1
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
MEDICINOS FAKULTETAS
KARDIOLOGIJOS INSTITUTAS
MOLEKULINĖS KARDIOLOGIJOS LABARATORIJA
Gintarė Martinkutė
6 kursas, 24 grupė
Varfarino farmakogenetika : CYP4F2 (G1347A)
genotipo svarba dozuojant varfariną po širdies vožtuvų
operacijos
Mokslinis darbas
Darbo vadovas:
Dr. Vacis Tatarūnas
Kaunas, 2016
2
Turinys
1. Santrauka ..................................................................................................................................... 3
2. Summary ...................................................................................................................................... 4
3. Padėka .......................................................................................................................................... 5
4. Interesų konfliktas ....................................................................................................................... 5
5. Etikos komiteto leidimas ............................................................................................................. 5
6. Santrumpos .................................................................................................................................. 6
7. Įvadas ........................................................................................................................................... 7
8. Darbo tikslas ir uždaviniai ........................................................................................................... 8
9. Literatūros apžvalga .................................................................................................................... 9
9.1 Antikoaguliantai ..................................................................................................................... 9
9.2 Varfarino reikšmė po širdies vožtuvų operacijų .................................................................... 9
9.3 Varfarino veikimo mechanizmas ......................................................................................... 10
9.4 Varfarino farmakokinetika ................................................................................................... 11
9.5 Varfarino farmakokinetika, nulemta gretutinių veiksnių ..................................................... 12
9.6 Varfarino farmakodinamika ir VKORC1 genotipas ............................................................ 13
9.7 Farmakogenomika ............................................................................................................... 13
9.8 Uždegiminių veiksnių įtaka varfarino efektyvumui ............................................................ 14
10. Laboratorinių genetinio ištyrimo metodų apžvalga ................................................................. 16
10.1 DNR - dezoksiribonukleorūgštis ....................................................................................... 16
10.2 DNR - išskyrimas ............................................................................................................... 17
10.3 DNR kokybės ir koncentracijos nustatymas ...................................................................... 17
10.4 Genotipo tyrimas polimerazės grandinės reakcijos metodu .............................................. 18
11. Ekspermentinė dalis ................................................................................................................. 19
11.1 Tyrimo metodika ................................................................................................................ 19
11.2 Tyrimo metodai .................................................................................................................. 20
11.3 Statistinė analizė ................................................................................................................ 23
12. Rezultatai ................................................................................................................................. 33
13. Rezultatų aptarimas ................................................................................................................. 33
14. Išvados ..................................................................................................................................... 36
15. Praktikinės rekomendacijos ..................................................................................................... 36
16. Literatūros sąrašas ................................................................................................................... 37
3
1. Santrauka
Darbo tikslas – įvertinti genetinių (CYP2C9 *2, *3 ir VKORC1 *2, *3, CYP4F2 (G1347A)
genotipų) ir klinikinių veiksnių įtaką parenkant varfarino dozę po širdies vožtuvų operacijos įsotinimo
ir ilgalaikio gydymo metu. Iškelti uždaviniai padės nustatyti CYP2C9 *2, *3 ir VKORC1 *2, *3,
CYP4F2 (G1347A) genotipų ir klinikinių veiksnių įtaką.
Darbo metodika. 175 pacientai, po širdies vožtuvų operacijų, buvo ištirti varfarino
įsotinimo metu. Antro tyrimo metu, t.y praėjus 3 mėnesiams, ištirti 113 pacientų. Iš ligos istorijų buvo
renkama ši informacija - antropometriniai, klinikiniai duomenys (biocheminiai rodikliai, naudojami
vaistai, turimi žalingi įpročiai) ir kraujo krešumo rodiklis - tarptautinis normalizuotas santykis (TNS,
angl. INR). Visiems pacientam atliktas šių genų: CYP2C9 *2 (rs1799853) ir *3 (rs1057910),
VKORC1 *2 (rs9934438), VKORC1 *3 (rs7294) bei CYP4F2 (G1347A) genotipo tyrimas tikro
laiko polimerazės grandininės reakcijos metodu. Statistinės analizės atlikimas - kiekybiniai
kintamieji, pasiskirstę pagal normalųjį skirstinį, pateikti vidurkiais ir standartiniais nuokrypiais
(vidurkis ± SN). Dažnis pateiktas procentais (proc.). Skirtumas laikytas statistiškai reikšmingu, jei
reikšmingumo lygmuo p<0.05.
Darbo rezultatai. Varfarino įsotinimo metu pacientams, po širdies vožtuvų operacijų,
naudojantiems amiodaroną, buvo reikalingos mažesnės dozės negu jo nevartojatiems. Esant stabiliai
varfarino dozei, pacientams buvo reikalingos mažesnės varfarino dozės, jeigu jie vartojo bent vieną
iš šių medikamentų - torazemidą, kalcio kanalų blokatorius ar benzodiazepinus. Pacientai ilgalaikio
gydymo metu su padidėjusiu kreatinino kiekiu ar padidėjusiu šarminės fosfatazės aktyvumu vartojo
mažesnes varfarino dozes nei esant normos rodikliams. Pacientams, turintiems žalingų įpročių
(rūkymą ar alkoholio vartojimą), nuolatos vartojant varfariną buvo reikalingos didesnės dozės. Be
klinikinių faktorių varfarino dozėms įtakos turėjo šie genotipai tiek įsotinimo metu, tiek pastovaus
vartojimo : CYP2C9*1*3 heterozigotai naudojo mažesnes varfarino dozes negu laukinio tipo
homozigotai, VKORC1 C1173T C/C genotipą turintiems reikėjo didesnių varfarino dozių negu C/T
ir T/T genotipo turėtojiems, VKORC1 G3730A G/G genotipo turėtojai vartojo mažesnes varfarino
dozes nei A/A turintys ligoniai. Tik varfarino įsotinimo metu reikšmingos įtakos turėjo CYP4F2
G1347A - G/G genotipą turintys pacientai vartojo mažesnes dozes negu A/A genotipo turėtojai.
Išvados. Varfarino dozavimui įtakos turi klinikiniai faktoriai: kreatinino kiekis bei šarminės
fosfatazės aktyvumas, medikamentai - amiodaronas, torazemidas, kalcio kanalų blokatoriai,
benzadiazepinai, paciento žalingi įpročiai (rūkymas, alkoholio vartojimas). Varfarino dozavimui
taipogi įtakos turi šie genotipai : CYP2C9*1*3, VKORC1 C1173T, VKORC1 G3730A ir CYP4F2
G1347A.
4
2. Summary
Objective and tasks. Evaluate and determine whether CYP2C9 *2, *3, VKORC1 *2, *3
and CYP4F2 G1347A genotypes and clinical factors contribute to warfarin dosage in patients after
heart valve surgeries.
Methods. During the initiation of warfarin therapy, 175 patients, who had heart valve
surgeries, were included in the study. During the long term treatment, 113 patients were examined.
Medical records were used to collect the following information: anthropometric data, clinical data
(biochemical tests, used medications, addictions) and patient INR results. Genomic DNA was
extracted from peripheral blood. The real – time polymerase chain reaction was used to detect
CYP2C9 * 2 (rs1799853) and *3 (rs1057910), VKORC1 *2 (rs9934438), VKORC1 *3 (rs7294) and
CYP4F2 G1347A genotypes. Statistical analysis – results are presented as mean and standard
deviation (mean ± SD). A p≤0,05 was taken as statistically significant. Frequency of genotypes and
alleles in patient’s sample is presented in % (percent).
Results. For patients, recovering after heart valve surgeries and using amiodarone during
initiation, lower doses of warfarin were needed as compared to patients who didn’t use amiodarone.
During the long – term treatment period, the users of torasemide, calcium channel blockers and
benzodiazepines, required less warfarin as compared to non-users. During the long term warfarin
treatment, patients with elevated creatinine or elevated alkaline phosphatase activity, received less
warfarin as compared to patients with normal levels. Patients with addictions (smoking and alcohol
consumption) required higher doses of warfarin. Besides clinical factors, warfarin dosage was
influenced by these gene polymorphisms (during initiation of the warfarin therapy and also during
the long term treatment): CYP2C9*1*3 heterozygous used less warfarin as compared to wild-type
homozygous, VKORC1 C1173C carriers required higher doses of warfarin than C/T and T/T
genotype carriers, VKORC1 G3730G carriers required lower doses of warfarin compared to A/A
genotype carriers. Only during initiation the carriers of CYP4F2 A1347A required more warfarin, as
compared to CYP4F2 G/G cariers.
Conclusions: Dosage of warfarin is influenced by clinical factors: the amount of serum
creatinine and the activity of alkaline phosphatase, medications - amiodarone, torasemide, calcium
channel blockers, benzadiazepines, patient addictions (smoking, alcohol consumption). Also when
determining the dosage of warfarin, these genotypes are significant: CYP2C9 * 1 * 3, VKORC1
C1173T, VKORC1 G3730A and CYP4F2 G1347A.
5
3. Padėka
Už palaikymą, naudingus patarimus, taiklią kritiką dėkoju darbo vadovui Vaciui Tatarūnui.
4. Interesų konfliktas
Interesų konflikto nebuvo.
5. Etikos komiteto leidimas
Gauti Kauno regioninio biomedicininių tyrimų etikos komiteto (KRBTEK) leidimai –
2014-06-30 Nr. BE-2-25 ir 2017-12-04 Nr. BE-2-50
6
6. Santrumpos
AKFI – angiotenziną konvertuojančio fermento inhibitorius (slopiklis)
ALT - alaninaminotransferazė
ARA – arachidono rūgštis
AST - aspartataminotransferazė
CD – cukrinis diabetas
CYP3A4 - citochromo P450 superšeimos3 šeimos A pošeimio 4 polipeptidas
CYP2C19 – citochromo P450 superšeimos 2 šeimos C pošeimio 19 polipeptidas
CYP2C9 – citochromo P450 superšeimos 2 šeimos C pošeimos 9 polipeptidas
CYP4F2 – citochromo P450 superšeimos 4 šeimos F pošeimio 2 polipeptidas
DATL – dalinis aktyvintas tromboplastino laikas
DNR – dezoksiribonukleino rūgštis
EDTA - etilendiamino tetraacetatas
GFG – glomerulų filtracijos greitis
HETE – hidroksieikozatetraeno rūgštis
HPETE - hidroksiperoksieikosatetraenoinė rūgštis
IC50 – vaisto afinitetas
IFN – inkstų funkcijos nepakankamumas
Imax – maksimalus vaisto slopinimo faktorius
KMI – kūno masės indeksas
LTB4 – leuktrienas B4
PGR – polimerazės grandinės reakcija
PT – protrombino laikas
RNR - riboksinukleorūgštis
SPA – Stago protrombino indeksas
ŠF – šarminė fosfatazė
TNS – tarptautinis normalizuotas santykis
TSH – tirotropinis hormonas
TxA2 – tromboksanas A2
VKOR – vitamino K epoksido reduktazė
VKORC1 – vitamino K epoksido reduktazės komplekso 1-as subvientas
7
7. Įvadas
Varfarinas (vitamino K antagonistas) – vienas populiariausių antikoaguliantų pasaulyje,
naudojamas pirminei ir antrinei veninių ir arterinių tromboembolijų profilaktikai ir gydymui atlikus
širdies vožtuvų operacijas. Šiuo metu daugėja pacientų po širdies vožtuvų protezavimo operacijų.
Nepaisant to, kad varfarinas naudojamas daugiau kaip 50 metų, iki šiol lieka vienu efektyviausių
antikoaguliantų. Varfarinas turi ir keletą trūkūmų – siaurą terapinį langą, uždelstą veikimo pradžią ir
pabaigą, sąveikauja su vaistais bei maistu, todėl klinikinėje praktikoje tinkamas šio vaisto paskyrimas
yra sudėtingas [52,57]. Vitamino K antagonistų poveikis turi būti periodiškai vertinamas tiriant
tarptautinį normalizuotą santykį (TNS, angl. INR), tiek įsotinimo dozė, tiek nuolatinio vartojimo metu
dozė parenkama kiekvienam pacientui individualiai [57]. Po širdies vožtuvų operacijų siekiamas TNS
dažniausiai yra nuo 2 iki 3, bet tai gali priklausyti nuo protezuojamo vožtuvo. Po mitralinio
mechaninio vožtuvo protezavimo rekomenduojama TNS 2,5 – 3,5, po biologinių vožtuvų
protezavimo bei po aortos mechaninio vožtuvo protezavimo 2-3 [53,59,62].
Žalingi įpročiai (pvz.: rūkymas), maistas, kuriame gausu vitamino K, o taip pat tos
medžiagos, kurios slopina arba, priešingai, skatina varfarino metabolizme dalyvaujančių fermentų
aktyvumą [27,41,42], gali daryti įtaką vartojamo varfarino dozei. Antropometriniai duomenys (pvz.:
kūno svoris ir kt.), klinikiniai faktoriai (pvz.: kreatinino kiekis ir kt.) ir naudojami medikamentai yea
svarbūs varfarino metabolizmui bei efektyvumui [38]. Dirbtinė kraujo apytaka operacijos metu,
žaizdų infekcijos pooperaciniu periodu, uždegimo stiprumas turi įtakos dozuojant varfariną [54].
Varfarino poveikiui labai svarbus ir paciento genetiškai nulemtas fermentų aktyvumas. Jau
eilę metų žinoma - varfarino metabolizmas priklauso nuo CYP2C9 fermento geno polimorfizmo.
Alelių variantai – *2 ( rs1799853) ir *3 ( rs1057910) lemia sumažėjusią šio fermento funkciją ir
sumažėjusį varfarino metabolizmą bei jo pasišalinimą iš organizmo [1]. Nemažiau svarbus ir
VKORC1. Varfarinas blokuoja VKORC1 aktyvumą ir stabdo vitamino K epoksido redukciją, kuris
reikalingas aktyvių kraujo krešėjimo sistemos faktorių gamybai. Europiečių ir Azijiečių populiacijose
reikšmingi yra *2 ir *3 aleliai: G1639A (rs9923231) ir G3730A (rs7294) [53] [2]. Pastebėta, kad be
šių fermentų varfarino dozavimui įtakos turi CYP4F2. Šis fermentas dalyvauja uždegimo procese,
taip pat gali vitamino K1 formą versti į neaktyvią ir taip paveikti krešėjimo procesą. CYP4F2
aktyvumui didelę įtaką daro G1347A (rs2108622) polimorfizmas. Ne vienodą genotipą turintys
žmonės vartoja skirtingas varfarino dozes [7].
8
8. Darbo tikslai ir uždaviniai
Darbo tikslas : Įvertinti genetinių (CYP2C9 *2, *3 ir VKORC1 *2, *3, CYP4F2 (G1347A)
genotipų) ir klinikinių veiksnių įtaką parenkant varfarino dozę po širdies vožtuvų operacijos.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti klinikinių veiksnių įtaką ligoniams, kuriems skiriama įsotinimo ir ilgalaikio gydymo
varfarino dozė, po širdies vožtuvų operacijų.
2. Nustatyti CYP2C9 *2, *3 ir VKORC1 *2, *3 genotipų įtaką ligoniams, kuriems skiriama
įsotinimo ir ilgalaikio gydymo varfarino dozė, po širdies vožtuvų operacijų.
3. Nustatyti CYP4F2 (G1347A) genotipo įtaką ligoniams, kuriems skiriama įsotinimo ir
ilgalaikio gydymo varfarino dozė, atlikus širdies vožtuvo operaciją.
9
9. Literatūros apžvalga
9.1 Antikoaguliantai
Trombozės profilaktikai ir gydymui daugelį dešimtmečių vartojami antikoaguliantai: ūminės
trombozės atvejais – parenteriniai (heparinas ir jo dariniai), ilgalaikiam gydymui – geriamieji
antikoaguliantai. Vienas iš populiariausių geriamųjų antikoauguliantų jau ilgą laiką yra varfarinas.
Deja, vitamino K antagonistai turi keletą trūkumų, kurie klinikinėje praktikoje riboja saugų ir
efektyvų gydymą šiais vaistais. Jie pasižymi uždelsta veikimo pradžia ir pabaiga. Vitamino K
antagonistų poveikis turi būti periodiškai vertinamas tiriant TNS, o dozė parenkama pagal sudėtingą
dozavimo schemą. Šios grupės vaistams būdingos siauros terapinio poveikio ribos, sąveika su
vaistais, maisto produktais. Pacientų genotipas taip pat turi įtakos varfarino dozavimui. Nepaisant
kruopštaus dozės titravimo, kartotinių TNS tyrimų rezultatai dažnai neatitinka terapinio poveikio
ribų, o tai gali didinti tiek tromboembolinių komplikacijų, tiek kraujavimo riziką [57].
Šiuo metu yra atsiradę naujieji antikoaguliantai, kurie skirstomi į dvi grupes - geriamieji
tiesioginiai Xa faktoriaus inhibitoriai (rivaroksabanas, apiksabanas ar kt.) ir geriamieji tiesioginiai
trombino inhibitoriai (dabigatranas ar kt.). Svarbu, kad šie medikamentai kitaip nei varfarinas ,
blokuojantys daugelį nuo vitamino K priklausomų krešėjimo faktorių (VII, IX, X ir kt.), slopina tik
vieno kurio nors krešėjimo kaskados komponento (pvz.: trombino arba Xa faktoriaus) aktyvumą.
Naujųjų antikoaguliantų privalumai - tikslinis efektas, nereikalingas monitoravimas, mažesnė kitų
vaistų bei maisto sąveika su šiais antikoaguliantais, labiau prognozuojamas pusinis eliminacijos
laikas, geresnis veiksmingumo/saugos santykis. Bet šie medikamentai turi ir trūkumų. Vienas
dažniausių literatūroje aprašomų naujųjų antikoaguliantų trūkumų yra pagrindinis jų eliminavimo
kelias per inkstus. Esant vidutiniam inkstų funkcijos nepakankamumui (IFN), kraujavimo
profilaktikai rekomenduojama sumažinti rivaroksibano ir dabigatrano dozę, o esant terminaliniam
IFN (glomerulų filtracijos greitis (GFG) <15 ml/min.), šie medikamentai yra kontraindikuotini [55].
Aprašomos ir kitos klinikinės situacijos, kai naujųjų antikoaguliantų vartojimas neužtikrina geresnių
išeičių nei varfarinas. Nė vienas naujasis antikoaguliantas nėra patvirtintas pacientams su
mechaniniais širdies vožtuvais, esant ūmiai venų trombinei embolijai, sergant onkologinėmis ligomis,
nėštumo metu, antifosfolipidinio sindromo atveju [56]. Tad šiuo metu po širdies vožtuvų operacijų
Lietuvoje yra naudojamas varfarinas.
9.2 Varfarino reikšmė po širdies vožtuvų operacijų
10
Šiuo metu vis daugėja pacientų po širdies vožtuvo protezavimo operacijų. Protezų
trombogeniškumas buvo ir yra vienas iš veiksnių, kuris daugeliu atvejų lemia ligonių mirtingumą po
operacijos. Kaip buvo mintėta, varfarinas yra naudojamas po širdies vožtuvų protezavimo operacijų,
norint išvengti tromboembolinių komplikacijų. Varfarinas, naudojamas po operacijų, mažina
tromboembolinių komplikacijų riziką iki 1-2 proc. per metus [59], tačiau jis turi būti skiriamas
individualiai [60]. Pacientams, kuriems protezuotas mechaninis vožtuvas, tromboembolinės
komplikacijos yra dažnesnės negu protezuojant biologinį vožtuvą [61]. Pacientai su biologiniu širdies
vožtuvu po operacijos varfariną naudoja 3 mėnesius, o su mechaniniu širdies vožtuvo protezu visą
gyvenimą ir TNS dažniausiai palaikomas tarp 2-3 (po mechaninio mitralinio vožtuvo protezavimo –
2,5 - 3,5, po biologinių vožtuvų protezavimo bei aortos mechaninio vožtuvo protezavimo 2-3)
[59,62].
Perdozavus varfarino pirmiausia reikia nutraukti jo vartojimą. Toliau gydymo taktika
priklauso nuo klinikos ir TNS kiekio. Jei TNS 4,5 - 10 ir pacientas nekraujuoja, tuomet nereikia skirti
vitamino K. Jeigu TNS>10, nors pacientas ir nekraujuoja, arba pacientas kraujuoja ir neatsižvelgiant
į TNS yra skiriamas vitaminas K. Esant urgentinėms būklėms vartojama šviežiai šaldyta plazma ar
dar retesniais atvejais - krešėjimo faktorių koncentratas [61].
Pacientams, po mechaninio širdies vožtuvo protezavimo, kurie privalo vartoti varfariną,
planuojant bet kokią intervencinę procedūrą reikia specialaus pasiruošimo. Prieš didelės apimties
operacijas, pacientai nevartoja varfarino apie 48-72val, kai TNS<2,0, rekomenduojama skirti
hepariną, kad dalinis aktyvintas tromboplastino laikas (DATL) būtų palaikomas tarp 55 - 70s.
Sustabdyti hepariną 4-6val. prieš operaciją. Pacientams su širdies vožtuvu, esant skubiai intervencijai,
varfarino neutralizavimui geriau skirti ne šviežią šaldytą plazmą, bet protrombino komplekso
koncentratą – taip išvengiama tūrio perkrovos [57].
Pacientai po širdies vožtuvų operacijų privalo vartoti varfariną ir tai sumažina
tromboembolines komplikacijas, kas ilgina pacientų išgyvenamumą. Bet svarbu žinoti, kad vartojant
varfariną, reikia sekti TNS ir dažniausiai palaikyti ribas tarp 2-3, kadangi kitaip gydymas gali būti
nepilnavertis ir tuomet galimos komplikacijos – kraujavimas ar tromboembolija, priklausomai nuo
TNS.
9.3 Varfarino veikimo mechanizmas
Natūraliai organizme vitamino K epoksido - reduktazė (VKORC) verčia oksiduotą vitaminą
K į redukuotą. Vitaminas K yra naudojamas aktyvių krešėjimo faktorių sintezėje (1 pav.).
11
Pacientų vartojamos varfarino tabletės sudarytos iš dviejų izomerų - S ir R mišinio. S
izomerą pagrinde metabolizuoja fermentas CYP2C9, R izomerą metabolizuojantys fermentai -
CYP2C19, CYP3A4. Varfarinas slopina VKORC. Veikiant varfarinui, oksiduota vitamino K forma
negali būti verčiama aktyvia redukuota forma, taip sukeliamas dirbtinis vitamino K stygius ir toliau
nebevyksta vitamino K karboksilinimas, o kepenyse slopinama nuo šio vitamino priklausančių
krešėjimo faktorių sintezė (II, VII, IX, X ir proteinų C ir S) [24-25]. Be minėtų fermentų, svarbus ir
CYP4F2, kuris redukuotą vitamino K forma hidroksilina ir taip mažina vitamino K aktyvumą.
9.4 Varfarino farmakokinetika
Varfarinas greitai ir gerai rezorbuojasi iš virškinamojo trakto ypač iš skrandžio ir
dvylikapirštės žarnos. Maksimali vaisto koncentracija kraujo plazmoje pasiekiama per 2 – 6 val.. 90-
99 proc. varfarino jungiasi su plazmos baltymais, todėl vaisto pasiskirstymo tūris yra santykinai
mažas. Varfarinas beveik visas eliminuojamas vykstant lėtam metabolizmui kepenyse – susidaro
metabolitai, kurie turi skirtingą aktyvumą [25]. Dažniausiai literatūroje pateikiamas bendras pusinės
eliminacijos laikas – 36 val., tačiau S ir R izomerai savo poveikiu ir veikimo trukme nėra vienodi -
S izomeras 3-5 kartus aktyvesnis negu R izomeras, bet atitinkamai greičiau yra pašalinamas [29].
Varfarino metabolitai yra pašalinami per šlapimo sistemą ir mažoji dalis per tulžį [25]. Dėl to, kad S
ir R izomerus metabolizuoja skirtingi fermentai, o šių fermentus koduojančių genų polimorfizmai
skirtingiems ligoniams gali būti kitokie, šių izomerų pusinis eliminanacijos laikas skirtingiems
ligoniams nėra vienodas [26].
Varfarino efektui įvertinti atliekamas protrombino laiko tyrimas (angl. PT), kuris gali būti
atliekamas Quick`o (TNS, angl INR) ir Owren`o metodais (Stago protrombino indeksas (angl. SPA));
1 pav. Vitamino K metabolizmas [64]
12
TNS - tai paciento plazmos krešėjimo laiko ir vidutinio normalaus krešėjimo laiko santykis. Tiek
SPA, tiek ir TNS atspindi išorinį kraujo krešėjimo kelią [37]. Ankstyviausi TNS pokyčiai po pirmos
suvartotos varfarino dozės stebimi praėjus tik 24-36 val. Praėjus tiek laiko dar nesusiformuoja
reikšminga antikoaguliacinė vaisto funkcija, kadangi varfarinas stipriausiai slopina VII, o silpniau -
kitus krešėjimo faktorius: II, IX, X ir proteinus C ir S. Faktorių sintezės slopinimas pasireiškia ne
vienu metu, maksimalus antikoaguliacinos poveikis stebimas tik po 4-7 dienų [38].
9.5 Farmakokinetika, nulemta gretutinių veiksnių
Antikoaguliaciniam poveikiui ir varfarino dozėms įtakos turi daugelis veiksnių. Pacientams
su viršsvoriu turi būti skiriamos didesnės varfarino dozės negu pacientams su normaliu kūno masės
indeksu (KMI), norint pasiekti tą patį efektą dėl didesnės kūno masės [27]. Rūkymas gali potencialiai
sukelti reakciją su varfarinu, didindamas inkstų klirensą, o tai sąlygoja sumažėjusį varfarino kiekį
organizme [28]. Taipogi lytis turi reikšmę – moterims reikalingos mažesnės varfarino dozės negu
vyrams, norint pasiekti tokį pat efektą. Pacientų klinikinė būklė taip pat turi įtakos varfarino
dozavimui bei efektyvumui. Pacientai, turintys padidėjusią kreatinino koncentraciją, vartoja
mažesnes varfarino dozes, kadangi varfarino metabolitai pasišalina su šlapimu. O tie, kurių sumažėjęs
tirotropinio hormono (TSH) kiekis, turi naudoti didesnes varfarino dozes negu tie, kurių TSH kiekis
yra normalus arba didesnis, norint pasiekti tą patį antikoaguliacinį poveikį. Skydliaukės aktyvumas
ir ekskrecija priklauso nuo TSH koncentracijos kraujo plazmoje. Tiroksinas randamas kraujyje
susijungęs su baltymu ir jis konkuruoja dėl prisijungimo prie baltymo su varfarinu. Pastebėta -
pacientai su aukštesne laisvo tiroksino koncentracija kraujyje, naudoja mažesnes varfarino dozes,
kadangi laisvas tiroksinas prisijungia prie baltymo, tuomet varfarinas tampa laisvu ir jos slopinamas
krešėjimo efektas sustiprėja [2, 41].
Varfarinas pasižymi tuo, kad sąveikauja su nemaža dalimi vaistų. Pacientams, kurie vartoja
amiodaroną ar ambroksolį, pradinės varfarino dozės yra mažesnės negu tų, kurie jų nevartoja.
Amiodaronas blokuoja citochromo P450 fermentus, tarp jų ir CYP2C9, kuris dalyvauja S varfarino
metabolizme [42]. Ambroksolio vienas iš efektų yra uždegimo mažinimas, o uždegimas aktyvina
krešėjimo sistemą. Tad manoma, kad priešuždegiminis ambroksolio poveikis paaiškina, kodėl
reikalingos mažesnės dozės [2]. Vartojant antibiotikus ir varfariną, taip pat stebima šių vaistų sąveika.
TNS padidėja, kai varfarinas naudojamas su antibiotikais (ypač makrolidais, fluorchinolonais ir
metronidazoliu), kadangi šie antibiotikai mažina vitamino K sintezę, o flukanozolis slopina CYP2C9
fermetą ir lėtina varfarino metabolizmą. Rifampicinas, priešingai, slopina antikoaguliacinį varfarino
poveikį, nes aktyvina CYP2C9 fermentą [50]. Be medikamentų varfarino veikimą gali keisti ir mityba
13
: daržovės, turinčios daug vitamino K, – kopūstai, špinatai, avokadas ir kt; augalai, tokie kaip
jonažolė, kuri slopina varfarino efektą, ar ginkmedis, šalavijas, ženčenis, kurie stiprina varfarino
veikimą [36]. Nutraukus varfariną, veikimas išlieka 4 – 7 dienas (priklausomai nuo pasiektos
hipokoaguliacijos) [25].
9.6 Farmakodinamika ir VKORC1 genotipas
Varfarino farmakodinamikoje vienas iš svarbiausių fermentų yra VKORC, kuris yra
slopinamas ir šio proceso rezultatas – sumažėjusi aktyvių faktorių sintezė (II, VII, IX, X ir proteinų
C ir S) [24-25]. Šis fermentas randamas endoplazminio tinklo membranose, sudarytas iš 163 amino
rūgščių. Jo transmembraninė struktūra yra iki galo neišaiškinta. Vienų tyrėjų manoma, kad fermentas
sudarytas iš trijų transmembraninių sričių [46-47], tačiau kitas modelis aiškina, kad iš keturių
transmembraninių sričių [48-49]. Pirmuoju atveju, jei fermentas yra sudarytas iš trijų domenų, tai
baltymo N – galas yra endoplazminiame tinkle, o C galas citozolyje [ 46-47]. Antruoju atveju - N ir
C galas yra citozolyje ir taip paaiškinimas 4 transmembraninių sričių modelis [48-49].
Vieni iš svarbiausių varfarino farmakodinamikos parametrų yra maksimalus vaisto
slopinimo faktorius (Imax), kuris yra susijęs su kepenų VKORC fermento kiekiu, ir vaisto afinitetas
(IC50) [39]. IC50 yra pastovus dydis, o didinant Imax didinamas vaisto jautrumas. Buvo
identifikuota, kad VKORC1 genotipas turi statistiškai reikšmingos įtakos prognozuojant Imax, kuris
proporcingas TNS. Pacientai, turintys šį VKORC1 polimorfizmą – G-1639A ( rs9923231), pasižymi
mažiau aktyvia kepenų veikla, todėl jiems reikia mažesnių S-varfarino koncentracijų kraujo plazmoje,
ir, tuo pačiu, mažesnių varfarino dozių, norint pasiekti optimalų antikoaguliacinį poveikį [40].
VKORC1 genotipas gali turėti įtakos pasirenkant varfarino dozę ir tai reguliuojama transkripcijos
lygyje [44].
VKORC1 sąveikauja su tam tikrais baltymais, kurie turi skirtingą efektą krešėjimo sistemai,
pvz.: CYP4F2 mutacijos gali reikalauti didesnių varfarino dozių, krešėjimo sistemos baltymų C ir S
mutacija gali gerinti koaguliaciją ir kt. [43].
9.7 Farmakogenomika
CYP2C9 yra svarbus citochromo P450 sistemos fermentas, kurį koduoja genas CYP2C9.
Šis genas yra labai polimorfiškas ir yra žinoma daugiau nei 30 jo variantų. Jo koduojamas fermentas
dalyvauja varfarino metabolizme, todėl yra svarbus parenkant varfarino dozę pacientams [1].
CYP2C9*2 (rs1799853, 430C>T) ir *3 (rs1057910, 1075A>C) aleliai lėtina varfarino metabolizmą
14
ir eliminaciją, o laukinio tipo alelis CYP2C9*1 yra susijęs su normaliu fermento aktyvumu [2].
Pacientams su CYP2C9*2 ar *3 aleliais reikalinga mažesnė varfarino dozė norint pasiekti tokį patį
antikoaguliacinį poveikį lyginant su pacientais, turinčiais CYP2C9*1 alelį [3]. Žinoma, kad šis genas
tik dalinai lemia jautrumą varfarinui.
VKORC1 yra vienas iš svarbiausių genų, lemiančių jautrumą varfarinui [1]. Du pseudogenai
gali būti identifikuojami 1 chromosomoje ir X chromosomoje [45]. Varfarinas blokuoja VKORC1
fermentą ir stabdo vitamino K redukciją, todėl nebevyksta aktyvių kraujo krešėjimo faktorių gamyba
[2]. Baltaodžių kliniškai reikšmingi yra šie VKORC1 tipai – G1639A (rs9923231), C1173T
(rs9934438) ir G3730A (rs7294). G1639A yra susijęs su padidėjusiu jautrumu varfarinui ir todėl tokį
genotipą turintiems ligoniams yra reikalingos mažesnės varfarino dozės [4]. A alelio nešiotojai
reikalauja mažesnių pradinių varfarino dozių, nei G alelio nešiotojai. Šis poveikis adityvus, t.y. -
homozigotai, turintys A/A genotipą - gydomi mažiausiomis dozėmis, heterozigotai - vidutinėmis, o
homozigotai G/G - didžiausiomis varfarino dozėmis [5,6]. C1173T yra dažniausiai randamas
haplotipe su G3673A. C1173T yra vieno nukleotido polimorfizmas pirmame VKORC1 introne. Jis
yra susijęs su mažesnėmis varfarino dozėmis. T alelio nešiotojai reikalauja mažesnių varfarino dozių
negu C alelio, heterozigotai – vidutinių [6]. Trečiasis, G3730A - yra vieno nukleotido polimorfizmas
VKORC1 3 UTR zonoje. Polimorfizmas yra susijęs su didesnėmis varfarino dozėmis. A alelio
nešiotojai reikalauja didesnių varfarino dozių negu G alelio. Polimorfizmas nesudaro haplotipų kaip
prieš tai minėti VKORC1 genotipai. [6]. Apibendrinant, ligoniams, turintiems mutavusį VKORC1 -
G1639A (rs9923231) ir C1173T (rs9934438) skiriamos mažesnės varfarino dozės, o G3730A
(rs7294) – didesnės varfarino dozės.
CYP4F2 yra dar vienas svarbus citochromo P450 fermentų šeimos narys. CYP4F2
reguliuoja vitamino K ir E biologinį prieinamumą, ilgųjų riebių rūgščių metabolizmą. Jis hidroksilina
ir inaktyvuoja redukuotą vitamino K formą, todėl sumažėja šio vitamino gebėjimas aktyvuoti
krešėjimo faktorius [7, 30, 32]. Šio polimorfizmo - CYP4F2 G1374A (V433M, rs2108622) nešiotojai
pasižymi sumažėjusiu fermento aktyvumu metabolizuoti vitaminą K, todėl stebimas padidėjęs
vitamino K kiekis [31, 33]. CYP4F2 A1347A genotipo nešiotojai turi naudoti didesnes varfarino
dozes nei pacientai, kurių genotipas G/G ar G/A [2]. Šis polimorfizmas gali paaiškinti 2-5 proc.
varfarino dozės pokyčių. Liang ir kitų studijos parodė, kad kinų populiacijoe šio geno polimorfizmas
paaiškina 3,9 proc. varfarino dozės pokyčių [34]. Pastebėta, kad 30 proc. baltaodžių gyventojų ir 17
proc. Azijos populiacijos yra A (rs2108622) alelio nešiotojai [33].
9.8 Uždegiminių veiksnių įtaka varfarino efektyvumui
15
CYP4F2 dalyvauja ne tik aprašytuose procesuose, bet ir uždegime. Uždegimas –
sudėtinga organzimo reakcija į žalingo agento veikimą, dėl kurio pasireiškia audinių ir kraujagyslių
funkciniai bei struktūriniai pakitimai. Kiekvienos operacijos metu sukeliamas uždegimas. Uždegimą
sudaro ilgos kaskados. Šiuo atveju svarbiausi elementai: arachidono rūgštis (ARA), kuri verčiama į
20-hidroksieikozatetraenoinę rūgštį (20–HETE), leukotrienai (pvz.: LTB4). Iš ARA gaunami
mediatoriai dalyvaujant įvairiems fermentams. Minėti fermentai - ciklooksigenazė ir lipooksigenazė.
Ciklooksigenazė dalyvauja verčiant ARA į prostaciklinus, tromboksaną. Lipooksigenazės fermentai
yra svarbūs leukotrienų sintezėje, kuriuos dažniausiai išskiria leukocitai ir pastariesiems padeda judėti
į uždegimo vietą. 5–lipooksigenazė verčia ARA į 5-hidroksiperoksieikosatetraenoinę rūgštį (5–
HPETE), kuri vėliau virsta į 5 - hidroksieikozatetraenoinę rūgštį (5- HETE). 5–HPETE turi
chemotaksinį poveikį leukocitams ir yra leukotrienų pirmtakas. Pateikiama detali iliustracija (2 pav.).
2 pav. Arachidono rūgšties metabolizmas [63]
Citochromo P450 fermentai dalyvauja arachidono rūgšties metabolizme, verčiant ją į
epoksieikosano rūgštį: CYP2C ir CYP2J pošeimio fermentai, o CYP4A, 4F ir 1A fermentai
arachidono rūgštį verčia į 20–HETE. CYP4F2 yra pagrindinė arachidono rūgšties ω- hidroksilazė
žmogaus kepenyse, inkstuose ir šią rūgštį padeda paversti į 20–HETE, kuri labai svarbi fiziologiškai.
[7]
CYP4F2 katalizuoja LTB4 inaktyvinimą kepenyse [35]. Šis leukotrienas yra uždegimą
skatinantis eikozanoidas. Jis skatina leukocitų, monocitų ir fibroblastų aktyvaciją bei superoksidų bei
citokinų išsiskyrimą, kurie pritraukia neutrofilus į uždegimo vietą [51]. Jis turi reikšmingą vaidmenį
uždegimo procese.
16
Keletas 20–HETE funkcijų: trombocitų agregacijos slopinimas (blokuoja trombocituose
esančius tromboksano A2 (TxA2) receptorius), kraujagyslių tonuso reguliavimas smegenyse,
inkstuose, širdyje, taip pat buvo išsiaiškinta, kad dalyvuoja vitamino K metabolizme [8]. G1347A
polimorfizmas CYP4F2 gene buvo rastas kaip reikšmingas, vykstant arachidono rūgšties virtimui į
20-HETE [2]. Padidėjus 20–HETE kiekiui, yra sukeliamas oksidacinis stresas, stimuliuojami
uždegiminiai citokinai ir kt. medžiagos, stebimas trombocitų agregacijos slopinimas, o mažėjant 20–
HETE, reakcijos vyksta priešingai. CYP4F2 A alelis yra susijęs su sumažėjusiu fermento metaboliniu
aktyvumu. CYP4F2 A1347A genotipo nešiotojai, dėl labiau išreikšto uždegimo, turi naudoti didesnes
varfarino dozes įsotinimo metu negu pacientai, kurių genotipas G/G ar G/A [2].
10. Laboratorinių genetinio ištyrimo metodų apžvalga
10.1 DNR – dezoksiribonukleino rūgštis
Dezoksiribonukleorūgštis (DNR) – medžiaga, pernešanti informaciją apie paveldimąsias
savybes. DNR sudaro nukleotidai, susijungę į ilgas grandines. Kiekvienas nukleotidas sudarytas iš
azoto turinčios bazės, monosacharido dezoksiribozės (pentozės) ir fosfato. Azoto turinčios bazės yra
keturių rūšių: dvi iš jų pirimidinai – citozinas (C) ir timinas (T), kitos dvi – purinai – adeninas (A) ir
guaninas (G). DNR turi tiek pat purino bazių, kiek ir pirimidino bazių. Kadangi DNR koduoja
paveldimąją informaciją, tai nukleotidai joje turi būti išsidėstę tam tikra tvarka. DNR sudaryta iš
dviejų vijų, kurios sujungtos vandeniliniais ryšiais, vijų šonuose – fosfatas ir dezoksiribozė, o centre
– bazių poros - citozinas jungiasi fosfodiesterine jungtimi su guaninu, adeninas su timinu. Šios bazių
poros yra komplementarios. Polinukleotidinės grandinės turi kryptį – gretimi nukleotidai jungiasi tarp
nukleotido deoksiribozės C atomo 5’ padėtyje ir kito nukleotido deoksiribozės C atomo 3’ padėtyje.
[9].
Svarbus įrodymas, kad DNR yra paveldimos informacijos nešėja, buvo genetinio kodo
iššifravimas. DNR nukleotidų sekose yra koduojamos aminorūgščių sekos polipeptiduose. Svarbu,
kad vieną aminorūgštį gali koduoti keletas nukleotidų kodų (pvz.: aminorūgštį liziną gali koduoti ir
AAA ir AAG nukleotidų kodai), o kodai sudaryti iš trijų nukleotidų, kurie vadinami kodonais. Taip
pat genetinis kodas yra universalus, t.y visų organizmų vienodas, išskyrus eukariotų mitochondrijų
DNR ir prokariotų DNR. Dar viena genetinio kodo savybė – jis nesanklotinis, t.y kodonai nesusikloja
ir jis turi baltymo sintezės pradžios signalą – AUG kodoną ir pabaigos signalus - UAA, UGA, UAG
(iRNR) [11].
17
Genas yra DNR molekulės dalis, kuri koduoja informaciją apie aminorūgščių seką. Genas
sudarytas iš egzonų (DNR sekos, koduojančios baltymų seką) ir intronų (nekoduojanti DNR seka).
Taip pat geno veiklai svarbus promotorius – DNR seka, be kurios negalėtų vykti informacijos
nurašymas į riboksinukleorūgštį (RNR), dar reikšmingi – gretimieji reguliuojantys elementai,
išsidėstę greta promotoriaus, ir tolimieji reguliuojantys elementai, esantys toliau ir galintys paspartinti
informacijos nurašymą (stiprintuvai) arba trukdyti šiam procesui – slopintojai [10].
Polimorfizmas apibūdina įvairių organizmų tam tikrų formų variacijas ir padeda atskirti vienas
organizmų rūšis nuo kitų. Genetikai naudoja sąvoką genetinis polimorfizmas, kuris apibūdina savitą
DNR seką. Ši seka kiekvieno žmogaus genomą padaro unikaliu [12].
10.2 DNR išskyrimas
DNR ekstrakcijos metu DNR išskiriama iš įvairių matricų, pvz.: kraujo, ląstelių, seilių,
šlapimo, blužnies, naudojant fizikinius ir cheminius metodus. Tik atskyrus DNR nuo tam tikrų
medžiagų, galima nustatyti jos seką. DNR ekstrakcija vykdoma tokiu būdu:
1. Ląstelių suardymas, išskiriant DNR esančią viduje.
2. Šalinamas ląstelės lipidų dvisluoksnis, naudojant detergentus ar surfaktantus.
3. Baltymų ardymas.
4. Atliekamas RNR šalinamas.
5. Tirpios DNR išgavimas.
Tirpios DNR išgavimo metodai :
– Išsodinimas etanoliu. Atliekant naudojamas ledinis etanolis arba izopropanolis. DNR
netirpsta šiuose alkoholiuose, todėl agreguoja ir iškrenta siūlų forma [14,15].
– Naudojant fenolį ir chloroformą.
– Minikolonėlių/magnetinių dalelių gryninimo metodas. Šis būdas remiasi, kad nukleino
rūgštis gali adsorbuoti prie kietosios medžiagos (silicio dioksido ar kitos). Jei sąlygos
optimalios, nukleorūgštis jungiasi prie silicio dioksido, o kitos medžiagos lieka tirpale ir
tai vyksta kolonėlėje [16-18].
10.3 DNR kokybės ir koncentracijos nustatymas
DNR gryninimo kokybei kontroliuoti kiekvienu atveju būtinai turi būti išmatuojamas DNR
kiekis ir grynumas. Kiekybiškai (nustatant DNR koncentraciją) ir kokybiškai DNR turi būti
įvertinama šiais metodais – spektrofotometriniu ir elektroforezės agarozės gėlyje metodais.
18
Spektrofotometrinis metodas. DNR kiekis nustatomas matuojant optinį tankį 260 nm ilgio
bangos šviesoje. Kokybinė DNR analizė atliekama išmatavus optinį tankį 280 nm ilgio bangos
šviesoje. Santykis A260/A280 parodo DNR švarumą. DNR yra švari, kai šis dydis yra didesnis nei
1,5. Geriausia, jei šis santykis yra 1,7-1,9. Mažesnis santykis rodo, kad DNR mėginyje yra baltymų
arba organinių medžiagų, didesnis – esama RNR.
Elektroforezė agarozės gelyje. Paruošiami išgrynintos DNR mėginiai (DNR, dažas ir
elektroforezės buferinis tirpalas). Į paruoštą gelį suleidžiama visų standartų tirpalų (nuo 250 ng iki 6
ng), išgrynintos DNR ruošinių ir DNR ilgio standarto. Elektroforezė vykdoma 1 valandą esant 100 V
įtampai. DNR molekulės turi neigiamą krūvį, todėl jos juda link teigiamai įkrauto elektrodo. Praėjus
elektroforezei skirtam laikui, gelis dažomas 1% etidžio bromido tirpalu 15 min. ir DNR fragmentai
analizuojami ultravioletinėje šviesoje (365 nm bangos ilgis). Išgrynintos DNR mėginiai lyginami su
žinomos genominės DNR standartais [22, 23].
10.4 Genotipo tyrimas polimerazės grandininės reakcijos metodu
Po DNR ekstrakcijos gali būti atliekamas genotipavimas. Tai atliekama naudojant
polimerazės grandininės reakcijos (PGR) tyrimą [19]. PGR – tai DNR sekos nukopijavimas ar
padidinimas nuo tūkstančio iki kelių milijonų kopijų. DNR sekos didinimui naudojama termiškai
stabili DNR polimerazė. Šiame procese svarbu cikliškumas. DNR amplifikacija vyksta
eksponentiškai gausinant molekulės taikinį kiekvieno ciklo metu. Amplifikacijos ciklo procesą
sudaro 3 stadijos:
1. Denatūracija. Terminė DNR mėginio denatūracija pakeliant temperatūrą iki 95οC.
2. Renatūracija. Temperatūra pažeminama iki 50 - 60 οC. Pradmuo pagal komplementariškumo
principą prisijungia prie DNR.
3. Sintezė. Temperatūra pakeliama iki optimalios termostabiliai DNR polimerazei veikimo
temperatūros (72 οC) [20].
DNR sintezė yra inicijuojama kiekvieno pradmens 3´-OH gale [20].
Be tradicinės PGR galima išskirti ir tikro laiko PGR. Tikro laiko PGR atliekamas kaip ir
tradicinis PGR, tačiau turi ir skirtumų. Tikro laiko PGR kaip žymuo naudojamas pradmuo, sekos gale
turintis fluorescuojantį zondą. Eksponentiškai pagausinamo produkto kiekio nustatymui matuojama
fluorescencijos energija. Šis metodas gali būti naudojamas kiekybiniam genų ištyrimui, patogenų
aptikimui, vieno nukleotido polimorfizmo genotipavimui, kopijų kiekio variacijoms, mikro RNR
analizei, siRNR/RNRi eksperimentams [21].
19
11. Eksperimentinė dalis
11.1 Tyrimo metodika
Tyrimo objektas
Į tyrimą buvo kviečiami pacientai po širdies vožtuvų operacijos, kuriems buvo skiriamas
varfarinas. Pacientai buvo aiškiai, išsamiai ir suprantamai supažindinti su atliekamu tyrimu naudojant
asmens informavimo formas ir į tyrimą įtraukiami tik pasirašę informuotojo asmens sutikimo formą.
Tiriamieji privalėjo turėti socialinį sveikatos draudimą, reikalaujamą pagal sveikatos priežiūros
įstaigų įstatymą.
Tiriamųjų atranka
Pacientų demografiniai (lytis, amžius, svoris, ūgis) ir klinikiniai duomenys gauti iš ligos
istorijų. Ligoniai buvo tiriami 2 kartus: 1-ą kartą - varfarino dozės įsotinimo metu, po operacijos ir
praėjus ne mažiau, nei 3 mėnesiams nuo gydymo varfarinu pradžios.
Pradiniame etape buvo 175 pacientai, iš kurių 107 buvo vyrai (61,14 proc.) ir 68 moterys
(38,86 proc.) po širdies vožtuvų operacijų. Antro tyrimo metu atvyko 113 pacientų, iš kurių 47 buvo
moterys (41,6 proc.) ir 66 vyrai (58,4 proc.). Ligonių demografiniai ir antropometriniai duomenys
pateikti 1 lentelėje.
1 lentelė. Demografiniai ir antropometriniai duomenys pacientų, kurie tiriami varfarino
įsotinimo metu ir praėjus 3 mėn. nuo pirmos vartotos varfarino dozės
Įsotinimo metu Ilgalaikio gydymo metu
Rodiklis N (proc.) Vidurkis±SN N (proc.) Vidurkis±SN
Amžius 175 65,82±11,73 113 64,45±11,71
Ūgis 175 175±9,84 113 170,12±9,82
Svoris 175 81,74±14,81 113 81,67±14,93
SN - standartinis nuokrypis.
20
11.2 Tyrimo metodai
Ligos istorijų, duomenų rinkimas
Iš ligos istorijų buvo renkama ši informacija - antropometriniai, klinikiniai duomenys
(biocheminiai rodikliai, naudojami vaistai, turimi žalingi įpročiai) ir pacientų TNS rezultatai
Po 3 mėnesių, papildomai vertinti šie rodikliai: tirotropinis hormonas (TSH), laisvas
tiroksinas, kreatininas, aspartataminotransferazė (AST), alaninaminotransferazė (ALT), AST/ALT
santykis, šarminė fosfatazė (ŠF). Taip pat, tirta šių ligų įtaka varfarino dozėms įsotinimo metu:
cukrinio diabeto, krūtinės anginos, širdies nepakankamumo, prieširdžių virpėjimo, arterinės
hipertenzijos. Vaistų įtaka (diuretikų, amiodarono, statinų, Ca kanalų blokatorių, beta- adreno
receptorių blokatorių, angiotenzino II receptorių blokatorių, aspirino, AKF inhibitorių, L- tiroksino,
benzadiazepinų) varfarino dozeis buvo tirta tiek įsotinimo, tiek stabilios dozės metu. 2-oje lentelėje
pateikta, kokie parametrai, kada tikrtinti.
2 lentelė. Varfarino įsotinimo ir ilgalaikio vartojimo metu rinkti duomenys.
Įsotinimo
metu
Ilgalaikio
gydymo metu
TTH ir laisvas tiroksinas -* +**
Kreatininas - +
AST, ALT, AST/ALT, ŠF - +
Gretutinės ligos (cukrinis diaberas, krūtinės angina, prieširdžių
virpėjimas,arterinė hipertenzija,širdies nepakankamumas)
- +
Naudoti vaistai (diuretikai, amiodaronas, statinai, Ca kanalų
blokatoriai, beta- adreno receptorių blokatoriai, angiotenzino II
receptorių blokatoriai, aspirinas, AKF inhibitoriai, L- tiroksinas,
benzadiazepinai)
+ +
Žalingi įpročiai (rūkymas, alkoholio vartojimas) - +
*- netirta/netikrinta, **- tirta/ tikrinta
Kraujo mėginių paėmimas tyrimams ir genetinis ištyrimas
Visų pacientų periferinis kraujas buvo paimtas į vakuuminius EDTA (etilendiamino
tetraacetatu), su koaguliantu ir natrio citratu padengtus mėgintuvėlius: 1-o tyrimo metu - iškart po
21
operacijos (prieš operaciją pasirašytas ligonio sutikimas tyrimams), o antro tyrimo metu - papildomai
išsikvietus po 3 mėnesių nuo pirmos varfarino dozės.
Genominės DNR išskyrimas ir genų polimorfizmo tyrimas atliktas Lietuvos sveikatos
mokslų universiteto Kardiologijos instituto Molekulinės kardiologijos laboratorijoje. Visiems į tyrimą
įtrauktiems pacientams buvo atliktas CYP2C9 *2 (rs1799853) ir *3 (rs1057910), VKORC1 *2
(rs9934438), VKORC1 *3 (rs7294) bei CYP4F2 (G1347A) genotipavimas.
Genominės DNR išskyrimas
Genominė DNR iš periferinio kraujo leukocitų buvo išskirta naudojant UAB „Fermentas“
rinkinį „Genomic DNA Purification Kit“ (Thermo Fisher Scientific, Lietuva) su kolonėlėmis pagal
gamintojo nurodytą darbo protokolą.
Genotipavimas tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos metodu
Genotipavimas tikro laiko polimerazės grandinės reakcijos (PGR) metodu atliktas remiantis
standartinėmis gamintojo nurodytomis sąlygomis ir rekomendacijomis Taqman molekuliniams
žymenims. Tyrimas atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Kardiologijos instituto
Molekulinės kardiologijos laboratorijoje naudojant tikro laiko PGR termociklerį ABI 7900HT Fast
Real–Time PCR (ABI, JAV) bei komercinius Taqman molekulinius žymenis (LifeTechnologies,
JAV), skirtus (CYP2C9 *2 (rs1799853) ir *3 (rs1057910), VKORC1 *2 ( rs9934438), VKORC1 *3
(rs7294) bei CYP4F2 (G1347A) ) polimorfizmui tirti.
Tikro laiko PGR atlikta standartinėmis gamintojo rekomenduojamonis sąlygomis (laikantis
temperatūros režimo bei sudėtinių reakcijos komponentų koncentracijų, pagal gamintojo pateiktą
protokolą). Naudotas universalus Taqman 2x (LifeTechnologies, JAV arba Thermo Fisher Scientific,
Lietuva) mišinys. Tiriamosios DNR buvo imama 10 ng pagal gamintojo rekomendacijas. Kiekvieną
kartą atliekant reakcijas, siekiant išvengti klaidų, buvo dedami sekoskaitos būdu nustatytų genotipų
standartai.
Standartinės reakcijos sąlygos tikro laiko PGR genotipavimo reakcijai paruošti:
– TAQMAN žymenų – 1,25 µl (20x) ( Applied Biosystems, Jungtinė Karalystė),
– Taqman 2x universalau reakcijos mišinio – 12,5 µl ( Applied Biosystems, Jungtinė Karalystė
arba Thermo Fiaher Scientific, Lietuva)
– PGR grynumo vandens – 10,25 µl ( UAB “Fermentas”, Lietuva)
– 1ul genominės DNR (10 ng tyrimui)
22
Temperatūros/laiko režimas:
95 °C – 10 minučių,
95 °C – 15 sekundžių,
60 °C – 90 sekundžių.
Ciklas nuo antrojo etapo kartotas 40 kartų (du paskutinius kartus : 95 °C ir 60 °C).
Metodo validavimas sekoskaitos metodu
Standartams nustatyti naudota Sanger`io sekoskaita. Genotipavimas atliktas ABI 3500
sekoskaitos įrenginiu. Genominei DNR ištirti naudoti du nežymėti pradmenys: pirmaujanti seka ir
atsiliekanti seka. PGR atlikimo sąlygos :
95 °C - 10 minučių
95 °C – 15 sekundžių,
60 °C – 45 sekundės,
72 °C – 10 minučių.
2 ir 3 etapas kartotas 35 ciklus.
Pirminio produkto PGR valymas buvo atliekamas naudojant „Invitrogen Pure Link PCR
Purification Kit“, laikantis gamintojo nurodytų sąlygų. Į mišinį, sudarytą iš 50 µl PGR produkto,
pridedama 200 µl buferinio tirpalo B2 (ang. binding), kurio sudėtyje yra izopropanolio. Gerai
išmaišius supilama į kolonėlę ir centrifuguojama 10000 x g 1 minutę. Kolonėlė plaunama 650
µl buferiniu tirpalu (W1). Kolonėlė nusausinama centrifuguojant 10 000 x g 1 minutę. Išgrynintas
PGR produktas buvo tirpinamas minutę 50 µl eliuavimo (angl. elution) buferiniame tirpale. Kolonėlė
centrifuguojama 10 000 x g 2 minutes.
PGR reakcijai iki sekoskaitos buvo ruošiamas mišinys : PGR grynumo vanduo (4 µl), 5 x
buferinis (2 µl) tirpalas, pradmuo (1 µl) ir BigDye Terminator polimerazė (1 µl) ( LifeTechnologies,
JAV). Į mišinį įdėta 1 µl pirminio PGR produkto.
PGR sąlygos :
96 °C – 2 minutės,
96 °C – 30 sekundžių,
50 °C – 15 sekundžių
60 °C – 4 minutės.
2 ir 3 etapas kartotas 35 ciklus.
PGR produktas grynintas naudojant „Bigdye Xterminator Purification Kit“ rinkinį (
LifeTechnologies, JAV). Į kiekvieną 10 µl tūrio PGR produktą buvo dedama SAM tirpalo (45 µl) ir
23
Bigdye Xterminator tirpalo (10 µl). Gautas mišinys specialia maišykle maišytas 30 minučių. Šio etapo
pabaigoje reakcijos mišinys buvo centriguojamas 2 minutes, esant 1000 g.
Sekoskaita atlikta naudojant ABI 3500 Genetic Analyser instrumentą, atsižvelgiant į gamintojo
rekomendacijas. Rezultatų apdorojimas atlitkas naudojant „Sequence scanner version 1.0“
programinę įrangą.
11.3 Statistinė duomenų analizė
Statistinė duomenų analizė buvo atliekama naudojant programinį paketą “SPSS 20.0”
(Socialinių mokslų statistikos paketas programai Windows, Inc., Čikaga, JAV). Kiekybiniai
kintamieji, pasiskirstę pagal normalųjį skirstinį, pateikti vidurkiais ir standartiniais nuokrypiais (
vidurkis ± SN). Dažnis pateiktas procentais (proc.). Skirtumas laikytas statistiškai reikšmingu, jei
reikšmingumo lygmuo p < 0.05.
24
12. Rezultatai
Tirtiems pacientams buvo implantuojami tiek mechaniniai, tiek biologiniai vožtuvai,
priklausomai nuo ligonio amžiaus. Implantuojant mechaninį vožtuvą, buvo skiriamos didesnės
varfarino dozės tiek įsotinimo - 6,29 mg, tiek ir ilgalaikio gydymo metu – 5,94 mg, palyginus su tais
ligoniais, kuriems buvo implantuojamas biologinis vožtuvas - 4,79 mg ir 4,35 mg (atitinkamai).
Klinikinių veiksnių įtaka varfarino dozei
Ligoniams, kurie ilgalaikio gydymo metu turėjo padidėjusį kreatininą, ŠF, reikėjo mažesnių
varfarino dozių (p<0,05). Nors daugelyje tyrimų [2,41] randamas statistiškai reikšmingas ryšys tarp
TTH, laisvo tiroksino bei varfarino dozių. Mūsų tyrime nebuvo pastebėta, kad esant sumažėjusiam
TTH kiekiui būtų naudojamos didesnės varfarino dozės ar pacientai su aukštesne laisvo tiroksino
koncentracija kraujyje, naudotų mažesnes varfarino dozes. Taip pat buvo tirtas ryšys tarp varfarino
dozių ir šių ligų – krūtinės anginos, prieširdžių virpėjimo, arterinės hipertenzijos bei cukrinio diabeto,
bet statistiškai reikšmingo ryšio nerasta (p>0,05). 3 lentelėje pateikti klinikinių faktorių įtaka
varfarino dozėms vartojant pastoviai
3 lentelė. Klinikinių faktorių įtaka varfarino dozei ilgalaikio gydymo metu.
Kintamieji Stabili dozė
n Varfarino dozė ± SD
TSH kiekis
Per mažas 11 5,28 ± 2,84
Normos ribose 98 5,09 ± 2,29
Iš viso: 109 5,19 ± 2,57
Per mažas
11
5,28 ± 2,84
Per didelis 4 3,31 ± 1,21
Iš viso: 15 4,3 ± 2,03
Normos ribose
98
5,09 ± 2,29
Per didelis 4 3,31 ± 1,21
Iš viso 102 4,2 ± 1,75
25
Laisvo tiroksino kiekis
Per mažas 6 5,23 ± 1,39
Normos ribose 105 5,03 ± 2,37
Iš viso 111 5,13 ± 1,88
Per mažas
6
5,23 ± 1,39
Per didelis 2 5,27 ± 4,16
Iš viso 8 5,25 ± 2,28
Normos ribose
105
5,03 ± 2,37
Per didelis 2 5,27 ± 4,16
Iš viso 107 5,15 ± 3,27
Kreatinino kiekis
Normos ribose 102 5,19 ± 2,36**
Per didelis 11 3,65 ± 1,52**
Iš viso 113 4,42 ± 1,94
AST
Normos ribose 95 5,12 ± 2,38
Per didelis 18 4,63 ± 2,09
Iš viso 113 4,88 ± 2,24
ALT
Normos ribose 99 5,06± 2,34
Per didelis 14 4,92 ± 2,37
Iš viso 113 4,99 ± 2,36
AST/ALT
26
Per mažas 27 4,86 ± 2,06
Normos ribose 79 5,17 ± 2,49
Iš viso 106 5,02 ± 2,28
Per mažas
27
4,86 ± 2,06
Per didelis 7 4,32 ± 1,36
Iš viso 34 4,59 ± 1,71
Normos ribose
79
5,17 ± 2,49
Per didelis 7 4,32 ± 1,36
Iš viso 86 4,75 ± 1,93
ŠF
Normos ribose 104 5,22 ± 2,28*
Per didelis 9 3,03 ± 2,02*
Iš viso 113 4,13 ± 2,15
Krūtinės angina
Neserga 61 5,00 ± 2,58
Stabili 46 4,99 ± 2,11
Iš viso 107 5,00 ± 2,35
Neserga
61
5,00 ± 2,58
Nestabili 5 5,74 ± 1,19
Iš viso 66 5,37 ± 1,89
Stabili
46
4,99 ± 2,11
Nestabili 5 5,74 ± 1,19
Iš viso 51 5,37 ± 1,65
27
*p=0,006, ** p=0,04
Vaistų įtaka varfarino dozei
Varfarino įsotinimo metu tik amiodaronas statistiškai reikšmingai mažino varfarino dozes
(p=0,0006). O pastovaus vartojimo metu statistiškai reikšmingai mažesnių varfarino dozių reikėjo
diuretikus (torazemidą) (p=0,04) , Ca kanalų blokatorius (p=0,04) ir benzodiazepinus (p=0,05)
vartojusiems ligoniams (4 lentelė). Tarp kitų medikamentų ir varfarino dozių nerastas statistiškai
reikšmingas ryšys.
4 lentelė. Vartojamų medikamentų įtaka varfarino dozavimui.
Medikamentai Įsotinimo
metu
Stabili
dozė
n Varfarino dozė ±
SD
n Varfarino dozė
± SD
Torazemidas
Vartojo 148 5,76 ± 2,59 55 4,58 ± 2,44**
Nevartojo 27 4,80 ± 3,34 58 5,48 ± 2,16**
Iš viso: 175 5,28 ± 2,97 113 5,03 ± 2,3
Prieširdžių virpėjimas
Yra 42 5,00 ± 2,71
Nėra 71 5,07 ± 2,10
Iš viso 113 5,04 ± 2,41
Arterinė hipertenzija
Yra 80 5,02 ± 2,30
Nėra 33 5,09 ± 2,46
Iš viso 113 5,06 ± 2,38
Cukrinis diabetas
Yra 19 4,29 ± 1,50
Nėra 94 5,19 ± 2,44
Iš viso 113 4,74 ± 1,97
28
Spironolaktonas
Vartojo 84 5,84 ± 2,89 24 4,70 ± 2,05
Nevartojo 91 5,39 ± 2,58 89 5,14 ± 2,41
Iš viso: 175 5,62 ± 2,74 113 4,92 ± 2,23
Amiodaronas
Vartojo 61 4,65 ± 2,50* 12 4,22 ± 2,23
Nevartojo 114 6,12 ± 2,72* 94 5,15 ± 2,37
Iš viso: 175 5,39 ± 2,61 113 4,69 ± 2,3
Statinai
Vartojo 66 5,51 ± 2,83 34 5,25 ± 2,22
Nevartojo 109 5,64 ± 2,68 79 4,95 ± 2,39
Iš viso: 175 5,58 ± 2,76 113 5,1 ± 2,3
Ca kanalų
blokatoriai
Vartojo 5 5,60 ± 4,84 9 3,53 ± 1,58**
Nevartojo 170 5,61 ± 2,67 104 5,17 ± 2,35**
Iš viso: 175 5,61 ± 3,76 113 4,35 ± 2,06
Beta – adreno
receptorių
blokatoriai
Vartojo 153 5,72 ± 2,71 98 5,07 ± 2,37
Nevartojo 22 4,77 ± 2,78 15 4,86 ± 2,1
Iš viso: 175 5,25 ± 2,75 113 4,97 ± 2,28
Aspirinas
Vartojo 10 4,93 ± 2,84 3 7,33 ± 3,22
29
Nevartojo 165 5,65 ± 2,72 110 4,98 ± 2,30
Iš viso: 175 5,29 ± 2,78 113 6,16 ± 2,76
AKF inhibitoriai
Vartojo 105 5,41 ± 2,64 70 5,20 ± 2,21
Nevartojo 70 5,90 ± 2,86 43 4,79 ± 2,53
Iš viso: 175 5,66 ± 2,75 113 5,00 ± 2,37
Angiotenzino II
receptorių
blokatoriai
Vartojo 11 5,34 ± 3,68 16 5,26 ± 1,91
Nevartojo 164 5,62 ± 2,67 97 5,01 ± 2,40
Iš viso: 175 5,48 ± 3,18 113 5,14 ± 2,17
L- Tiroksinas
Vartojo 13 5,77 ± 2,80 5 4,37 ± 2,02
Nevartojo 162 5,60 ± 2,74 108 5,07 ± 2,35
Iš viso: 175 5,69 ± 2,77 113 4,72 ± 2,19
Benzodiazepinai
Vartojo 104 5,58 ± 3,03 10 3,71 ± 1,37**
Nevartojo 71 5,65 ± 2,24 103 5,17 ± 2,37**
Iš viso: 175 5,62 ± 2,64 113 4,44 ± 1,87
*p=0,0006, ** p=0,04 – 0,05,
Gretutinių veiksnių įtaka varfarino dozei
Statistiškai reikšmingai didesnės varfarino dozės skirtos rūkantiems ir vartojantiems
alkoholį ilgalaikio gydymo metu nei šių žalingų įpročių neturintiems. 5-oje lentelėje pateikta žalingų
įpročių įtaka varfarino dozavimui ilgalaikio gydymo metu.
30
5 lentelė. Žalingų įpročių įtaka varfarino dozavimui ilgalaikio gydymo metu
N (proc.) Varfarino dozė ± SD
Rūkymas
Rūko 10 6,49 ± 1,96*
Nerūko 103 4,90 ± 2,33*
Iš viso: 113 5,70 ± 2,15
Alkoholis
Vartoja 78 5,55 ± 2,45**
Nevartoja 35 3,91 ± 1,56**
Iš viso: 113 4,73 ± 2,01
*p=0,04, **p=0,0004.
Genotipo įtaka varfarino dozėms
Tik varfarino įsotinimo metu pastebėtas statistiškai reikšmingas ryšys - ligoniai, turintys
CYP4F2 G1374A laukinį genotipą (G/G), naudojo mažesnes vaisto dozes (5,41 ± 2,50 mg per dieną)
negu AA genotipą turintys ligoniai (7,82 ± 4,06 mg per dieną) (p = 0,02).
Įsotinimo metu didesnes dozes naudojo CYP2C9 laukinio tipo *1*1 turėtojai - 5,68 ± 2,78
mg per dieną, o ilgalaikio gydymo metu didžiausias dozes vartojo CYP2C9 heterozigotai *1*2 (5,44
± 3,58 mg per dieną). Mažiausių dozių reikėjo *2*2 turėtojams. Bet šie duomenys nebuvo statiškai
reikšmingi (p > 0,05)
CYP2C9*1*3 heterozigotai naudojo mažesnes varfarino dozes tiek įsotinimo metu (4,53 ±
2,08 mg per dieną), tiek vartojant varfariną nuolatos (3,77 ± 1,88 mg per dieną) negu laukinio tipo
homozigotai (atitinkamai 5,83 ± 2,80 mg ir 5,33 ± 2,34 mg per dieną) (p<0,05).
Tiek įsotinimo metu, tiek pastovaus gydymo metu VKORC1 *2 C1173T laukiniam tipui
(C/C) būdinga didesnė varfarino dozė (atitinkamai - 6,47 ± 2,67 mg ir 6,02 ± 2,66 mg per dieną)
lyginant su heterozigotais (C/T) (5,63 ± 2,61 mg ir 4,96 ± 1,84 mg per dieną) bei (T/T) homozigotais
(3,13 ± 1,55 mg ir 3,20 ± 1,49 mg per dieną) (p<0,05).
VKORC1 *3 G3730A laukinio tipo nešiotojai (G/G) vartojo mažesnes varfarino dozes tiek
varfarino įsotinimo metu, tiek vartojant nuolatos (5,18 ± 2,97 mg ir 4,40 ± 2,20 mg per dieną), nei
mutavusį genotipą (A/A) turėję pacientai (6,39 ± 2,47 mg ir 6,21 ± 2,86 mg per dieną) (įsotinimo
grupėje p=0,03, pastovaus vartojimo grupėje – p=0,003). Heterozigotai (G/A) (5,09 ± 1,73 mg per
dieną) vartojo mažesnes varfarino dozes negu A/A genotipo nešiotojai (p=0,05).
31
6 lentelė. Genotipų įtaka varfarino dozavimui įsotinimo metu.
Genotipai Įsotinimo
metu
Stabili dozė
n Varfarino dozė
± SD
n Varfarino dozė ±
SD
CYP4F2
G1374A
G/G 104 5,41 ± 2,50 66 4,82 ± 2,22
G/A 64 5,68 ± 2,86 42 5,25 ± 2,41
Iš viso: 168 5,55 ± 2,68 108 5,04 ± 2,32
G/G
104
5,41 ± 2,50**
66
4,82 ± 2,22
A/A 7 7,82 ± 4,06** 5 6,18 ± 3,15
Iš viso: 111 6,62 ± 3,28 71 5,5 ± 2,68
G/A
64
5,68 ± 2,86
42
5,25 ± 2,41
A/A 7 7,82 ± 4,06 5 6,18 ± 3,15
Iš viso: 71 6,75 ± 3,46 47 5,7 ± 2,78
CYP2C9
CYP2C9*1*1 147 5,68 ± 2,78 95 4,99 ± 2,11
CYP2C9*1*2 24 5,34 ± 2,49 15 5,44 ± 3,58
Iš viso: 171 5,51 ± 2,64 110 5,2 ± 2,85
CYP2C9*1*1
147
5,68 ± 2,78
95
4,99 ± 2,11
CYP2C9*2*2 4 4,62 ± 2,50 3 4,57 ± 1,91
Iš viso: 151 5,15 ± 2,64 98 4,78 ± 2,01
CYP2C9*1*2
24
5,34 ± 2,49
15
5,44 ± 3,58
CYP2C9*2*2 4 4,62 ± 2,50 3 4,57 ± 1,91
Iš viso: 28 4,98 ± 2,50 18 5,00 ± 2,75
CYP2C9*3-2
32
*p<0,005, ** p=0,005-0,05
1*1 145 5,83 ± 2,80** 92 5,33 ± 2,34*
1*3 30 4,53 ± 2,08** 21 3,77 ± 1,88*
Iš viso: 175 5,18 ± 2,44 113 4,55 ± 2,11
VKORC1 *2
C1173T
C/C 73 6,47 ± 2,67** 42 6,02 ± 2,66**
C/T 76 5,63 ± 2,61** 51 4,96 ± 1,84**
Iš viso: 149 6,05 ± 2,64 93 5,49 ± 2,25
C/C
73
6,47 ± 2,67*
42
6,02 ± 2,66*
T/T 26 3,13 ± 1,55* 20 3,20 ± 1,49*
Iš viso: 99 4,8 ± 2,11 62 4,61 ± 2,08
C/T
76
5,63 ± 2,61*
51
4,96 ± 1,84*
T/T 26 3,13 ± 1,55* 20 3,20 ± 1,49*
Iš viso: 102 4,38 ± 2,08 71 4,08 ± 1,67
VKORC1 *3
G3730A
G/G 76 5,18 ± 2,97 49 4,40 ± 2,20
G/A 58 5,62 ± 2,49 37 5,09 ± 1,73
Iš viso: 134 5,4 ± 2,73 86 4,75 ± 1,97
G/G
76
5,18 ± 2,97**
49
4,40 ± 2,20*
A/A 41 6,39 ± 2,47** 27 6,21 ± 2,86*
Iš viso: 117 5,79 ± 2,72 76 5,31 ± 2,53
G/A
58
5,62 ± 2,49
37
5,09 ± 1,73**
A/A 41 6,39 ± 2,47 27 6,21 ± 2,86**
Iš viso: 99 6,01 ± 2,48 64 5,65 ± 2,30
33
13. Rezultatų aptarimas
Stabilus varfarino dozavimas turi būti parenkamas individualiai kiekvienam pacientui.
Varfarino dozė turi būti koreguojama atsižvelgiant į mitybą, žalingus įpročius, antropometrinius ir
klinikinius parametrus, naudojamus medikamentus bei turimą genotipą [54]. Šiuo tyrimu parodėme,
kad reikšmingą įtaką varfarino dozavimui turi – žalingi įpročiai (rūkymas ir alkoholio vartojimas),
biocheminiai rodikliai (kreatininas, ŠF), medikamentai (kilpinis diuretikas (torazemidas), kalcio
kanalų blokatoriai, benzodiazepinai ir amiodaronas), genotipas (CYP4F2, CYP2C9*3-2, VKORC1
*2, VKORC1 *3). Vieni faktoriai varfarino įsotinimo metu, kiti pastovaus vartojimo metu arba abiem
atvejais darė įtaką varfarino dozavimui.
Ne viename straipsnyje [2,41] teigta - pacientai su padidėjusiu kreatinino kiekiu naudoja
mažesnes varfarino dozes, kadangi yra sutrikęs varfarino pasišalinimas iš organizmo. Tai rodo ir mūsų
rezultatai, varfarino dozė esant padidintam kreatinino kiekiui buvo 1,5 mg mažesnė, nei esant
normaliam kreatinino kiekiui, varfariną vartojant ilgiau nei 3 mėnesius. Ilgalaikio gydymo metu
vaisto dozei taipogi įtakos turėjo kepenų fermentas ŠF. Esant padidėjusiam ŠF aktyvumui, varfarino
dozė buvo 2,2 mg žemesnė, nei esant normaliam ŠF aktyvumui. ŠF padidėjimo viena iš priežasčių
yra sutrikęs tulžies nutekėjimas, o dalis varfarino pasišalina su tulžimi [25]. Galima daryti prielaidą,
kad ši priežastis sutrikdo dalies varfarino pasišalinimą, todėl reikalingos mažesnės varfarino dozės
nei esant nepadidėjusiai ŠF ir nesutrikusiai tulžies apykaitai.
Varfarino dozavimui įtakos turėjo ir vartojami medikamentai. Įsotinant varfarinu, ligoniai,
vartojantys amiodaroną, naudojo 1,47 mg per dieną mažiau negu nevartojatys šio vaisto.
Amiodaronas blokuoja CYP2C9, kuris dalyvauja S varfarino metabolizme [42]. Pastoviai vartojant
varfariną statistiškai reikšmingas ryšys pastebėtas tarp kilpinio diuretiko (torazemido), kalcio (Ca)
kanalų blokatorių, benzodiazepinų ir varfarino dozių. Naudojantys torazemidą naudojo apie 1 mg
mažesnes dozes, nei nevartojantys. Tai galėtų paaškinti, kad vartojant kilpinius diuretikus yra iš
organizmo pašalinami skysčiai, todėl sąlyginai didėja varfarino koncentracija ir reikalingos mažesnės
varfarino dozės. Vartojantys Ca kanalų blokatorius naudojo mažesnes varfarino dozes, kadangi Ca
kanalų blokatoriai yra stiprūs CYP3A4 inhibitoriai, o būtent šis fermentas metabolizuoja R- varfariną
[24-25] ir tai gali sulėtinti varfarino metabolizmą, kas paaiškintų šių vaistų sąveiką. Benzodiazepinai
irgi mažina varfarino dozes – vatojantiems šiuos medikamentus buvo reikalingos maždaug 1,5 mg
mažesnės varfarino dozės. 1991 m. Domenici ir kiti [58] atrado, kad tarp S – varfarino ir
benzodiazepino (S- lorazepamo) yra alosterinė sąveika, jungiantis prie žmogaus serumo baltymų.
34
CYP2C9 dalyvauja varfarino metabolizme ir yra svarbus parenkant varfarino dozę
pacientams [1]. CYP2C9*2 (rs1799853, 430C>T) ir *3 (rs1057910, 1075A>C) aleliai lėtina varfarino
metabolizmą ir eliminaciją, o laukinio tipo alelis CYP2C9*1 yra susijęs su normaliu fermento
aktyvumu [2]. Pacientams su CYP2C9*2 ar *3 aleliais reikalinga mažesnė varfarino dozė norint
pasiekti tokį patį antikoaguliacinį poveikį lyginant su pacientais turinčiais CYP2C9*1 alelį [3].
Varfarino įsotinimo metu CYP2C9*1*2 turėjo 24, CYP2C9*2*2 - 4 pacientai. CYP2C9*1*3
heterozigotinį variantą turėjo – 30 ligonių. Mūsų tyrime statistiškai reikšmingas ryšys pastebėtas tik
tarp CYP2C9*1*3 ir varfarino dozių. Įsotinimo metu CYP2C9*1*3 heterozigotai naudojo 1,3 mg
mažesnes varfarino dozes nei laukinio tipo homozigotai, ilgalaikio gydumo metu heterozigotai
naudojo 1,6 mg mažesnes varfarino dozes.
VKORC1 yra vienas iš svarbiausių genų, lemiančių varfarino jautrumą, nes jis daro įtaką
VKORC1 fermento aktyvumui ir vitamino K redukcijai [1,2]. Yra nustatyti keli kliniškai reikšmingi
VKORC1 geno variantai, kurie gali daryti įtaką varfarino dozei baltaodžiams: VKORC1 *2 C1173T
bei VKORC1 *3 G3730A. Mūsų tyrime varfarino įsotinimo metu VKORC1 *2 C1173T genotipo
nešiotojai pasiskirstė taip: laukinį tipą (C/C) turėjo 73 (41,7 proc.), heterozigotinį (C/T) – 76 (43,4
proc.), mutavusį (T/T) - 26 pacientai (14,9 proc.). Pastebėtas statistiškai reikšmingas ryšys tarp
varfarino dozių ir šio genotipo - tiek įsotinimo metu, tiek pastovaus gydymo metu. VKORC1 *2
laukinį genotipą turintiems buvo nustatytos didesnės paros varfarino dozės maždaug 0,5 mg,
palyginus su C/T heterozigotais. Turintiems homozigotinį T/T variantą reikėjo net perpus mažesnių
varfarino dozių, nei C/C laukinį genotipą turintiems. Šie duomenys sutampa su analizuota literatūra
- VKORC1 *2 C1173T genotipo C alelio nešiotojai reikalauja didesnių varfarino dozių negu T alelio,
heterozigotai – vidutinių [6]. VKORC1 *3 G3730A genotipo nešiotojai varfarino įsotinimo grupėje
pasiskirstė taip: laukinį tipą turėjo – 76 (42,4proc.), heterozigotinį – 58 (33,2proc.), mutavusį – 41
pacientas (23,4proc.). Ir čia pastebėta, kad tiek įsotinimo metu, tiek naudojant pastoviai VKORC1 *3
G3730A laukinio tipo nešiotojai (G/G) vartojo iki 1,5 mg mažesnes varfarino dozes, nei A/A turintys
ligoniai. Be to, vartojant varfariną nuolatos, heterozigotai vartojo 1,1mg mažesnes dozes negu
turintys mutavusį genotipą. Kaip ir teigiama Ryan P. ir bendraautorių straipsnyje [6] - VKORC1 *3
G3730A alelis nesudaro haplotipo su VKORC1 C1173T aleliu. A alelio nešiotojai reikalauja didesnių
varfarino dozių negu G alelio - laukinį tipą turintys pacientai.
CYP4F2 yra dar vienas svarbus citochromo P450 narys, nes jis hidroksilina ir inaktyvuoja
redukuotą vitamino K formą, todėl sumažėja šio vitamino pajėgumas aktyvuoti krešėjimo faktorius
[7, 30, 32]. Mūsų tiriamųjų imtyje CYP4F2 G1374A laukinį tipą (G/G) varfarino įsotinimo grupėje
turėjo – 104 (59,4proc.), heterozigotinį (G/A) – 64 (36,6 proc.), o mutavusį (A/A) (4,4proc.) – 7
35
pacientai (4,0 proc.). Iš rezultatų matome, kad G alelio nešiotojai naudoja mažesnes varfarino dozes
nei A alelį turintys: tiek įsotinimo (G/G - 5,41 ± 2,50 mg, G/A - 5,68 ± 2,86 mg, A/A - 7,82 ± 4,06
mg per dieną) , tiek pastovaus varfarino vartojimo metu (G/G - 4,82 ± 2,22 mg, G/A - 5,25 ± 2,41mg,
A/A - 6,18 ± 3,15 mg per dieną). Bet statistiškai reikšmingas ryšys pastebėtas tik varfarino įsotinimo
metu - laukinio tipo nešiotojai naudojo 2,5 mg mažesnes varfarino dozes negu mutavusį genotipą
turintys. Kaip ir šiame straipsnyje - Tatarunas V. ir bendraautoriai, [2] buvo pabrėžta, kad CYP4F2
A1347A genotipo nešiotojai turi naudoti didesnes varfarino dozes būtent įsotinimo metu negu
pacientai, kurių genotipas G/G ar G/A.
Ligoniams, kurie ilgalaikio gydymo metu vartojo varfariną (113 pacientų), stebėtas
statistiškai reikšmingas ryšys tarp varfarino dozių ir rūkymo bei alkoholio vartojimo. Rūkančių, o
taip pat ir vartojančių alkoholį pacientų paros varfarino dozės - buvo aukštesnė 1,5 mg, nei šių
medžiagų nevartojančių ligonių. Rūkančių pacientų varfarino doze didesnė, kadangi rūkymas gali
potencialiai sukelti reakciją su varfarinu, didindamas inkstų klirensą, o tai sąlygoja sumažėjusį
varfarino kiekį organizme [28]. Rastas statistiškai reikšmingas ryšys ir tarp vartojančių alkoholį bei
didesnių varfarino dozių.
36
14. Išvados
1. Varfarino įsotinimo metu pacientai, vartojantys amiodaroną, naudojo mažesnes varfarino
dozes nei nevartojantys šio vaisto. Ilgalaikio gydymo metu - pacientams buvo reikalingos
mažesnės varfarino dozės, jeigu jie vartojo bent vieną iš šių medikamentų - kilpinį diuretiką
(torazemidą), kalcio kanalų blokatorius ar benzodiazepinus. Turintiems padidėjusį kreatinino
kiekį ar padidintą šarminės fosfatazės aktyvumą reikėjo mažesnių varfarino paros dozių, nei
esant normos rodikliams, vartojant varfariną nuolatos. Tiek rūkantys, tiek ir vartojantys
alkoholį pacientai naudojo didesnes varfarino dozes ilgalaikio gydymo metu.
2. Tiek varfarino įsotinimo, tiek ir ilgalaikio gydymo metu, po širdies vožtuvų operacijų,
CYP2C9*1*3 heterozigotai naudojo mažesnes varfarino dozes nei laukinio tipo homozigotai.
VKORC1 C1173T C/C genotipą turintiems reikėjo didesnių varfarino dozių, nei T/T
turintiems. C/T heterozigotams reikėjo – vidutinių paros varfarino dozių. VKORC1 G3730A
G/G turintys ligoniai vartojo mažesnes varfarino dozes nei A/A turintys ligoniai. Be to,
vartojant varfariną nuolatos, VKORC1 G3730A heterozigotai vartojo mažesnes dozes negu
turintys A/A genotipą.
3. CYP4F2 (G1347A) G/G genotipą turintys ligoniai vartojo mažesnes varfarino dozes įsotinimo metu,
nei A/A genotipą turintys pacientai. Šis genotipas nedarė įtakos varfarino dozei ilgalaikio gydymo
metu.
15. Praktinės rekomendacijos
Siekiant identifikuoti ligonius, kuriems reikės mažesnių varfarino dozių, patartina nustatyti,
ar jų genotipai - CYP2C9*1*3, VKORC1 *2 (T/T), VKORC1 *3 (G/G). Pacientai, turintys šiuos
genotipus - CYP2C9*1*3, VKORC1 *2 (T/T), VKORC1 *3 (G/G) tiek įsotinimo, tiek ilgalaikio
vartojimo metu naudojo mažesnes varfarino dozes, o turintys – CYP4F2 (G1347A) G/G genotipą tik
įsotinimo metu vartojo mažesnes varfarino dozes. Taip pat svarbu ištirti ne tik genotipą, bet ir
biocheminius rodiklius, jei yra padidėjęs kreatininas ar šarminė fosfatazė, vartojamos mažesnės
varfarino dozės ilgalaikio gydymo metu. Medikamentų įtaka: vartojant amiodaroną, įsotinimo metu,
reikalingos mažesnės varfarino dozės, o esant ilgalaikiam gydymui reikalingos mažesnės varfarino
dozės, jeigu naudojamas bent vienas iš šių vaistų - torazemidas, kalcio kanalų blokatorius ar
benzodiazepinas. O turintiems žalingų įpročių (rūko ar vartoja alkoholį) reikalingos didesnės
varfarino dozės (ilgalaikio gydymo metu).
37
16. Literatūros sąrašas:
1. Derek Van Boven, Sharon Marsh, Howard McLeod, Michelle Whirl Carrillo, KatrinSangkuhl, Teri
E Klein, Russ B Altman . Cytochrome P450 2C9-CYP2C9. Pharmacogenet Genomics. 2010; 20(4):
277–281.
2. Tatarunas V, Lesauskaite V, Veikutiene A, Grybauskas P, Jakuska P, Jankauskiene L, Bartuseviciute
R, Benetis R. The effect of CYP2C9, VKORC1 and CYP4F2 polymorphism and of clinical factors
on warfarin dosage during initiation and long-term treatment after heart valve surgery. J Thromb
Thrombolysis. 2014;37(2):177-85.
3. Yang J, Chen Y, Li X, Wei X, Chen X, Zhang L, Zhang Y, Xu Q, Wang H, Li Y, Lu C, Chen
W, Zeng C, Yin T. (2013) Influence of CYP2C9 and VKORC1 genotypes on the risk of hemorrhagic
complications in warfarin-treated patients: a systematic review and meta-analysis. Int J
Cardiol. 2013;168(4):4234-43.
4. PharmGKB [Internet]. Palo Alto (CA): Stanford University. VIP Variant in VKORC1. [cited 2012
Feb 24]. Available from: http://www.pharmgkb.org/rsid/rs9923231 - tabview=tab2.
5. Rieder MJ, Reiner AP, Gage BF, Nickerson DA, Eby CS, McLeod HL, et al. Effect of VKORC1
haplotypes on transcriptional regulation and warfarin dose. N Engl J Med. 2005;352:2285–2293.
6. Ryan P. Owen, Li Gong, HershSagreiya, Teri E. Klein, and Russ B. Altman, VKORC1
Pharmacogenomics Summary. Pharmacogenet Genomics. 2010; 20(10): 642–644.
7. Fu Z, Nakayama T, Sato N, Izumi Y, Kasamaki Y, Shindo A, Ohta M, Soma M, Aoi N, Sato M,
Matsumoto K, Ozawa Y, Ma Y. A haplotype of the CYP4F2 gene is associated with cerebral
infarction in Japanese men. Am J Hypertens. 2008;21(11):1216-23
8. Tatarunas V, Jankauskiene L, Kupstyte N, Skipskis V, Gustiene O, Grybauskas P, Lesauskaite V.
The role of clinical parameters and of CYP2C19 G681 and CYP4F2 G1347A polymorphisms on
platelet reactivity during dual antiplatelet therapy. Blood Coagul Fibrinolysis. 2014;25(4):369-74
9. Bhagavan N.V., Ha C.E. Essentials of medical biochemistry: with clinical cases. Amsterdam, Boston
et al.: Elsevier; 2011. p. 275 – 279, 282.
10. Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, Peter Walter. Molecular
biology of the cell. New York: Garland Science, 2008, p. 206
11. Vaidutis Kučinskas. Genetikos ir genomikos pagrindai. 2012. p. 12-30.
12. Weinberg, Robert A. (Robert Allan) The biology of cancer. 2nd edition, Garland Science, Taylor &
Francis Group, LLC ISBN 978-0-8153-4219-9.
38
13. Dahm R. Discovering DNA: Friedrich Miescher and the early years of nucleic acid research. Human
Genetics. 2008; 122: 565–581.
14. Physical biochemistry, David Sheehan, Wiley Blackwell, 2009 p 285
15. Miller, S. A.; Dykes, D. D.; Polesky, H. F. A simple salting out procedure for extracting DNA from
human nucleated cells. 1988
16. Matson, Robert S. Microarray Methods and Protocols. Boca Raton, Florida: CRC. 2008 p. 27–29
17. Kumar, Anil. Genetic Engineering. New York: Nova Science Publishers. 2006 p. 101–102
18. Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der Noordaa J. Rapid and
simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 1990;28(3):495-503.
19. Parpugga T.K., Tatarunas V. et al. The Effect of PAI-1 4G/5G Polymorphism and Clinical Factors
on Coronary Artery Occlusion in Myocardial Infarction. Disease Markers.2015; 8
20. Applied biosystems, life technologies. Real-time PCR handbook. 2014. p. 2 – 3.
21. http://www.thermofisher.com/lt/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/qpcr-education/qpcr-vs-
digital-pcr-vs-traditional-pcr.html#2 Ar thermofisher.com. Life sciences. PCR. Real-Time PCR
(qPCR). qPCR vs. Digital PCR vs. Traditional PCR
22. Elahi E., Ronaghi M. Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis. Methods Molecular
Biology 2004; 255: 211-219.
23. Ronaghi M. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. Genome Research 2001; 11: 3-11.
24. Ansell J, Hirsh J, Hylek E, Jacobson A, Crowther M, Palareti G. Pharmacology and management of
the vitamin K antagonists: American College of Chest Physicians Evidence-Based Clinical Practice
Guidelines (8th Edition).Chest. 2008;133:160S-198S
25. Bertram G. Katzung, Susan B. Masters, Anthomy J. Trevor. Basic and clinical pharmacology 2012.
594-595;
26. Andrew Liu, BSc Hon, BScPhm, RPh; Carmine Stumpo, BScPhm, PharmD, RPh Warfarin-Drug
Interactions Among Older Adults. Medscape. 2007;10(10):643-646.
27. Jennifer H Martin, Clinical Pharmacologist and General Physician, Departments of Medicine and
Chemical Pathology, Royal Brisbane and Women's Hospital, and Diamantina Institute, The
University of Queensland, Brisbane. Pharmacogenetics of warfarin - is testing clinically indicated?
Aust Prescr 2009;32:76-80
28. Nathisuwan S, Dilokthamsakul P, Chaiyakunapruk N, Morarai T, Yodting T, Piriyachananusorn N.
Assessing evidence of interaction between smoking and warfarin: a systematic review and meta-
analysis. Chest. 2011 May;139(5):1130-9
29. Flockhart DA. Drug interactions: cytochrome P450 drug interaction table. Indiana University School
of Medicine. 2007.
39
30. Julie A. Johnson and Larisa H. Cavallari. Pharmacogenetics and Cardiovascular Disease—
Implications for Personalized Medicine. Pharmacol Rev. 2013; 65(3): 987–1009.
31. Matthew G. McDonald, Mark J. Rieder, Mariko Nakano, Clara K. Hsia, and Allan E. Rettie. CYP4F2
Is a Vitamin K1 Oxidase: An Explanation for Altered Warfarin Dose in Carriers of the V433M
Variant. Mol Pharmacol. 2009; 75(6): 1337–1346.
32. McDonald MG, Rieder MJ, Nakano M, Hsia CK, Rettie AE. CYP4F2 Is a vitamin K1 oxidase: an
explanation for altered warfarin dose in carriers of the V433M variant. Mol
Pharmacol. 2009;75:1337–46.
33. Singh O, Sandanaraj E, Subramanian K, Lee LH, Chowbay B. Influence of CYP4F2 rs2108622
(V433M) on warfarin dose requirement in Asian patients. Drug Metab Pharmacokinet. 2011;26:130–
6.
34. Huang SW, Xiang DK, Huang L, Chen BL, An BQ, et al. Influence of GGCX genotype on warfarin
dose requirements in Chinese patients. Thromb Res 2011. 127: 131–134.
35. Maria L. Alvarellos, Katrin Sangkuhl, Roxana Daneshjou, Michelle Whirl-Carrillo, Russ B. Altman,
and Teri E. Klein . PharmGKB summary: very important pharmacogene information for CYP4F2.
Pharmacogenet Genomics. 2015;25(1):41-7
36. M. Whirl-Carrillo, E.M. McDonagh, J. M. Hebert, L. Gong, K. Sangkuhl, C.F. Thorn, R.B. Altman
and T.E. Klein. Pharmacogenomics Knowledge for Personalized Medicine. Clinical Pharmacology
& Therapeutics 2012. 92(4): 414-417.
37. Holford NH. Clinical pharmacokinetics and pharmacodynamics of warfarin. Understanding the dose-
effect relationship. Clin Pharmacokinet. 1986 Nov-Dec;11(6):483-504.
38. Hirsh J, Dalen JE, Deykin D, Poller L, Bussey H. Oral anticoagulants: mechanism of action, clinical
effectiveness, and optimal therapeutic range. Chest. 1995;108(4 Suppl):231S–46S.
39. Gong IY, Tirona RG, Schwarz UI, Crown N, Dresser GK, et al. (2011) Prospective evaluation of a
pharmacogenetics-guided warfarin loading and maintenance dose regimen for initiation of therapy.
Blood. 2011 Sep 15;118(11):3163-71
40. Inna Y. Gong, Ute I. Schwarz, Natalie Crown, George K. Dresser, Alejandro Lazo-Langner,
GuangYong Zou, Dan M. Roden, C. Michael Stein, Marc Rodger, Philip S. Wells, Richard B. Kim,
Rommel G. Tirona. Clinical and Genetic Determinants of Warfarin Pharmacokinetics and
Pharmacodynamics during Treatment Initiation. Blood. 2011. November 16,
41. Ascenzi P, Fasano M .Allostery in a monomeric protein : the case of human serum albumin. Biophys
2010. 148: 16- 22
42. Klotz U. Antiarrhythmics : elimination and dosage considerations in hepatic inpairment. Clin
Pharmacokinetik. 2007. 46: 985-996
40
43. Roxana Daneshjou, Nicholas P Tatonetti, Konrad J Karczewski, Hersh Sagreiya, Stephane
Bourgeois, Katarzyna Drozda, James K Burmester, Tatsuhiko Tsunoda, Yusuke Nakamura, Michiaki
Kubo, Matthew Tector, Nita A Limdi, Larisa H Cavallari, Minoli Perera, Julie A Johnson, Teri E
Klein, and Russ B Altman. Pathway analysis of genome-wide data improves warfarin dose
prediction. BMC Genomics. 2013; 14: S11.
44. Mark J. Rieder, Ph.D., Alexander P. Reiner, M.D., M.P.H., Brian F. Gage, M.D., M.Sc., Deborah A.
Nickerson, Ph.D., Charles S. Eby, M.D., Howard L. McLeod, Pharm.D., David K. Blough, Ph.D.,
Kenneth E. Thummel, Ph.D., David L. Veenstra, Pharm.D., Ph.D., and Allan E. Rettie, Ph.D. Effect
of VKORC1 Haplotypes on Transcriptional. Regulation and Warfarin Dose. N Engl J Med. 2005;
352:2285-93
45. Oldenburg J, Bevans CG, Müller CR, Watzka M . Vitamin K epoxide reductase complex subunit 1
(VKORC1): the key protein of the vitamin K cycle. Antioxid. Redox Signal. 2006. 8 (3-4): 347–53.
46. Tie JK, Nicchitta C, von Heijne G, Stafford DW. Membrane topology mapping of vitamin K epoxide
reductase by in vitro translation/cotranslocation. J Biol Chem. 2005;280 (16)
47. Tie JK, Jin DY, Stafford DW. Human vitamin K epoxide reductase and its bacterial homologue have
different membrane topologies and reaction mechanisms. J Biol Chem. 2012;287(41):33945-55
48. Schulman S, Wang B, Li W, Rapoport TA. Vitamin K epoxide reductase prefers ER membrane-
anchored thioredoxin-like redox partners. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107(34):15027-32.
49. Rishavy MA, Usubalieva A, Hallgren KW, Berkner KL. Novel insight into the mechanism of the
vitamin K oxidoreductase (VKOR): electron relay through Cys43 and Cys51 reduces VKOR to allow
vitamin K reduction and facilitation of vitamin K-dependent protein carboxylation. J Biol
Chem. 2011;286(9):7267-78.
50. Levine M, Pizon AF, Padilla-Jones A, Ruha AM. Warfarin overdose: a 25-year experience. J Med
Toxicol 2014; 10:156.
51. Kalsotra A, Strobel HW. Cytochrome P450 4F subfamily: at the crossroads of eicosanoid and drug
metabolism. Pharmacol Ther. 2006;112:589–611.
52. Moreau C., Loriot MA, Siguret V. Vitamin K antagonist : from discovery to pharmacogenetics. Ann
Biol Clin. 2012. 70:53-551
53. Rieder MJ, Reiner AP, Gage BF, Nickerson DA, Eby CS, McLeod HL, Blough DK, Thummel KE,
Veenstra DL, Rettie AE. Effect of VKORC1 haplotypes on transcriptional regulation and warfarin
dose. N Engl J Med 2005. 352:2285-2293
54. Lipinski S, Bremer L, Lammers T, Thieme F, Schreiber S, Rosenstiel P .Coagulation and
inflammation. Molecular insights and diagnostic implications. Hamostaseologie. 2011.31 : 94 – 102
41
55. Greinacher A., Theodore E. Warkentin. The direct thrombin inhibitor hirudin. Journal of Thrombosis
and Haemostasis, 2008, 99, 819–829.
56. Mismetti P., Laporte S. New oral antithrombotics: a need for laboratory monitoring. For. Journal of
Thrombosis and Haemostasis, 2008, 621–626.
57. Weitz JI, Eikelboom JW, Samama MM. American College of Chest Physicians. New antithrombotic
drugs: Antithrombotic Therapy and Prevention of Thrombosis, 9th ed: American College of Chest
Physicians Evidence-Based Clinical Practice Guidelines. Chest. 2012;141
58. Domenici E, Bertucci C, Salvadori P, Wainer IW. Use of a human serum albumin-based high-
performance liquid chromatography chiral stationary phase for the investigation of protein binding:
detection of the allosteric interaction between warfarin and benzodiazepine binding sites. J Pharm Sci
1991,80:164–166.
59. ACC/AHA Guidelines for the magement of patients with valvular heart disease. JACC 2008;32(5):
1558-65
60. Groves P.Surgery of valve disease: late results and late complication. Heart 2001;86:715-21.
61. Regina Jonkaitienė, Rimantas Benetis, Renata Eidukaitytė. Pacientų, kuriems protezuoti vožtuvai,
ambulatorinė priežiūra. Medicina (Kaunas) 2005; 41(7).
62. Tsuyoshi Kaneko and Sary F. Aranki. Anticoagulation for prosthetic valves. Thrombosis.2013;4.
63. Kumar et al. Robbins Basic Pathology, 8 edn. 2007,48
64. K. Nakamura PhD, K. Obayashi PhD, T. Araki MS, T. Aomori PhD, Y. Fujita PhD,Y. Okada
PhD, M. Kurabayashi MD PhD,A. Hasegawa MD PhD, S. Ohmori PhD, T. Nakamura PhD and K.
Yamamoto PhD. CYP4F2 gene polymorphism as a contributor to warfarin maintenance dose in
Japanese subject. Clinical Pharmacy and Therapeutics. 2011, 1365