Unité fonctionnelle de Cytogénétique Hôpital Robert Debré (AP-HP) Paris
DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE
ADNpatient *Cy3
ADNtémoin*Cy5
Cohybridation
Lavage
Lecture parscanner
Analyse des rapports de fluorescence Cy3/Cy5
par un logicieladapté
Marquagedes ADN
Principe de la CGH Principe de la CGH arrayarray
Puce 2500clones (BAC)
Wolf-Hirschhorn Cri du Chat
Williams-Beuren
Langer-Giedion
Prader-Willi / Angelman
Miller-Dieker
Smith-Magenis
DiGeorge
13
21
18
YX
Quelle technologie utilise Prenatal BoBs?
BACs on Beads utilise le couplage de sondes d’ADN générées à partir de chromosomes bactériens artificiels (BACs) sélectionnés et amplifiés par PCR, sur les billes Luminex codées par fluorescence.5 sondes BACs-on-Beads indépendantes sont inclus es pour les chromosomes 13, 18, 21, X et Y et 4 à 8 sondes sont incluses pour chaque région.
Prenatal BoBs
ACs n ead
Random Primer SolutionBiotin-dNTP MixPolymeraseSample Diluent
Marquage de l’ADN à la Biotine
Biotine
J1
Purification de l’ADN
Kit de purification Purelink INVITROGEN Biotine
Colonne avec filtre
Hybridation de l’ADN sur les billes
Biotine
Sonde fixée sur les micro billes
Hybridation à 52°C à 1200 rpm16 à 20H
Dénaturation 5 mn à 85°C
Wash Buffer 1
Lavages
Elimination de l’ADN non hybridé
ADN marqué non-hybridé
Filtre 0,45 µm en µplaque
J2
Reporter ConcentrateReporter Diluent
Révélation du signal
Biotine
Streptavidine
Phycoérythrine
37°C 1200 rpm
Wash Buffer 2
Lavages
Filtre 0,45 µm en µplaque
Streptavidine non couplée
Lectures des billes
Lecture d’une plaque complète = 2h
Lectures des billes
Le laser vert identifie le signal de la phycoérythrine sur l’ADN
Le laser rouge identifie le signal de la bille
Profil féminin normal
Profil masculin anormal
Notre expérienceà Robert Debré
BACs on Beads utilise le couplage de sondes d’ADN générées à partir de chromosomes bactériens artificiels (BACs) sélectionnés et amplifiés par PCR, sur les billes Luminex codées par fluorescence. 5 sondes BACs-on-Beads indépendantes sont inclus es pour les chromosomes 13, 18, 21, X et Y et 4 à 8 sondes sont incluses pour chaque région.
Nos résultatsDe avril 2011 à juillet 2012
Intérêts
– Rendu de résultats rapide– Seulement ? ng d’ADN nécessaire soit 2mL
de LA ou 1 petite villosité– Comparaison avec des références mâles et
femelles– Jusqu’à 44 patients par plaque– Jusqu’à 100 sondes par puits dont 4 à 8
sondes par région étudiée– Screening plus large (dont contrôles sur
quelques autosomes)
Exemple d’une découverte d’une tétrasomie 12p chez un fœtus
Exemple d’une découverte d’une délétion 7q11 (Sd de Williams) chez un fœtus présentant un
RCIU à 34SA
Inconvénients
– Non détection des translocations équilibrées ?– Difficulté d’interprétation des triploïdies– Technique très manuelle– Technique coûteuse ?– Certaines microdel étudiées inutiles ?
Exemple d’une triploïdie chez un fœtus