USO DE TÉCNICAS MOLECULARES PARA EL SEGUIMIENTO DE
DIGESTORES A ESCALA INDUSTRIALNombre: Rolando Chamy, Oscar FranchiInstitución: Núcleo Biotecnología Curauma-PUCV
3er curso RED TRITÓNValparaíso (Chile) 26-julio-2017
Digestión anaerobia
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Biogás
Energía (electricidad, calor)
Residuos orgánicos- Municipales- Industriales
Digestor anaerobioDigestato
Partículas orgánicas100% DQO
Hid
róli
sis
Ferm
en
tac
ión
Oxi
da
ció
nA
na
ero
bia
Acetotróficas Hidrogenotróficas
carbohidratosproteínas lípidos
aminoácidos, azúcares ácidos grasos
Productos intermedios
propionato, butirato...alcoholes
hidrógeno, CO2acetato
metano
An
tece
de
nte
s
Digestión anaerobia
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Parámetros en Control de ProcesoParámetros en Control de Proceso
•Ácidos Grasos intermedios
•Presión parcial de Hidrogeno
•Relaciones DQO v/s AGV
•Relaciones C/N
Par
ámet
ros
de
pro
ceso
Digestión anaerobia
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Ácidos Grasos Intermedios
Ácidos Grasos Volátiles
(AGV)
Productos mayoritarios del proceso anaerobio
Parámetro eficaz para indicar la evolución del proceso
Parámetro de rápida respuesta ante variaciones del sistema
Par
ámet
ros
de
pro
ceso
Digestión anaerobia
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Ácidos Grasos Intermedios
Acumulación AGV
Velocidad degradación por
alguna causa adversa
Siempre Significa Desestabilización del
proceso
Producción Biogás
•Sobrecarga
•Variación pH
•Falta de nutrientes
•Presencia substancias tóxicas
Par
ámet
ros
de
pro
ceso
Digestión anaerobia
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DIFERENCIAS ENTRE REACTOR RILES Y
REACTOR LODOS
Digestión anaerobia
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Líquido Sólido
VCO Kg DQO/m3 d Kg SV/m3 d
TRH horas días
TRS meses TRH=TRS
Sólido mg DQO/lt Kg SV/m3
V reactor unitario
100-500 m3 1000-10000 m3
Carga continua Semi-continua
Agitación externa
Innecesario Necesaria
Reciclo En general necesario ocasional
Digestión anaerobia
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Par
ámet
ros
de
pro
ceso
Digestión anaerobia
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Presión Parcial de Hidrógeno
Debe mantenerse baja para permitir ladegradación de algunos compuestos intermediariosque de otra forma no sería posible por tratarse dereacciones termodinámicamente desfavorables en
condiciones estándar.
(10-4, 10-5 atm)Presión Parcial H2≈ P
arám
etro
s d
e p
roce
so
Digestión anaerobia
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Principal inhibidor de la Acetogénesis
Presión Parcial H2
Acumulación sustratos intermediarios
Par
ámet
ros
de
pro
ceso
Digestión anaerobia
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Presión Parcial de Hidrógeno
Relaciones C/N
� Una de las ventajas de Digestión Anaerobia es la baja necesidad de nutrientes
� Una relación teórica aceptable es C/N entre 15-30/1
� Un exceso de compuestos nitrogenados puede afectar el proceso
Acumulación Amoniaco
Desestabilización de la Digestión
Par
ámet
ros
de
pro
ceso
Digestión anaerobia
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Aspectos HidrodinámicosAspectos Hidrodinámicos
Influyen en el desempeño de los procesos que se llevan acabo durante el tratamiento. Por tanto, el conocimiento dela hidrodinámica del sistema permitirá mejorar su eficienciay estabilidad.
• Características de flujo
• Régimen de mezcla
• Tiempos de residencia
• Geometría del reactor
Par
ámet
ros
de
pro
ceso
Digestión anaerobia
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Reactores Mezcla Completa Reactores Mezcla Completa
F F
Del balance de células y dado que se opera a volumen cte:
( ) XXXV
F
dt
dX µ+−= 0
V
FD =
•Velocidad de dilución cte
•Velocidad de crecimiento microorganismos cte
µ=
µ=
Re
acto
res
Digestión anaerobia
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“Ecología Microbiana” herramienta en
bioprocesos
Abrir “black box”
� Fundamental interés
� Interés aplicado: Herramienta de gestiónde operación (previsión , diagnostico, control)
Técn
icas
mo
lecu
lare
s
Estudio de microorganismos en bioprocesos
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Microorganismos
Aproximadamente se
conocen solo 7000
Técnicas moleculares
Escala laboratorio
Escala industrial
Estudio de microorganismos en bioprocesos
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En plantas de tratamiento de aguas:
- Floculos (lodos activos)
- Biofilms, tratamientos aerobios
- Sistemas anaerobios
Microorganismos
Técnicas moleculares
Estudio de microorganismos en bioprocesos
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En la digestión anaerobia participan bacterias y arqueas
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Materia orgánicasuspendida
Orgánicos solubles
Ácidos grasos volátiles
Acetato H2, CO2
CH4 + CO2
Hidrólisis
Acidogénesis
Acetogénesis
Metanogénesis
Bacterias fermentativas
Bacteriasacetogénicas
• Methanosarcinaceae
• Methanosaetaceae
• Methanobacteriales
• Methanomicrobiales
Arqueas metanogénicas
Técnicas moleculares para el estudio de Digestores anaerobios
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¿Por qué es importante el estudio de los microorganismos en el proceso de digestión anaerobia?
• Establecer correlaciones entre la dinámica microbiana y la dinámica funcional de los digestores
• Encontrar indicadores tempranos de inestabilidad en el sistema
• Establecer nuevos parámetros de monitoreo y control
• Diseñar estrategias operacionales que mejoren la eficiencia del proceso en base a una configuración microbiana específica
Técnicas moleculares para el estudio de Digestores anaerobios
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• Representativa (lugar y homogénea, UASB, CSTR)• Bien preservada (transporte en frío/hielo seco, congelada,
N2 líquido, RNA later)
• Con reactivos estandarizados (kits)• Si no es en fresco, extraer muestras el
mismo día
• Integridad • Concentración de ADN/ARN• Pureza (inhibidores de PCR)
Muestreo de lodo del digestor
Extracción de ácidos nucleicos
Determinación calidad y cantidad
ADN/ARNFijación
Procedimiento general para estudiar microorganismos en lodos
• Secuenciación(16S ARNr, WGS)
• qPCR(microorganismoso genes funcionales)• FISH
Técnicas moleculares para el estudio de Digestores anaerobios
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Extracción de ácidos nucleicos
Muestra de lodo
(buffer de lisis, esferas)
3- Retención de ADN/ARN
4- Eliminación de materia orgánica e inorgánica remanente (etanol)
5- Elución con buffer TE o agua libre de nucleasas
1- Lisis de células
(columna de sílice en ambiente salino)
2- Precipitación de sustancias húmicas y proteínas
ADN/ARN
Fenol/cloroformo
Precipitación Ac. nucleicos con isopropanol
Adicionalmente para extraer ARN
Técnicas moleculares para el estudio de Digestores anaerobios
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• Extracciones más eficientes al combinar ruptura química y física (Lebuhn et al., 2016)
UltraClean® Soil DNA Isolation Kit
QIAamp DNA Stool Mini Kit
FastDNA™ SPIN Kit for Soil88.24%
60.58%
37.48% Buffer de lisis
Buffer de lisis + esferas
Eficiencias de extracción
• Los métodos enzimáticos sin disrupción mecánica tienen baja recuperación de bacterias gram positivas (Kennedy et al., 2014)
Técnicas moleculares para el estudio de Digestores anaerobios
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Determinación de la calidad del material genético
Posible degradación de ADN o ARN debido a presencia de nucleasas
ADN ARN (gel desnaturalizante)
23S
16S
Electroforesis en gel de agarosa
Razón de intensidad 23S/16S ~ 2
Técnicas moleculares para el estudio de Digestores anaerobios
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RIN: Número de integridad del ARN
Intacto
Degradación parcial
Degradación alta
RIN = 10
RIN = 5
RIN = 3
Bioanalyzer
Técnicas moleculares para el estudio de Digestores anaerobios
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• Valores bajos = proteínas, fenoles, etc.
Pureza del material genético:
Nanodrop
• Razones de absorbancia
- 260/280 nm: ADN puro ~ 1.8 ARN puro ~ 2.0
- 260/230 nm: Usualmente mayores que 260/280 nm.
• Valores bajos = contaminantes (Trizol, guanidina, ácidos húmicos)
Técnicas moleculares para el estudio de Digestores anaerobios
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Las tecnologías de secuenciación avanzan de forma exponencial
Las más utilizadas actualmente
Técnicas moleculares para el estudio de Digestores anaerobios
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Tecnología Ion Torrent Illumina 454
Tiempo de secuenciación (h)1 3 24 8
Largo de sequencia1 400 300 700
Cantidad datos generados (Mb)1 1.000 1.500 35
Tasa de error (%)2 1,47 0,92 1,06
1. Liu et al. (2012)
2. D´Amore et al. (2016)
Cada tecnología tiene sus ventajas y desventajas
Técnicas moleculares para el estudio de Digestores anaerobios
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Tecnologías de tercera generación
MinION (Oxford nanopore tech.)
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Tecnologías de tercera generación
PacBio
Técnicas moleculares para el estudio de Digestores anaerobios
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Secuenciación
Gen 16S ARNr
Todo el material genético
• Abundancia relativa de los microorganismospresentes
• Abundancia relativa de los genes y microorganismos presentes
Extracto de ADN
Configuración poblacional
Configuración poblacional y funcional
El producto final del proceso de secuenciación
Técnicas moleculares para el estudio de Digestores anaerobios
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Secuenciación
16S ARNr
Todo el material genético(WGS)
• Nivel de actividad de los microorganismospresentes
• Nivel de actividad de los genes y microorganismos presentes
Extracto de ARN
Tanscripción reversa
ADNc
Técnicas moleculares para el estudio de Digestores anaerobios
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Secuenciación del amplicon 16S ARNr
Hasta el día de hoy el más utilizado en estudios de D.A.- Más económico, procesamiento de datos menos complejo.- Sesgo asociado a PCR, sin información funcional.
Región hipervariable % Publicaciones 2016-2017
V1-V2 8
V1-V3 8
V3-V4 16
V3-V5 8
V4 42
V4-V5 9
V5-V6 8
Tremblay et al. (2015): Región V4 describe con mayor exactitud la comunidadmicrobiana en muestras de lodo anaerobio
Técnicas moleculares para el estudio de Digestores anaerobios
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qPCR
DNA polimerasa
dNTPs (A, T, C, G)
Partidores
ADN o ADNc
reactantes
catalizador
Sybr Green o sonda fluorescente
Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa
Utilidad: Determinar la dinámica de microorganismos (bacterias y arqueas) mediante la cuantificación del número de copias de un gen.
Señal fluorescente de producto
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qPCR Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa
• El número de copias del gen en la muestra es determinado por interpolación del Cqen una curva estándar (cuantificación absoluta).
108 107106105104103
Cq
• Cinética monitoreada en tiempo real, valor de Cq inversamente proporcional al número de copias inicial.
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qPCR
16S ARNr
Genes funcionales
Grupo de arqueas1
Extracto de ADN (abundancia)
Metanógenos (mcrA)2
Acetógenos (fths)3
Degradadores de aromáticos (bamA)4
Familias: Methanosarcinaceae
Methanosaetaceae
Ordenes: Methanomicrobiales
Methanobacteriales
Extracto de ARN (actividad)
1: Yu et al. (2005) 2: Morris et al. (2014) 3: Xu et al. (2009)4: Kuntze et al. (2011)
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Ventajas1- Cuantificación de muchas muestras en corto tiempo 2- Barato en comparación a la secuenciación.
Deventajas
1- La información se limita al microorganismo o gen que se quiere cuantificar.2- Puesta a punto del ensayo puede demorar (diseño de partidores, programa térmico especial, etc.)3- El número de copias incluye también el contenido en células muertas
qPCR
Técnicas moleculares para el estudio de Digestores anaerobios
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Otros usos
Propuesto como técnica de fingerprinting rápida para determinar cambios en las poblaciones metanogénicas (Kim y Lee, 2014)
High resolution melting:
Productos de PCR poseen un punto de melting característico
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Casos prácticos de estudio de comunidades microbianas en digestores sometidos a un cambio
operacional
Caso práctico 1: Seguimiento de digestor anaerobio frent e a unadisminución de temperatura
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¿Qué ocurre al disminuir la T en un digestor industrial?
¿Cuál es el efecto en la comunidad microbiana?
Caso práctico 1: Seguimiento de digestor anaerobio frent e a unadisminución de temperatura
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- Volumen: 3.000 m3
- TRH: 34 d- VCO: 0,82 kg SV/m3/d - 35 °C (digestor control)
• Digestor control y experimental• Efecto de la T sobre la producción de metano
1 2 3 4 5 6 7 8
Caso práctico 1: Seguimiento de digestor anaerobio frent e a unadisminución de temperatura
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Muestras de lodo
Extracción ADN
Seq 16S ARNr (V4-V5)
FROGS
- 80 °C
CAJ, ACP (XLSTAT)
Caso práctico 1: Seguimiento de digestor anaerobio frent e a un cambio de temperatura
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B-3B-6B-4B-5B-7A-2B-2A-1B-1A-8B-8A-5A-3A-4A-6A-7
0 0,2 0,4 0,6 0,8
Bray-Curtis dissimilarity
• Las comunidades microbianas cambian con la temperatura
• Forman un clúster separado aquellas muestras tomadas a baja T
Caso práctico 1: Seguimiento de digestor anaerobio frent e a un cambio de temperatura
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Al restaurar T en B, comunidad microbiana similar a control (resiliencia)
Caso práctico 1: Seguimiento de digestor anaerobio frent e a un cambio de temperatura
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Pearson: algunos OTUs se correlacionan con variables operacionales
Caso práctico 1: Seguimiento de digestor anaerobio frent e a un cambio de temperatura
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Abundancias relativas de arqueasControl Experimental
Caso práctico 1: Seguimiento de digestor anaerobio frent e a un cambio de temperatura
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Correlación negativa Woesearchaeota (sedimentos, aguas superficiales) y Tpositiva con Methanospirillum (hidrogenotróficas)
Caso práctico 1: Conclusiones
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• Esta perturbación generó un cambio en la comunidadmicrobiana del reactor, lo cual, podría explicar en parte elcambio en su desempeño
• La disminución de temperatura causa una baja en laproducción específica de metano
• La estructura microbiana en el digestor experimental se recuperaal momento de retomar la temperatura original y junto con esto,se observa una recuperación en la producción de metano.
Caso práctico 2: Seguimiento de digestor anaerobio frent e a un cambio de sustrato
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¿Cambia la comunidad microbiana del digestor al cambiar el tipo de sustrato?
Lodo biológico + primario
Lodo biológico hidrolizado + primario
Caso práctico 2: Seguimiento de digestor anaerobio frent e a un cambio de sustrato
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- Volumen: 15.000 m3
- TRH: d- VCO: kg SV/m3/d - 35 °C Alimentación con lodo hidrolizado
Cambio a lodo hidrolizado generó acidificación
Caso práctico 2: Seguimiento de digestor anaerobio frent e a un cambio de sustrato
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Muestras de lodo
Extracción ADN
Seq 16S ARNr (V4-V5)
Pipeline externo
- 20 °C
CAJ, ACP (XLSTAT)
Caso práctico 2: Seguimiento de digestor anaerobio frent e a un cambio de sustrato
3er curso RED TRITÓNValparaíso (Chile) 26-julio-2017
Pre-acidificación Acidificación Post-acidificación
SymbiobacteriumClostridium
Methanosarcina
Cambio en las abundancias relativas de los microorganismos
Caso práctico 2: Seguimiento de digestor anaerobio frent e a un cambio de sustrato
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0%
20%
40%
60%
80%
100%
Ab
un
dan
cia
rela
tiva
Methanobacteriales Methanomicrobiales
Methanosarcinaceae Methanosaetaceae
qPCR:Confirmación de dominancia de Methanosarcinaceae
después de acidificación
Pre-acidificación Acidificación Post-acidificación
Caso práctico 2: Seguimiento de un digestor anaerobio fr ente a un cambio de sustrato
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Los cambios en las poblaciones microbianas asociados a los cambios de [AGVs]
Agrupamiento de las muestras según sus perfiles microbianos
Caso práctico 2: Seguimiento de digestor anaerobio frent e a un cambio de sustrato
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Comunidades post-acidificación: Alta productividad de biogás
Caso práctico 2: Conclusiones
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• Este evento de acidificación está asociado a un cambio de laspoblaciones microbianas.
• El cambio a sustrato hidrolizado generó un evento deacidificación.
• Las poblaciones microbianas alcanzaron una nueva configuraciónla cual está asociada a una estabilidad en términos de AGVs y deproductividad de biogás.
TRATAMIENTO Y RECICLAJE DE AGUAS INDUSTRIALESMEDIANTE SOLUCIONES SOSTENIBLES FUNDAMENTADASEN PROCESOS BIOLÓGICOS. RED TEMÁTICA 316RT0508
Financiado por:
3er curso RED TRITÓNValparaíso (Chile) 26-julio-2017
Con la colaboración de: