TÓM TẮT BÀI BÁO CÁO KHOA H ỌC

CƠ CHẾ CỐ ĐỊNH ĐẠM CỦA GIỐNG (CHI) VI KHU ẨN Pseudomonas

Ngô Thanh Phong, Thạc sĩ, GVC, Bộ môn Sinh học – Khoa KHTN Tóm tắt (Abstract)

Tìm hiểu cơ chế cố định đạm của giống (chi) Pseudomonas và các yếu tố ảnh hưởng đế quá trình cố định đạm sinh học. Bước đầu đã kiểm tra đánh giá được các dòng này có khả năng cố định đạm bằng phương pháp Nitroprusside và phương pháp khử acetylen, đồng thời cũng đ4a xác định được sự hiện diện của gen nif. Nội dung chính của bài báo cáo khoa học đề cập đến các thành phần cấu tạo nên enzym nitrogenase, hệ thống gen nif điều khiển quá trình tổng hợp nitrogenase, cơ chế cố định đạm và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định đạm của vi khuẩn sống tự do. Đây là phần tìm hiểu về tài liệu cũng như những kết quả đạt được trong giai đoạn đầu của đề tài nghiên cứu sinh 2008-2012 “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn cố định đạm Pseudomonas bón cho cây lúa cao sản vùng Đồng bằng sông Cửu Long”.

I. Giới thi ệu

Cố định đạm sinh học là quá trình khử N2 thành NH3 dưới sự xúc tác của hệ enzyme nitrogenase. Sau đó, NH3 có thể kết hợp với các acid hữu cơ để tạo thành protein. Trong không khí, N2 ở dạng rất bền và số lượng rất phong phú, chiếm 78,16% theo thể tích và 75,5% theo khối lượng. Cây trồng cũng như các loài động vật và người không có khả năng đồng hóa trực tiếp nguồn N2 tự do từ không khí (Nester et al., 2004).

Quá trình cố định đạm xãy ra trong tế bào vi khuẩn và vi khuẩn lam đều giống nhau là nhờ chúng có hệ thống gen nif (ni là chữ viết tắt của nitrogen – nitơ và f là fixing – cố định) điều khiển quá trình tổng hợp enzyme nitrogenase. Nitrogenase là hệ enzyme xúc tác cho phản ứng khử N2 thành NH3. Như vậy, hệ thống gen nif được xem là hệ thống gen điều khiển cho quá trình cố định đạm sinh học. Tuy nhiên, ở vi khuẩn lam, quá trình cố định đạm không phải xãy ra ở bất kỳ tế bào nào mà chỉ có thể xãy ra ở dị bào (heterocyst) (Heldt, 1999).

Những nghiên cứu gần đây cho biết tổng số nitơ cố định được ứng dụng bởi vi sinh vật trên toàn thế giới khoảng 175 triệu tấn trong một năm. Nhiều loài vi sinh vật có khả năng sử dụng N2 từ không khí để chuyển thành nguồm đạm sinh học nhờ hệ thống sinh hóa chuyên biệt. Theo Hardy et al. (1973), lượng đạm mà các vi sinh vật trên Trái đất có thể cố định hàng năm lên đến 175x106 tỉ tấn. Cố định đạm sinh học trên lúa làm tăng đạm tổng số lên 20-25% (Döbereiner, 1992). Theo thí nghiệm của Cao Ngọc Điệp (2005), khi tưới dịch vi khuẩn Pseudomonas spp. lên lúa cao sản trồng trên đất phù sa ở Cần Thơ đã giúp tăng năng suất lúa lên 20-37%. Vì vậy, việc nghiên cứu cơ chế cố định đạm sinh học của vi khuẩn là vấn đề cấp thiết đã được các nhà khoa học triển khai nhằm làm tăng tính hiệu quả ứng dụng vi sinh vật cố định đạm, đặc biệt là nhóm vi sinh vật được ứng dụng cố định đạm với cây lúa nước. Vi khuẩn Pseudomonas spp. là một trong những dòng vi khuẩn sống trong đất vùng rễ cây, chúng có khả năng cố định đạm cung cấp cho cây lúa và kích thích sự phát triển của cây lúa tương tự như vi khuẩn nội sinh (Cao Ngọc Điệp, 2005). Dòng Pseudomonas stutzeri A15 đã được phân lập từ đất vùng rễ lúa ở Trung Quốc và đã dự kiến đưa vào sản xuất phân bón sinh học phục vụ sản xuất nông nghiệp. (http//www. Agr.kleuven.ac.be/dtp/cmpg.htm).

Loài Pseudomonas stutzeri được xác định khả năng cố định đạm từ lâu (Krotzsky và Werner, 1987) và loài vi khuẩn Alcagenes faecalis A15 là một loài vi khuẩn cố định đạm cho cây lúa cao sản được nông dân Trung quốc sử dụng cũng đã lâu (Yiu et al., 1983) nhưng sau đó nó được các nhà khoa học Bỉ phân loại chính xác dựa trên bộ genome của nó là Pseudomonas stutzeri (Vermeiren et al., 1999), thế nhưng các loài thuộc giống Pseudomonas có khả năng cố định đạm được xác định từ những năm 1994 (Chan et al., 1994) và một số nghiên cứu đã chứng minh những loài thuộc giống vi khuẩn Pseudomonas spp. có khả năng cố định đạm như Pseudomonas diminuta, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas paucimobilis, Pseudomonas pseudoflava, Pseudomonas putida, Pseudomonas saccharophila, Pseudomonas stutzeri và Pseudomonas vesicularis (Chan et al., 1994).

Những dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm, trong đó có một số dòng Pseudomonas, là nhờ hệ thống gen nif trong bộ máy di truyền của tế bào vi khuẩn có khả năng tổng hợp hệ enzyme nitrogenase. Chính nitrogenase sẽ xúc tác cho quá trình chuyển hóa cố định N2 tự do thành đạm sinh học. Trong giai đoạn đầu thực hiện luận án Nghiên cứu sinh, việc sử dụng phương pháp Nitroprusside – 640nm và phương pháp Khử acetylen đã xác định nhiều dòng Pseudomonas (và Burkholderia) có khả năng cố định đạm. Nội dung của báo cáo khoa học này sẽ đề cập đến “Cơ chế cố định đạm của giống (chi) vi khuẩn Pseudomonas” và các vấn đề có liên quan.

II. Nội dung II.1. Enzyme nitrogenase

- Khái quát về enzyme nitrogenase. - Cấu tạo của enzyme nitrogenase.

II.2. Cơ chế cố định đạm của Pseudomonas

II.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định đạm II.4. Các phương pháp thí nghiệm chứng minh vi khuẩn có khả năng cố định đạm

- Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường không đạm - Phương pháp Phenol – Nitroprusside - Phương pháp khử acetylen (ARA)

III. K ết luận

Bước đầu đã xác định 102 chủng Pseudomonas có khả năng cố định đạm ở mức độ phòng thí nghiệm. Đang chọn lọc 18 chủng vi khuẩn Pseudomonas có khả năng cố định đạm hữu hiệu để triển khai thí nghiệm với cây lúa trồng trong dung dịch và trồng trong chậu đất ở mức độ ngoài trời. Tài liệu tham khảo TIẾNG ANH Anderson, K. L. and G. 2009. Purdom Understanding the Implications for Bacterial

Adaptation to Adverse Environments. June 3, 2009. Balloni, W. and F. Favilli. 1987. Effect of some agricultural practices on the biological soil

fertility. In: Scientific basis for soil protection in the ...

Bothe, H. and G. Neuer. 1988. Electron donation to nitrogenase in heterocysts. Methods in Enzymology, 167: 496-501.

Cao Ngoc Diep and Ton Minh Dien. 2006. Application of Pseudomonas stuzerias Major Composition in Biologycal Nitrogen Fertilizer For Safety Vegetable Cultivation. Proceedings of International Workshop on Biotachnology in Agriculture. Nong Lam University Ho Chi Minh City 10-2006.

Chan, Y., W. L. Barraquio and R. Knowles. 1994. N2-fixing pseudomonads and related soil bacteria. FEMS Microbiology Reviews 13 (1994) 95-118.

Charpy-Roubaud, C., L. Charpy, A. W. 2001. Atmotphric dinitrogen fixation by benthic communities of Tikehau Lagoon and its contribution to benthic primary production. Mar. Biol. 139: 991-997.

Curatti, L., J. A. Hernandez, R. Y. Igarashi, B. Soboh, D. Zhao and L. M. Rubio. 2007. In vitro synthesis of the iron–molybdenum cofactor of nitrogenase from iron, sulfur, molybdenum, and homocitrate using purified proteins. Edited by Sydney Kustu, University of California, Berkeley, CA, and approved. September 25, 2007.

Desnoues, N., M. Lin, X. Guo, L. Ma, R. Carreno-Lopez and C. Elmerich. 2003. Nitrogen Fixation genetics and Regulation in a Pseudomonas stutzeri Strain Associated With Rice. Microbiology (2003), 149, 2251-2262.

Dixon, R. and D. Kahn. 2004. Genetic regulation of biological nitrogen fixation. Nature Reviews Microbiology 2, 621-631.

Döbereiner, J. 1992. History and new perspectives of diazotrophs in association with non-leguminous plants. Symbiosis. 13: 1-13.

Elmerich, C. and W.E. Newton. 2007. Associative and endophytic nitrogen fixing Bacteria and Cyanobacteria associations – Introduction. Springer, Dordrecht, The Netherlands.

Heldt, H. W. 1999. Plant Biochemistry and Molecular Biology. Oxford Uni. Klipp, W., B. Masepohl, J.R. Gallon and W.E. Newton. 2004. Genetics and regulation of

nitrogen fixation in free-living Bacteria. The Netherlands. Krau, A. et al. 2006. Complete genome of the mutualistic, N(2)-fixing grass endophyte

Azoarcus sp. strain BH72. Nat. biotechnol. 24: 1385-1391. Krotzky, A. and D. Werner. 1987. Nitrogen Fixation in Pseudomonas stutzeri. Arch

Microbiol (1987) 147:48-57. Mattos, K.A., L.M. Pádua, A. Romeiro, L.F. Hallack, B.C. Neves, M.U. Ulisses, C.F.

Barros, A.R. Todeschini, J.O. Previato and L. Mendonca-Previato. 2008. Endophytic colonization of rice (Oriza sativa L.) by the diazotrophic bacterium Burlkholderia kururiensis and its abbility to enhance plant growth. Anais da Academia Brasileira de Ciências 80(3): 477-493.

Moore, L., D. Clack and D. Vodopich. 1998. Botany Visual Resource Library. The McGraw-Hill Companies, Inc

Nester, E.W, D.G. Anderson, C.E. Roberts, N.N. Pearsall and D. Hurley. 2004. Microbiology. The McGraw-Hill Companies, Inc.

Omar, S. 1989. Science: In search of the champion nitrogen fixers. Magazine issue 1679. Sy, A., E. Giraud, P. Jourand, N. Garcia, A. Willems, P. de Lajudie, Y. Prin, M. Neyra, M.

Gillis, C. Boivin-Masson and B. Dreyfus. 2001. Methylotrophic Methylobacterium bacterria nodulate and fix nitrogen in symbiosis with legumes. J. Bacteriol. 183: 214-220.

Tan, Z.T., T. Hurek, P. Vinuesa, P. Muller, J.K. Ladha and B. Reinhold-Hurek. 2001. Specific detection of Bradyrhizobium and Rhizobium strains colonizing Rice (Oryza

sativa) roots by 16S-23S ribosomal DNA Intergenic spacer-targeted PCR. Appl. Environ. Microbiol. pp. 3655-3664.

Xie et al. 2006. Interraction between NifL and nifA in the nitrogen-fixing Pseudomonas stutzeri A1501. Microbiology 152: 3535-3542.

Xie, G. H., Z. Cui, J. Yu, J. Yan, W. Hai and Y. Steinberger. 2005. Identification of nif genes in N2-fixing bacterial strains isolated from rice fields along the Yangtze River Plain. Accepted: 4 July 2005.

Yabuuchi, E., Y. Kosako, H. Oyaizu, I. Yano, H. Hotta, I. Hashimoto, et al. 1992. Proposal of Burkholderia gen nov. And transfer of seven species of the genus Pseudomonas homology group II to the new, with type species Burkholderia cepacia. Microbiol Immunol 36: 1251-1275.

Yabuuchi, E., Y. Kosako, H. Oyaizu, I. Yano, H. Hotta and Y. Nishiuchi. 1995. Transfer of two Burkholderia and an Alcaligenes species to Ralstonia gene nov. Proposal of Ralstonia pickettii. Microbiol Immunol 39: 897-904.

Yan, Y., J. Yang, Y. Dou, M. Chen, S. Ping, J. Peng, W. Lu, W. Zhang, Z. Yao, H. Li, W. Liu, S. He, L. Geng, X. Zhang, F. Yang, H. Yu, Y. Zhan, D. Li, Z. Lin, Y. Wang C. Elmerich and Q. Jin. 2008. Nitrogen fixation island and rhizophere competence traits in the genome of root-associated Pseudomonas stutzeri A1501. PNAS. Vol.105, no.21: 7564-7569.

Vermeiren, H. et al. 1999. The rice inoculant strain Alcaligenes faecalis A15 is a nitrogen-fixing Pseudomonas stutzeri. Syst Appl. Microbiol. 22: 2150224.

TIẾNG VIỆT Cao Ngọc Điệp. 2005. Ảnh hưởng của dịch vi khuẩn Pseudomonas spp. lên lúa cao sản

trồng trên đất phù sa ở Cần Thơ. Tạp chí khoa học Đại Học Cần Thơ. Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp. 2009. Vi sinh vật môi trường. Giáo trình nghiệm thu

năm 2009 – Đại Học Cần Thơ. TRANG WEB http//www.Agr.kleuven.ac.be/dtp/cmpg.htm http//www.pnas.org/content/105/21/7564/F2.large.jpg