анализа и обработки данных (включая повышение гарантий успешности лабораторных процедур)

• Умение учиться на ошибках (своих и чужих)

• Умение проявлять инициативу и самостоятельность в работе

• Умение эффективно работать в команде

• Умение находить компромиссы в планировании совместной или пересекающейся деятельности с другими людьми


Ситуационные умения

• Умение оценивать, понимать и интерпретировать полученные данные, а также эффективно и адекватно их докладывать

• Умение встраивать полученные данные в картину более общих представлений, оценивать применимость научных принципов к реальным ситуациям в окружающем мире и распознавать случаи, когда кажущиеся несущественными оплошности могут приводить к серьезным последствиям

• Умение объяснять и использовать принципы научного метода познания, включая концепцию необходимости и условий экспериментальной проверки сформулированных гипотез

• Умение понять и объяснять необходимость и принципы объективности в аналитических экспериментах

• Умение применять принцип «бритвы Оккама» и обоснованно отказываться от его применения.


Интеграция и прикладное применение знаний и опыта

• Умение интегрировать и применять информацию и опытные данные, полученные из научных знаний для своей текущей и будущей работы

• Умение применять критический анализ к своей повседневной работе в лаборатории

• Умение распознавать ситуации, когда полученные результаты и выводы на их основе имеют наиболее существенное значение.


Добросовестная (надлежащая) лабораторная практика

Добросовестная, или надлежащая, лабораторная практика (GLP – Good Laboratory Practice) – набор правил, выполнение которых гарантирует качество и надежность экспериментально полученных данных.


Законодательные системы GLP в мире

Наиболее известные и подробные системы GLP в области биомедицинских, фармакологических и токсикологических исследований реализованы в законодательном порядке:

США

• Code of Federal Regulation (CFR) Title 21 – Food and Drugs

• Chapter I – Fodd and Drug Administration? Department of Health and Human Services

• Part 58 – Good Laboratory Practice for Nonclinical Laboratory Studies

Великобритания

• The United Kingdom Good Laboratory Practice Monitoring Authority – Guide to UK GLP Regulations 1999


Добросовестная лабораторная практика в России

• СССР перед самым своим распадом – в апреле 1991 года – присоединился к международным концепциям, регулирующим добросовестную практику в области исследования лекарственных препаратов

• В России в 2005-2006 годах были опубликованы Руководства по экспериментальному (доклиническому) и по клиническому изучению новых лекарственных средств.

• ГОСТ Р 53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики»

• Однако, в отличие от многих развитых стран, в России принципы GLP законодательно не закреплены


Главные принципы GLP в применении к аналитике

• Каждая сторона, вовлеченная в исследование, должна обладать соответствующей квалификацией, оборудованием, навыками и опытом

• Вся информация должна быть документирована и храниться в таком порядке, чтобы ей всегда можно было воспользоваться с целью проверки, интерпретации данных или составления отчета

• Должны выполняться все системы процедур, обеспечивающих качество всех аспектов исследования. Лаборатория должна обладать системой обеспечения качества, включающей «стандартные операционные процедуры», внутренний и внешний контроли качества


Метрология: что это такое?

Метрология,– это наука об измерениях, охватывающая экспериментальное и теоретическое установление степени неопределенности в любых областях науки и техники. (Перевод определения* Bureau International des Poids et Mesures – Международного Бюро весов и мер) .

Bureau International des Poids et Mesures

* http://www.bipm.org/en/convention/wmd/2004/


Метрология: термины и определения

• International Vocabulary of Metrology – Basic and General Concepts and Associated Terms

• Разрабатывается Joint Committee for Guides in Metrology (JCGM)

• В настоящее время действует исправленная версия 3-го издания

http://www.bipm.org/en/publications/guides/vim.html


Международная систем единиц

Международная система единиц (СИ, SI), система единиц физических величин, принятая 11-й Генеральной конференцией по мерам и весам (1960). СИ разработана с целью замены сложной совокупности систем единиц и отдельных внесистемных единиц, сложившейся на основе метрической системы мер, и для упрощения пользования единицами. В 1982 году введена на территории СССР (ГОСТ 8.417–81). В области медицины официально введена в СССР только в 1989 году. Однако многие устаревшие единицы в российской медицине используются до сих пор.


Основные единицы системы СИ

мольмольКоличество вещества

кдканделаСила света

КкельвинТермодинамическая температура

АамперСила электрического тока

ссекундаВремя

кгкилограммМасса

мметрДлина


Метрология в законодательстве РФ

• Обеспечение единства измерения и единообразия средств измерения является необходимым предварительным условием для того, чтобы мы могли сравнивать результаты, полученные в различных лабораториях и различными операторами.

• Федеральный закон Российской Федерации от 26 июня 2008 года № 102-ФЗ «Об обеспечении единства измерений» (вступил в силу с 1 января 2009 года)

• Федеральный закон Российской Федерации от 22 декабря 2002 года № 184-ФЗ «О техническом регулировании» (действующая редакция от 28 сентября 2010 года вступила в силу 30 сентября 2010 года)

• Дополнительные (подзаконные) нормативные требования


Критерий повторяемости опыта

«Истинным признается тот опыт, результаты которого (с учетом ошибки измерения) одинаковы при соблюдении четко обозначенных условий»

Для того, чтобы делать те или иные выводы из полученных нами экспериментальных данных, мы, в первую очередь, не должны иметь сомнений в соответствии полученных результатов реальным характеристикам анализируемых объектов. Фактически, только уверенность в надежности результатов измерений может дать уверенность в правильности оценок, основанных на этих измерениях.


Концепция неопределенности измерений

Результат

измеренияВероятное значение


Выражение неопределенности/неточности измерений

• Evaluation of measurement data – Guide to the expression of uncertainty in measurement

• Разрабатывается Joint Committee for Guides in Metrology (JCGM)

• В настоящее время действует версия 2008 года

• Содержит ряд приложений и дополнений

http://www.bipm.org/en/publications/guides/gum.html


Принципы точности


Принципы точности: погрешности

• Погрешность измерений – разность между измеренной величиной и её истинным значением. Показывает, насколько измеренное значение отличается от истинного (правильность измерений).

• Погрешности измерений подразделяются:

• По способу выражения: абсолютные и относительные

• По характеру изменения: систематические и случайные

• По источнику возникновения: инструментальные и методические

• В зависимости от изменения измеряемой величины: аддитивные и мультипликативные

«Измерить нужно не столь точно, насколько это возможно, а так точно, как это необходимо»


Типы погрешностей по способу выражения

Абсолютная погрешность

Относительная погрешность


Случайные и систематические погрешности


Случайные и систематические погрешности

• Аналитическая серия – совокупность измерений, выполняемых в один день, одним оператором и без изменения настроек и калибровки прибора, без смены реактивов и без изменения каких-либо иных компонентов аналитической системы.

• Клинически значимая ошибка – уровень ошибки, который может повлиять на диагноз, прогноз или план лечения пациента.

• Случайная ошибка – любое случайное отклонение при измерениях. По сути своей является непредсказуемой.

• Систематическая ошибка – тенденция или смещение от истинного значения. Систематическая ошибка действует постоянно или периодически (регулярно). Действие систематической ошибки обычно сохраняется до тех пор, пока не будут предприняты успешные меры по её устранению.

• Дрейф и смещение (сдвиг) – в зависимости от скорости изменений величины погрешности.


Свойства нормального (Гауссова) распределения

Функция Лапласа

Вероятность, что случайная погрешность не превышает указанных величин:

99,73%

95,44%

68,26%


Помахи (грубые ошибки)

• Грубые промахи – погрешности, которые при исправных средствах измерения и корректных действиях оператора вовсе не должны появляться, а если возникают, то легко распознаются и исключаются.

• Грубая погрешность, или промах, – это погрешность результата отдельного измерения, которая для данных условий резко отличается от остальных результатов аналитической серии. Источником промахов обычно бывают субъективные ошибки оператора.

• Грубые погрешности, как правило, возникают при однократных измерениях и обычно устраняются путем повторных измерений.

• Промахи – отсчеты, которые хотя и не входят в компактную группу основной массы отсчетов выборки, но и не удалены от нее на значительное расстояние.

• При однократных измерениях обнаружить промах не представляется возможным. При многократных измерениях для обнаружения промахов используют статистические критерии.


Причины промахов

Промахи могут быть обусловлены:

• Неправильным использованием измерительных приборов и инструментов.

• Ошибками при выполнении отсчетов величин на измерительных приборах.

• Ошибками в записях экспериментальных данных.

• Ошибками в вычислениях при обработке результатов измерений.


Выявление и отбраковка промахов

Способы выявления и отбраковки промахов:

• Правило «трех сигм».

• Q-критерий или вариационный критерий Диксона.

• Критерий Романовского.

• Метод Башинского.

• Метод Греббса – Смирнова.

• Критерий Ирвина.

• Критерий Шовине.

• И другие

См. например, пособие: Л.Н.Третьяк «Обработка результатов измерений» http://window.edu.ru/window_catalog/files/r19574/metod474.pdf

P.S.

Но всегда ли нужно и можно отбрасывать данные, кажущиеся промахами?


Свойства нормального (Гауссова) распределения

Функция Лапласа

Вероятность, что случайная погрешность не превышает указанных величин:

99,73%

95,44%

68,26%


Правило «трех сигм»

Если приемлема надежность 99,7% (из свойств Гауссова распределения), то все значения случайно величины, отклоняющиеся от среднего арифметического больше, чем на 3σ, отбрасываются как мало вероятные.

Пример. Если

используется при объеме выборки n > 20 (оптимально n ≥ 50)

( ) ( )880,0x628,0

042,03754,0x042,03754,0

.85,0x67,0x;042,0;754,0x

i

i

maxmin

≤≤⋅+≤≤⋅−===σ=

Использование правила требует нормального распределения в выборке!

xi SxX 3>−


Вариационный Q-критерий Диксона

Удобный и достаточно мощный критерий, но ряд авторов считает, что он неприменим при n < 5. Для расчета результаты наблюдений располагаются в вариационный ряд:

используется для малых выборок – от 3 до 1-12 значений

( )nn xxxxxx <<< 2121 ,,,

( ) ( )11 xxxxQ nnn −−= −Далее вычисляется величина

или

Рассчитанную величину Q сравнивают с табличным значением Qp. Если

Q < Qp, то проверяемое измерение оставляют в выборке. Если же,

наоборот, Q > Qp, то проверяемое измерение отбрасывают.

( ) ( )112 xxxxQ n −−=

Для каждой выборки тест может быть использован только ОДИН раз!


Вариационный Q-критерий Диксона

* Dean R.B., Dixon W.J. Simplified Statistics for Small Numbers of Observations. Anal. Chem. 1951; 23(4): 636-638. http://depa.pquim.unam.mx/amyd/archivero/ac1951_23_636_13353.pdf


Модификация Q-критерия для повышения мощности

* Rorabacher D.B. Statistical treatment for rejection of deviant values: critical values of Dixon's "Q" parameter and related subrange ratios at the 95% confidence level. Anal. Chem. 1991; 63(2): 139-146. http://depa.pquim.unam.mx/amyd/archivero/ac1991_63_139_13354.pdf



* Rorabacher D.B. Anal. Chem. 1991; 63(2): 139-146. http://depa.pquim.unam.mx/amyd/archivero/ac1991_63_139_13354.pdf

















Критерий Романовского

Для применения критерия необходимо вычислить соотношение:

используется при объеме выборки n ≤ 20

Если

Полученная величина сравнивается с табличным значением

то проверяемое значение считают промахом.

υ=−

x

i

S

Xx

Pυ

Pυ≥υ

Табличные значения можно, например, посмотреть в:

Третьяк Л.Н. Обработка результатов наблюдений. Оренбург, 2004.

http://window.edu.ru/window_catalog/files/r19574/metod474.pdf


Метод Башинского

считается корректным для выборок размером от 6 до 68 значений

Определяются предельно возможные максимальные (lim xmax) и минимальные (lim xmin) значения случайной величины в выборке по следующим формулам:

31032,2777107,6 −⋅+=nK Б

где КБ – критерий С.В. Башинского, который определяется по формуле

( )( ) , xlim

, xlim

minmaxmin

minmaxmax

xxKxxK

Б

Б

x

x

−−=

−+=


Метод Греббса – Смирнова

исключение резко выделяющихся замеров производится с помощью безразмерных статистических критериев ξmax и ξmin

применим для выборок размером от 5 до 149 значений

σξ

σξ min

minmax

max ,xxxx −=−=

( )

( )3

1,00

33

05,00

1013,7522522,3

ln1027,2

1091,87678,1

ln10998,78exp

−

−−

⋅+−=

⋅+−⋅=

nn

nn

ξ

ξ

Если расчетные значения статистического критерия ξmax (ξmin) > ξ0, то xmax > (xmin) отбрасываются, как содержащие грубую ошибку


Возможные источники случайных ошибок

1. Перебои в электропитании

2. Повторное внесение калбратора/эталона/контрольного материала

3. Ошибки в идентификации анализируемых образцов (например,

перепутаны проба и калибратор)

4. Ошибки в дозировании проб и компонентов аналитической системы

5. Вспенивание образцов / реагентов

6. Неправильное приготовление реагентов / калибратора

7. Ошибки в пробоподготовке анализируемого материала

8. Использование воды / растворителей, непригодных для приготовления

реагентов / калибратора / контрольных материалов

9. Ошибки в работе оператора


Возможные источники систематических ошибок

1. Неправильные настройки дозирующих инструментов

2. Дрейф/смещение температуры термостата

3. Несоответствующая температура/влажность при измерениях

4. Нарушение условий и/или сроков хранения образцов / реагентов /

калибратора / контрольных материалов

5. Порча реагентов / калибратора / контрольных материалов при

транспортировке / использовании

6. Загрязнение фильтров / трубопроводов / оптических компонентов

аппаратуры

7. Устойчивое нарушение функционирования измерительных приборов

(инструментов)

8. Смена оператора (преимущественно для ручных операций)


Метрологическая отслеживаемость (traceability)

Метрологическая отслеживаемость – это:

• характеристика результата измерения, позволяющая привести его к существующими референтным мерам измерений через неразрывающуюся цепь последовательных сравнений.

В чем смысл?

• Уровень отслеживаемости определяет степень сопоставимости измерений: можно ли результат некоего измерения сравнить с предыдущим, или с измерением, сделанным год назад в этой же лаборатории, или с результатом такого измерения, сделанным когда угодно и где угодно в мире.

Чаще всего приемлемый уровень отслеживаемости достигается использованием калибровки.


Калибровка (калибрование)

Калибровка – это набор операций для установления соответствия между значением количественной величины, измеренной прибором (инструментом), и эталонным (стандартным) значением оцениваемой величины.

Необходимой основой является знанение общей теории измерения. Проблемы калибровки рассматриваются в лекции № 3.

Education

Аналитическая биохимия: 02. Навыки экспериментатора и начала метрологии