Tallinna Reaalkool
TiO2 nanoosakestest valmistatud nanokilede fotokatalüütiliste
omaduste uurimine elusrakkude näitel
Uurimistöö
Markus Laars
11c
Juhendaja: Katre Juganson,
KBFI ja TTÜ doktorant
Kaasjuhendaja: õp Andrus Kangro
Tallinn 2014
Sisukord
Kasutatud lühendid .................................................................................................................. 4
Sissejuhatus ............................................................................................................................... 5
1. Kirjanduse ülevaade ............................................................................................................. 7
1.1. Nanoosakesed ................................................................................................................. 7
1.1.1. Nanoosakeste iseloomustus ja kasutusalad................................................................. 7
1.1.2. TiO2 nanoosakesed ..................................................................................................... 7
1.2. Bakterid ........................................................................................................................ 10
1.2.1. Ülevaade bakterirakust ........................................................................................... 10
1.2.2. Bakterite roll loodus- ja inimkeskkonnas ............................................................... 11
1.2.3. Bakteritest tingitud ohud tervisele .......................................................................... 12
1.2.4. Mudelorganism Escherichia coli ............................................................................ 13
1.2.5. Luminestseeruvad bakterid ..................................................................................... 13
2. Materjalid ja meetodid ....................................................................................................... 15
2.1. Uurimistöös kasutatud vahendid ................................................................................ 15
2.1.1. TiO2 nanokiled ........................................................................................................ 15
2.1.2. Escherichia coli pSLlux ......................................................................................... 16
2.2. TiO2 nanokilede mõju uurimine ................................................................................. 17
2.2.1. Katse parameetrid ................................................................................................... 17
2.2.2. Escherichia coli pSLlux’i eksponeerimine TiO2 nanokiledel ja kontrollalustel .... 17
2.2.3. Antibakteriaalse mõju hindamine ........................................................................... 18
3. Tulemused ja arutelu ......................................................................................................... 20
3.1. Katsetingimuste optimeerimine TiO2 nanokilede mõju uurimiseks ....................... 20
3.1.1. TiO2 nanokilede valik ............................................................................................... 20
3.1.2. Optimaalsete tingimuste leidmine E. coli pSLlux kultuuri ettevalmistamiseks ....... 20
3.1.3. Sobivate lahjenduste valimine E. coli pSLlux’i arvukuse määramiseks .................. 22
3.1.4. Bakteritilga räni monokristallist alustelt ja TiO2 nanokiledelt mahapesemise
efektiivsuse kontrollimine ...................................................................................... 23
3.2. TiO2 nanokilede mõju uurimine Escherichia coli pSLlux’iga .................................. 24
3.2.1. TiO2 nanokilede ja kontrollaluste mõju E. coli pSLlux’ile pimedas ........................ 24
3.2.2. TiO2 nanokilede ja kontrollaluste mõju E. coli pSLlux’ile UV-valguses ................. 25
Kokkuvõte ............................................................................................................................... 29
Kasutatud materjalid ............................................................................................................. 31
Tänuavaldused ........................................................................................................................ 34
Lisa 1 Skaneeriva elektronmikroskoobi pilt TiO2 nanokilest ............................................ 35
Lisa 2 Bakterite eksponeerimine alustele pimedas .............................................................. 36
Lisa 3 Bakterite eksponeerimine alustele UV-valguses ....................................................... 38
Lisa 4 Skaneeriva elektronmikroskoobi pilt räni monokristallist alusel ja TiO2 nanokilel
UV-kiirgusele ja pimedas eksponeeritud E. coli pSLlux rakkudest ............................ 40
Resümee ................................................................................................................................... 41
Abstract ................................................................................................................................... 42
Kasutatud lühendid
CFU – kolooniat moodustav ühik [ingl. Colony Forming Unit]
LB sööde – Luria-Bertani sööde
SEM – skaneeriv elektronmikroskoopia
TiO2 – titaandioksiid
UV-kiirgus - ultraviolettkiirgus
Sissejuhatus
Titaandioksiidi (TiO2) nanoosakesi toodetakse maailmas hinnanguliselt 550 - 5500 tonni
aastas (Piccino et al. 2012) ning need leiavad kasutust väga erinevates eluvaldkondades:
päikesekreemides ja -patareides, isepuhastuvates pindades, värvides jne (Gupta, Tripathi
2011; The Nanodatabase). Mitmetes eelnimetatud rakendustes kasutatakse TiO2 omadust
neelata lühilainelist valgust, mille käigus oksüdeeritakse orgaanilisi molekule. Kuna TiO2 on
stabiilne, odav, tõhus ja inimestele ning keskkonnale küllaltki ohutu, loetakse seda peaaegu
ideaalseks pooljuhiks. (Gupta, Tripathi 2011)
Traditsiooniliselt kasutatakse erinevate pindade desinfitseerimiseks erinevaid puhastusaineid
või UVC-kiirgusega kiiritamist, ent sellised meetodid pole pikaajaliselt efektiivsed ning
võivad põhjustada mürgistest kemikaalidest või kiirgusest tulenevaid tervisekahjustusi.
Seetõttu on TiO2 nanoosakeste üheks paljulubavaimaks rakendusalaks isepuhastuvad katted,
mis leiaksid kasutust nii meditsiinis, toiduainetetööstuses kui ka igapäevaelus aknaklaasidel.
(Kühn et al. 2003)
Eelnenud informatsiooniotsingutest lähtuvalt on käesoleva uurimistöö teemaks valitud „TiO2
nanoosakestest valmistatud nanokilede fotokatalüütiliste omaduste uurimine elusrakkude
näitel“. Senised tööd TiO2 osakestest valmistatud katete osas on näidanud vähest
antibakteriaalset toimet, mida on õnnestunud tõsta ainult TiO2 nanoosakesi lühilainelise,
inimesele kahjuliku UVC-kiirguse abil aktiveerides. Antud uurimistöö raames tehtud katsed
püüavad selgust tuua, kas uudseid TiO2 nanoosakestest valmistatud kilesid on võimalik
efektiivselt kasutada neid bioloogiliselt vähemkahjustava UVA-kiirgusega aktiveerides.
Käesoleva töö eesmärkideks on uurida, kas anataasi faasis TiO2 nanoosakesed omavad
antibakteriaalset toimet, milline on UVA-kiirguse toime bakteritele, ning kas TiO2
nanoosakesi on võimalik UVA-kiirgusega aktiveerida, saamaks tõhusamat bakteritsiidset
mõju. Uurimistöös püstitati hüpotees: kui anataasi faasis TiO2 nanoosakestest valmistatud
6
kilesid UVA-kiirgusega ergastada, siis nende antibakteriaalne toime on tõhusam, kui ainult
UVA-kiirgusel või TiO2 nanokiledel pimedas.
Uurimistöö käigus tutvutakse TiO2 nanoosakeste eripäraga ja bakteri kui elusraku mudeliga
ning õpitakse baktereid laboratoorsetes katsetes kasutama, nende arvukust hindama. Töö
tulemused on abiks TiO2 nanoosakestel põhinevate bioaktiivsete pindade väljatöötamisel.
Uurimistöö on jaotatud kolmeks suuremaks peatükiks. Esimeses peatükis on ülevaade
teemakohasest kirjandusest, kus käsitletakse nanoosakesi ja keskendutakse täpsemalt TiO2
nanoosakestele ning antakse ülevaade bakterist kui elusraku mudelist. Teises peatükis
kirjeldatakse uurimistöö metoodikat ja kasutatud materjale. Kolmandas peatükis esitatakse
saadud katsetulemused ning arutletakse nende üle.
Uurimistöö allikateks on varasemad uurimused TiO2, fotokatalüüsi ja bakterite kohta ning
meetodeid käsitlevad juhised.
7
1. Kirjanduse ülevaade
1.1. Nanoosakesed
1.1.1. Nanoosakeste iseloomustus ja kasutusalad
Nanoosakesed on osakesed, mille vähemalt üks mõõde jääb vahemikku 1 - 100 nm. Taoliste
osakestega on inimesed ja keskkond kokku puutunud juba aegade algusest saadik. Looduses
tekivad nanoosakesed näiteks vulkaanipursete või metsatulekahjude käigus, aga ka viirused ja
valgud jäävad nanomõõtmetesse. Viimasel sajandil on eelnevatele lisandunud sünteetilised
ehk tööstuslikult toodetud nanoosakesed, mida kasutatakse üha enam täite- ja
kattematerjalides, pooljuhtides, katalüsaatorites, mikroelektroonikas, ilutoodetes ja
ravimikandjatena. (Kahru, Lippmaa 2010)
Nanoosakesi kasutatakse erinevates toodetes eelkõige seetõttu, et nende väikestest
mõõtmetest tulenevalt omandavad nad tavasuuruses osakestest erinevad füüsikalised ja
keemilised omadused. Mida väiksem on osake, seda suurem on tema eripind, seetõttu on
suurem ka osakese reaktiivsus teiste ainetega (Nanotehnoloogia tumedam külg). Sellest, et
sama aine võib omandada nanosuuruses täiesti uued omadused, võib võita nii tööstus kui ka
meditsiin, sest tooted muutuvad väiksemateks, kergemateks ja efektiivsemateks (Kändler
2009). Loodetakse, et nanotehnoloogia toob uusi läbimurdeid näiteks kergemate ja
tugevamate materjalide loomisel, looduskeskkonna puhastamisel, toksiliste kemikaalide
asendamisel, päikesepatareide efektiivsuse tõstmisel ja vähiravis (Kahru, Lippmaa 2010).
Taolised ootused on suurendanud sünteetiliste nanoosakeste tootmist – üheks
enimtoodetavaks nanoosakeseks on kujunenud titaandioksiid, mida toodetakse maailmas juba
550 - 5500 tonni aastas (Piccino et al. 2012).
1.1.2. TiO2 nanoosakesed
Titaandioksiidi nanoosakesi kasutatakse enim päikesekreemides ja kattevahendites, kus nende
ülesandeks on pakkuda kaitset UV-kiirguse eest. Veel on nanosuuruses TiO2 osakesed
kasutusel valge pigmendina mitmesugustes värvides, mille hulka kuuluvad ka toiduvärvid,
8
ning lisandina plastikutes ja tsemendis. Lisaks eelnevatele püütakse TiO2 nanoosakesi
kasutada päikesepatareides ja isepuhastuvates pindades, ent need valdkonnad on alles
arenemisjärgus. (Gupta, Tripathi 2011; Piccino et al. 2012; Weir et al. 2012; The
Nanodatabase)
Joonis 1. Titaandioksiidi osakeste fotokatalüütilise aktiveerimise skeem.
Allikas: Macwan et al. 2011
TiO2 kasutamine mitmetes eeltoodud rakendustes põhineb selle materjali omadusel neelata
lühilainelist valgust. Neeldumise käigus ergastatakse elektron (e-) valentstsoonist
juhtivustsooni ning tekib elektron-auk paar (joonis 1). Tekkinud auk (h+) on võimeline
oksüdeerima pinnal olevat vett hüdroksüülradikaalideks (•OH). Need on omakorda võimelised
oksüdeerima enamikke orgaanilisi molekule. Seetõttu omab TiO2 tugevat fotokatalüütilist
toimet, mille käigus orgaanilised molekulid oksüdeeritakse peamiselt süsihappegaasiks ja
veeks. (Macwan et al. 2011)
1.1.2.1. TiO2 kristallstruktuurid
Titaandioksiidil on kolm põhilist kristallstruktuuri – anataas, rutiil ja brukiit. Need kristall-
struktuurid erinevad omavahel elementide ruumilise paigutuse poolest, mis toob endaga kaasa
selle, et sama keemilise koostisega aine omadused sõltuvad selle struktuurist. Nimetatud
kristallstruktuuridest on kõige stabiilsem rutiil, mis jääb stabiilseks enamikel temperatuuridel
ja rõhkudel kuni 60 kbar. Rutiili faasis olevate TiO2 osakeste fotokatalüütilised omadused on
9
üsna kehvad, mistõttu kasutatakse neid enamjaolt valge pigmendina. Kõige reaktiivsemad on
anataasi kristallstruktuuriga TiO2 osakesed, sest sellises kristallstruktuuris on elektronide
liikuvus parem, madal dielektriline konstant ja kristallid on hõredamad, lisaks on anataasi
faasis kõrgem Fermi nivoo. Eeltoodud omadused võimaldavadki anataasi faasis olevaid TiO2
nanoosakesi kasutada fotokatalüütilistel eesmärkidel. Brukiidi faasis olevad TiO2 osakesed on
küll reaktiivsemad kui rutiili struktuuriga, ent nende reaktiivsus pole nii kõrge kui anataasi
faasis olevatel TiO2 osakestel, mistõttu neid on vähem uuritud. Kõrgematel temperatuuridel
muutub anataasi ning brukiidi faasis olevate TiO2 kristallstruktuur stabiilsemaks rutiiliks.
(Gupta, Tripathi 2011; Macwan et al. 2011)
TiO2 kui pooljuhil on üsna lai keelutsoon – anataasil, rutiilil ja brukiidil on see vastavalt 3,2;
3,02 ja 2,96 eV (Gupta, Tripathi 2011). Elektroni viimiseks valentstsoonist juhtivustsooni
tuleb TiO2 osakest seega ergastada vastavalt lainepikkusega alla 388; 411 ja 419 nm, mis kõik
jäävad UV-kiirguse ja nähtava valguse piirialasse. Seega ilmnevad TiO2 fotokatalüütilised
omadused eriti hästi, kui seda ergastada UV-kiirgusega, ent fotokatalüüsiks sobib
suurepäraselt Päikese valgus, mille spekter sisaldab samuti UV-piirkonda (Moan 2004).
1.1.2.2. TiO2 nanokiled
Antimikroobsete pindade väljatöötamine on muutunud meditsiinis äärmiselt oluliseks, sest
need aitavad steriliseerida töövahendeid ning hoiavad seeläbi ära infektsioone. Taoliste
pindade valmistamiseks püütakse kasutada erinevaid põhimõtteid, näiteks töötatakse välja
selliseid pindasid, mille külge bakterid ei saa kinnituda, mis sisaldavad oma olemuselt
antibakteriaalsed ühendeid, mille antibakteriaalsed omadused saadakse pinda modifitseerides
või mõne füüsikalise teguriga mõjutades. Kõigi eelnimetatud lähenemiste korral on püütud
kasutada ka erinevaid nanoosakesi, näiteks TiO2 nanoosakestega kaetud pindasid saab
lühilainelise kiirgusega aktiivseks muuta. (Campoccia et al. 2013)
TiO2 nanoosakestega saab pindu katta erinevatel meetoditel. Käesolevas uurimistöös
kasutatud nanokiled valmistati vurrkatmise [ing. spin-coating] meetodil. Vurrkatmist
kasutatakse erineva kujuga objektide õhukese kilega katmiseks. Meetod põhineb lahuse
kandmisel pöörlevale alusele, kus vedelik kandub tsentrifugaaljõu mõjul üle aluse.
Keerlemise käigus saavutab kile ühtlase paksuse, mis kile kiire moodustumise tõttu on hästi
reprodutseeritav. (Saarva 2013)
10
Sõltuvalt nanoosakeste sünteesiskeemist võivad neist valmistatud nanokiled sisaldada
orgaanilisi ühendeid, mis on nanoosakeste pinnale füüsikaliselt ja/või keemiliselt
adsorbeerunud. Taolised ühendid võivad osutuda katses kasutatavatele bakteritele
kahjulikuks, mistõttu tuleb need pesemise või kuumutamise teel eemaldada. Kuumutamine
aitab ka nanoosakesi pinnale kinnitada ning muudab kiled erinevatele keskkonnatingimustele
vastupidavamaks. (Saarva 2013)
1.2. Bakterid
1.2.1. Ülevaade bakterirakust
Erinevalt päristuumsetest rakkudest puudub bakteritel membraanidega piiritletud rakutuum
ning nad kuuluvad prokarüootide rühma. Bakterid on üherakulised organismid, nende
mõõtmed jäävad enamasti vahemikku 0,1 kuni 25 µm. Nad saavad elada üksikult, kuid sageli
jäävad pärast pooldumist omavahel seotuks ning moodustavad ahelaid või rakukogumikke.
Väliskuju järgi saab baktereid jaotada kuude rühma: kera-, pulk-, keeritsbakterid, spiraalsed
bakterid ning punguvad ja jätketega bakterid. (Sarapuu 2002: 72)
Kõik bakterirakud on ümbritsetud rakumembraaniga, mis koosneb valkudest ning lipiididest
ja on ehituselt sarnane päristuumsete organismide rakumembraanidega. Membraani katab
rakukest, mis koosneb valdavalt polüsahhariididest, kuid selle ehituses on ka liitlipiide ja
valke. Rakukesta peamine ülesanne on bakterit kaitsta väliskeskkonna mõjude eest. Mõnedel
bakteritel on kest kaetud karvakestega, mille abil bakterid seostuvad üksteisega ning
kinnituvad pindadele. (Sarapuu 2002: 73)
Vastavalt testile, mille esimest korda sooritas Christian Gram 1884. aastal, liigitatakse
bakterid grampositiivseteks ja -negatiivseteks. Testis värvitakse baktereid kristallvioletiga
ning pestakse seejärel 95% etanooliga. Grampositiivsetelt bakteritelt värvi maha pesta ei
õnnestu ning need jäävad mikroskoobis vaadelduna tumedateks, samas gramnegatiivsed
bakterid on peale pesu värvunud heledalt violetseteks. Selline erinevus on tingitud bakterite
ehituslikest iseärasustest – grampositiivsetel bakteritel on ainult üks membraan, mida katab
paks peptidoglükaanikiht, mis aitabki kristallvioleti värvust säilitada. Gramnegatiivsetel
bakteritel on kaks membraani: sise- ja välismembraan, mille vahel on periplasmaatiline ruum,
kus asuvad mitmed ensüümid ja valgud. Peptidoglükaanikiht on gramnegatiivsetel bakteritel
õhuke ja asub kahe membraani vahel. (Kivisaar 2000)
11
Bakterite rakutuuma asendab tuumapiirkond, kus paikneb ühest DNA molekulist koosnev
rõngjas kromosoom, milles geenide arv ulatub kuni kuue tuhandeni. Lisaks rõngas-
kromosoomile on bakteri tsütoplasmas tihti väiksemad DNA rõngad ehk plasmiidid, milles
sisalduvatelt geenidelt sünteesitakse bakteri kasvukeskkonnale eripäraseid ensüüme. Need
aitavad lagundada ümbritsevas keskkonnas olevaid orgaanilisi aineid, mis on vajalik bakteri
toitumiseks, aga ka kahjulike ainete lagundamiseks. Geenid võivad liikuda rõngas-
kromosoomidest plasmiididesse ja vastupidi. (Sarapuu 2002:74)
Bakteritel puuduvad membraanidest koosnevad rakustruktuurid ja nendega ümbritsetud
organellid, tsentrosoom ja tsütoskelett (ibid.). Kõikides bakterirakkudes on ribosoomid, mis
asuvad tsütoplasmas vabalt (Hain et al. 2012: 103).
Bakterid paljunevad pooldumise teel, sellele eelneb raku kasvamine, varuainete süntees ja
rõngaskromosoomi kahekordistumine. Pooldumisel nöördub rakumembraan koos kestaga
sisse ning moodustub kaks umbes samasuurt tütarrakku. Bakterid paljunevad suhteliselt
kiiresti – soodsates kasvutingimustes pooldub enamus baktereid 1 kuni 2 tunniga. Eriti kiiresti
kasvavad bakterid poolduvad iga 20 minuti järel. (Sarapuu 2002:75)
1.2.2. Bakterite roll loodus- ja inimkeskkonnas
Bakterid on kohastunud eluks peaaegu kõikides Maal leiduvates tingimustes ning neil on
ökosüsteemides väga tähtis roll. Ehkki bakterid suudavad lagundada ka elusorganisme, on nad
eelkõige tähtsad just jääkainete ja surnud organismide lagundamisel. Bakterid moodustavad
koos teiste heterotroofsete organismidega laguahelaid, kus oksüdeeritakse orgaanilised ained
anorgaanilisteks aineteks. Neil on oluline osa näiteks mulla tekkel – bakterid lagundavad
pinnasesse sattunud organismide elutegevuse jääkproduktid lihtsamateks ühenditeks, mille
tulemusena tekib huumus. (Sarapuu 2002: 77)
Mõned mullas elavad bakterid osalevad lämmastiku aineringes. Õhulämmastikku (N2) enamik
organisme siduda ei suuda, kuid liblikõieliste juuremügarates olevad lämmastikku siduvad
bakterid suudavad lämmastikule liita vesinikku, moodustades taimedele omastatavat
ammoniaaki. (Hain et al. 2012: 111)
Bakteritel on tähtis roll ka seedimisel: inimesel aitavad jämesooles elavad bakterid lõhustada
mitmeid orgaanilisi aineid, mida inimese seedeensüümid lagundada ei suuda. Sõraliste
12
põhitoiduks on taimed, mistõttu nende seedekulglas olevad bakterid aitavad taimerakkude
kestades olevat tselluloosi lagundada. (Sarapuu 2002: 78)
Baktereid püütakse kasutada ka otseselt inimeste hüvanguks. Neid on aastasadu rakendatud
toiduainetööstuses käärimisprotsessis, et valmistada juustu, hapukurke, veini, äädikat jne.
Geenitehnoloogia areng on viinud selleni, et bakteritel lastakse toota mitmesuguseid ravimeid,
näiteks antibiootikume või valke nagu insuliin või antikehad. Lisaks on bakterid leidnud palju
kasutust keskkonnakaitses, kuna nad suudavad lagundada reovees olevaid jääkaineid või
likvideerida naftareostust. (Hain et al. 2012: 112-113)
1.2.3. Bakteritest tingitud ohud tervisele
Maailmas sureb ligi kolmandik inimestest nakkushaigustesse, millest suurem osa on
põhjustatud viiruste või bakterite poolt. Samas on ainult väike osa bakteritest võimelised
haigusi esile kutsuma, neid nimetatakse patogeenseteks. Patogeenseid baktereid saab jagada
peamiselt kolme gruppi: obligatoorsed patogeenid, mis paljunevad ainult
peremeesorganismis; fakultatiivsed patogeenid, mis paljunevad keskkonnas ja põhjustavad
haigusi kokkupuutel nõrgestatud organismiga; ning oportunistlikud patogeenid, mis on
üldjuhul peremeesorganismile ohutud, kuid võivad haigusi põhjustada vigastatud või nõrga
immuunsüsteemiga organismides. Mõned patogeensed bakterid on spetsialiseerunud kindlale
liigile või perekonnale, teised võivad haigusi põhjustada üsna erinevates organismides.
(Alberts et al. 2002: 1423-1427)
Patogeenne bakter võib temale lähimast mittepatogeensest bakterist erineda vaid mõne geeni
poolest, mida kutsutakse virulentseteks geenideks. Sellised geenid kodeerivad kaht tüüpi
valke – toksiine, mis interakteeruvad otse peremeesraku struktuursete või signaalvalkudega ja
kutsuvad esile patogeeni paljunemiseks soodsa rakulise vastuse; ning valke, mis aitavad
toksiine märklaudrakuni transportida. (Alberts et al. 2002: 1427-1428)
Ehkki bakteritel on eukarüootidega palju sarnasusi, leidub nende DNA replikatsioonis,
transkriptsioonis, translatsioonis ja metabolismis piisavalt erinevusi. Selleks, et patogeenseid
baktereid hävitada, kasutatakse antibiootikume, mille molekulid seonduvad kindlate
bakteriaalsete ensüümidega ja inhibeerivad seeläbi eelnimetatud protsesse. Samas on kiirelt
paljunevad bakterid võimelised ka kiirelt evolutsioneeruma ja selle käigus antibiootikumide
vastu resistentseteks muutuma. Bakterid kasutavad ravimite vastu resistentsuse saavutamiseks
13
kolme peamist strateegiat: nad toodavad ensüüme, mis lagundavad ravimi; nad muudavad
ravimi molekulaarset märklauda nii, et ravimimolekul ei saa sinna enam seonduda; või nad
takistavad ravimi jõudmist märklauani näiteks ravimit endast välja pumbates. Kui patogeenne
bakter on leidnud efektiivse mooduse resistentsuse saavutamiseks, siis levib selleks vajalik
geen üsna kiiresti kogu populatsioonis ning võib edasi kanduda ka teist liiki bakteritele.
Taoline resistentsust tagav strateegia võib antibiootikumide vale kasutamise korral välja
kujuneda ka normaalsesse mikrofloorasse kuuluvates bakterites ning levida neilt edasi
patogeensetele bakteritele. Seega on vaja pidevalt välja töötada uusi ravimeid või võtta
kasutusele teistsuguseid strateegiaid, et patogeensete bakterite vastu võidelda. (Alberts et al.
2002: 1429, 1452-1453)
1.2.4. Mudelorganism Escherichia coli
Elusorganismid on oma ehituselt äärmiselt keerukad, mistõttu on nende uurimisel levinud
mudelorganismide kasutamine. Molekulaarbioloogias on keskseks mudelorganismiks
kujunenud pulgakujuline gramnegatiivne bakter Escherichia coli, mis looduslikult elab
inimese ja teiste selgroogsete soolestikus, ent teda on üsna lihtne ka laboritingimustes
kasvatada. Evolutsiooniliselt on E. coli kohandunud eluks erinevates keemilistes tingimustes
ja ta paljuneb soodsates keskkonnatingimustes väga kiiresti. Molekulaarses mõttes on
E. coli’s toimuvad protsessid enim uuritud ning suurem osa meie teadmistest eluks vajalike
põhimehhanismide kohta (DNA replikatsioon, transkriptsioon, translatsioon) pärinevad
E. coli’ga läbiviidud uuringutest. (Alberts et al. 2002: 27-28)
1.2.5. Luminestseeruvad bakterid
Evolutsiooni käigus on mõned Vibrio ja Photobacterium’i perekonda kuuluvad bakteriliigid
omandanud võime eritada sinakasrohelist valgust ehk bioluminestseeruda. Sellist nähtust
võimaldab lutsiferaasi poolt katalüüsitav ensüümreaktsioon, kus substraadina kasutatakse
taandatud flaviinmononukleotiidi, hapnikku ja pikaahelalisi aldehüüde ning tekivad
flaviinmononukleotiid, pikaahelaline karboksüülhape, vesi ja eraldub valguskvant.
Luminestseerumine on bakteritele küllaltki energiakulukas, sest vajaminevad elektronid
saadakse elektrontransportahelast ja ATP sünteesist. Tõenäoliselt on bakterite võime
bioluminestseeruda arenenud välja sümbioosi eesmärgil – taolised bakterid helendavad ainult
kalade valgusorganites või mõnel potentsiaalsel toiduallikal. (Prescott et al. 1999: 477)
14
Lisaks looduslikult bioluminestseeruvatele bakteritele on konstrueeritud ka baktereid, millesse
on sisse viidud geenid, mis neid luminestseeruvateks muudavad. Sellistes bakterites asetseb
lutsiferaasi kodeeriva geeni järjestus tavaliselt mõne regulatoorse valgu promootori järel,
millest tingituna korreleerub bakterite arvukus otseselt nende poolt emiteeritava valgusega.
Seega on võimalik selliseid luminestseeruvaid baktereid kasutada näiteks mõne aine
toksilisuse hindamiseks – mida vähem bakterikultuur valgust hiilgab, seda vähem sisaldab see
elujõulisi baktereid. Lutsiferaasi kodeeriva geeni järjestust on võimalik asetada ka mõne
kindla molekuli äratundmisega seotud valgu promootori järele. Viimasel juhul saadakse
biosensor, mille poolt emiteeritava valguse hulk sõltub vastava molekuli kontsentratsioonist
keskkonnas. (Ivask et al. 2007)
15
2. Materjalid ja meetodid
2.1. Uurimistöös kasutatud vahendid
2.1.1. TiO2 nanokiled
Uurimistöös kasutati Urmas Joost’i poolt Tartu Ülikooli Füüsika Instituudis sünteesitud TiO2
nanoosakestest valmistatud õhukesi kilesid, mida vaadeldi eelnevalt skaneeriva
elektronmikroskoopiaga (SEM; FEI Helios 600, EDX detektoriga, Oxford Instruments;
Lisa 1). Kontrollina kasutati räni monokristallist (1 0 0) (Sigma-Aldrich) aluseid, mis on
keemiliselt inertsed ning ei avalda bakteritele mõju (joonis 2).
Joonis 2. Uurimistöös kasutatud räni monokristallist alused (vasakul, hallikad) ja TiO2
nanokiledega kaetud alused (paremal, sinakad).
Allikas: Autori foto
TiO2 nanokilede valmistamiseks sünteesiti esmalt Urmas Joost’i poolt Tartu Ülikooli Füüsika
Instituudis sool-geel meetodil TiO2 nanoosakesed. Lähteaineteks olid kommertsiaalselt
saadaval olevad reagendid titaan(IV)butoksiid, para-tolueensulfoonhape, atsetüülatsetoon ja
n-butanool. Dünaamilise valguse hajutamise meetodil mõõdeti sünteesitud osakeste
diameetriks alla 10 nm ning osakeste suurusjaotus oli küllaltki ühtlane. Ramani spektritest
nähtus, et sünteesitud TiO2 osakesed on anataasi kristallstruktuuriga. (Joost et al. 2014)
TiO2 õhukesed kiled valmistati räni monokristallist alustele. Selleks lõigati esmalt räni
monokristallist alused mõõtmetega umbes 1x1 cm. TiO2 nanoosakeste suspensioon kanti
16
süstla abil alustele 0,5 minuti jooksul vurrkatmise meetodil, aluse pöörlemissagedus 3000
pööret minutis. Moodustunud õhukesi kilesid kuumutati muhvelahjus (Nabertherm
L5/11/S27), tõstes temperatuuri kiirusega 100 °C/h ning lastes iga tunni möödudes
temperatuuril ühtlustuda 1 h, kilesid kuumutati kuni 400 °C. Seejärel pesti kilesid
ultrahelivannis (80 kHz, 30%, 30 °C) deioniseeritud veega 10 minutit, et eemaldada osakeste
pinnalt peale kuumutamist allesjäänud adsorbeerunud orgaanilised molekulid.
2.1.2. Escherichia coli pSLlux
Uurimistöös valiti mudelorganismiks Escherichia coli MC1061 (pSLlux; Ivask et al. 2009),
millesse on sisse viidud geneetiline info luminestsentsvalguse tootmiseks (lutsiferiin-
lutsiferaas süsteem) ning antibiootikumi ampitsilliini vastu resistentsuse saamiseks. Taoliselt
modifitseeritud bakteri eeliseks on võimalus viia katseid läbi mittesteriilsetes tingimustes, sest
hiljem on teda võimalik välja selekteerida ampitsilliini sisaldavas söötmes ning hinnata
arvukust lähtuvalt kultuuri luminestseerumisest.
2.1.2.1. Escherichia coli pSLlux kultuuri kasvatamine
E. coli pSLlux kultuuri kasvatamiseks kanti pisut säilituskultuuri Luria-Bertani (LB)
tardsöötmega Petri tassidele ning kasvatati üleöö 30 °C juures. Steriilse keskkonna tagamiseks
lisati söötmele 100 µg/ml ampitsilliini. TiO2 nanokilede mõju uurimiseks külvati mõned Petri
tassile kasvanud kolooniad ümber 100 µg/ml ampitsilliini sisaldavasse LB vedelsöötmesse,
kasvutingimusi (temperatuur, loksutamine, aeg) optimeeriti ning kultuuri juurdekasvu
hindamiseks mõõdeti optilist tihedust spektrofotomeetriga 600 nm juures ning
luminomeetriga emiteeritud valguse hulka.
2.1.2.1.1. Luria-Bertani sööde
LB sööde sisaldab vähe suhkruid ja palju anorgaanilisi aineid ning seda kasutatakse laialdaselt
E. coli kasvatamisel. Selle koostis võimaldab bakteritel kasvada kindla tiheduseni, seejärel
saab kasvu limiteerivaks faktoriks see, et suhkrud saavad otsa ning bakterid peavad hakkama
toituma aminohapetest. Kui kõik orgaanilised toitained saavad otsa, jääb alles ohtralt
anorgaanilisi toitaineid. (Sezonov et al. 2007)
LB vedelsöötme valmistamiseks lahustatakse 1 liitris destilleeritud vees 10 g trüptooni, 5 g
pärmiekstrakti, 10 g NaCl. Lahuse neutraliseerimiseks lisatakse 1 M NaOH lahust. Seejärel
17
sööde steriliseeritakse autoklaavides seda 25 minutit temperatuuril 120 °C. (Sezonov et al.
2007)
2.1.2.1.2. Luria-Bertani tardsöötmega Petri tasside ettevalmistamine
LB tardsöötme valmistamiseks lisati eelmises alapunktis toodud retsepti alusel valmistatud
LB vedelsöötmesse enne autoklaavimist 1,5 % agarit. Steriliseeritud sööde tardub
toatemperatuuril, mistõttu tuleb see enne Petri tassidele valamist vesivannil üles sulatada.
E. coli pSLlux’i selekteerimiseks lasti söötmel jahtuda umbes 40 °C-ni ning lisati sellesse
100 µg/ml ampitsilliini. Seejärel valati igale Petri tassile 20 ml söödet ning lasti
toatemperatuuril tarduda. Ampitsilliini sisaldavaid LB tardsöötmega Petri tasse hoiti 4 °C
juures ning kasutati bakterite külvamiseks kuni nädala jooksul peale valmistamist.
2.1.2.2. Escherichia coli pSLlux kultuuri ettevalmistamine TiO2 nanokilede mõju uurimiseks
TiO2 nanokilede mõju uurimiseks tsentrifuugiti 10 ml punktis 2.1.2.1 kirjeldatud viisil
tihedaks kasvatatud kultuuri kiirusega 3500xg 22 °C juures 10 minutit, et koguda kokku
bakterirakud. Supernatant eemaldati ning bakteritelt LB söötme pesemiseks suspendeeriti
sadet 10 ml 0,9% NaCl lahuses. Tsentrifuugimist ning pesu korrati samade parameetrite
juures ning bakterikultuur viidi 0,9% NaCl-ga tiheduseni 107-10
8 rakku/ml.
2.2. TiO2 nanokilede mõju uurimine
2.2.1. Katse parameetrid
Katse viidi läbi kliimakambris kahel erineval päeval. Kliimakambri temperatuur oli katse
vältel 25 °C ning suhteline õhuniiskus 90%, et minimeerida bakterisuspensiooni aluselt
aurustumist. Kliimakambrisse oli paigaldatud UV lamp spektrivahemikuga 300-400 nm,
spektri maksimumiga 355 nm juures.
2.2.2. Escherichia coli pSLlux’i eksponeerimine TiO2 nanokiledel ja kontrollalustel
TiO2 nanokilede mõju uurimiseks kanti 10 µl punktis 2.1.2.2. kirjeldatud meetodil
valmistatud E. coli pSLlux’i bakterisuspensiooni vastavalt TiO2 õhukese kilega kaetud
alustele ja räni monokristallist kontrollalustele. Alustel olevat bakterisuspensiooni
eksponeeriti UV-kiirgusele esimesel korral 0, 5, 10 ja 15 minutit kahes paralleelis ning teisel
korral 0, 5, 10, 15 ja 20 minutit kolmes paralleelis. Võrdluseks hoiti samas mahus
18
bakterisuspensiooni TiO2 õhukese kilega kaetud alustel ja räni monokristallist kontrollalustel
kliimakambris sama temperatuuri ja õhuniiskuse juures pimedas esimesel korral kahes
paralleelis 15 minutit ja teisel korral kolmes paralleelis 20 minutit.
2.2.3. Antibakteriaalse mõju hindamine
2.2.3.1. Bakterisuspensiooni alustelt pesemine ja tardsöötmele külvamine
Pärast bakterite eksponeerimist erinevatele punktis 2.2.2. toodud tingimustele asetati alused
ümarapõhjalisse polüpropüleenist tuubi, mis sisaldas 1 ml 0,9% NaCl lahust. Bakterite alustelt
pesemiseks tuube loksutati Vortex’il 5 minutit võimsuse 5 juures. Pesemise efektiivsust
kontrolliti, lisades 1 mL 0,9% NaCl lahusesse 10 µL sama bakterisuspensiooni, mida kanti
alustele. Peale loksutamist valmistati saadud suspensioonidest 10-, 100- ja 1000-kordsed
lahjendused, mis külvati punktis 2.1.2.1.2. ettevalmistatud LB tardsöötmega Petri tassidele.
Petri tass jagati neljaks sektoriks, igasse sektorisse pipeteeriti 15 µl vastavat lahjendust
(joonis 3), mis hõõruti steriilse spaatliga sektori piires ringjate liigutustega laiali, alustades
kõige lahjemast lahjendusest (1000x) ning liikudes järjest kontsentreerituma suspensiooni
poole (1x).
Joonis 3. Bakterisuspensiooni lahjenduste tardsöötmele külvamise skeem.
Allikas: Autori andmed.
2.2.3.2. Bakterite arvukuse määramine
Bakterite arvukuse määramiseks inkubeeriti eelmises punktis LB tardsöötmega Petri tassidele
külvatud baktereid üleöö 37 °C juures pimedas. Väljakasvanud bakterikolooniaid loeti kahest
järjestikkusest sektorist, millel kolooniate arv jäi võimalusel vahemikku 10-300. Kolooniate
lugemisel võeti arvesse ainult need, mis pimedas helendasid, et vältida võimalike keskkonnast
söötmele sattunud ampitsilliinile resistentsete bakterite lugemist. Bakterite arvukuse
hindamiseks arvutati kolooniat moodustavate ühikute (CFU) arv ühes milliliitris, nagu on
10x 100x
1x 1000x
19
kirjeldatud standardis ISO 7218:2008 (Microbiology, 2008). Selleks sisestati loetud
kolooniate arv järgnevasse valemisse:
dV
CN
*1,1*
, kus
C on kahe loetud sektori kolooniate summa,
V on sektorile külvatud lahjenduse ruumala (antud katses 0,015 ml) ja
d on lahjenduskordaja. Antud katses lisati väikseima lahjenduse korral 10 µl alusel olnud
bakterisuspensiooni 1 ml 0,9% NaCl, sel juhul lahjenduskordaja 10010
1000
l
ld
.
20
3. Tulemused ja arutelu
3.1. Katsetingimuste optimeerimine TiO2 nanokilede mõju uurimiseks
3.1.1. TiO2 nanokilede valik
Käesolevas uurimistöös valiti potentsiaalselt antibakteriaalseteks pindadeks TiO2
nanoosakestest valmistatud õhukesed kiled, sest senised tööd TiO2 nanoosakeste vallas on
näidanud, et tegemist on stabiilse, odava, tõhusa ning keskkonnale küllaltki ohutu materjaliga
(Gupta, Tripathi 2011). Samas on TiO2 nanoosakesi võimalik lühilainelise kiirgusega
aktiveerida (Macwan et al. 2011) ja leidub mõningaid töid, kus on uuritud nendest valmistatud
õhukeste kilede antibakteriaalset toimet. Taolistes uurimustes on küll näidatud, et TiO2
nanokiled omavad UVA kiirgusega aktiveerides antibakteriaalset efekti, ent üldjuhul pole
suudetud hävitada kõiki baktereid (Kühn et al. 2003; Armelao et al. 2007; Wang et al. 2009;
Aminedi et al. 2013) või on bakterite hävitamiseks kulunud aeg üsna pikk (Sunada et al. 2003;
Yeung et al. 2009; Cushnie et al. 2010). Seega on endiselt vaja leida sellise koostisega TiO2
nanokile, mille antibakteriaalne mõju avalduks lühikese aja jooksul.
Antud uurimistöös valiti TiO2 nanokiled U. Joosti ja kolleegide (Joost et al. 2014) poolt
sünteesitud õhukeste kilede hulgast. Eelkatsed sooritati 400 °C-ni ja 500 °C-ni kuumutatud
õhukeste kiledega ning selgus, et 400 °C-ni kuumutatud pesemata õhuke kile sisaldab veel
bakteritele toksilisi orgaanilisi ühendeid ning on bakteritele surmav ka pimedas teostatud
ekspositsiooni korral. 400 °C-ni kuumutatud ja ultrahelivannis deioniseeritud veega pestud
kilede efektiivsus ei erinenud olulisel määral 500 °C-ni kuumutatud pesemata kilede
efektiivsusest (K. Jugansoni avaldamata andmed), mistõttu antud uurimistöös võeti kasutusele
400 °C-ni kuumutatud ja ultrahelivannis deioniseeritud veega pestud TiO2 nanokiled.
3.1.2. Optimaalsete tingimuste leidmine E. coli pSLlux kultuuri ettevalmistamiseks
TiO2 nanokilede antibakteriaalse toime määramise katse läbiviimiseks vajalikud seadmed
asusid Tartu Ülikooli Füüsika Instituudi laboratooriumis, ent bakterikultuuri ettevalmistamine
viidi läbi steriilsetes tingimustes Tallinnas Keemilise ja Bioloogilise Füüsika Instituudi
21
Keskkonnatoksikoloogia laboratooriumis. Selleks, et leida tingimused, mille juures E. coli
pSLlux kultuur on TiO2 nanokiledele eksponeerimise alguseks kasvufaasis, viidi läbi eelkatse,
kus värskesse LB vedelsöötmesse lisati erinevates kogustes tihedaks kasvatatud
bakterikultuuri. Baktereid kasvatati paralleelselt 30 °C juures loksutil ning toatemperatuuril
seisvas tuubis ja nende kasvukõverad leiti kultuuri optilise tiheduse (joonis 4A) ja
luminestsentsi (joonis 4B) mõõtmiste alusel.
Joonis 4. LB vedelsöötmesse erinevas koguses külvatud bakterikultuuri kasvamine ajas
(A) optilise tiheduse järgi (mõõdetud 600 nm juures); (B) emiteeritud valgushulga järgi.
Punktid tähistavad kolme mõõtmise keskmist tulemust, veapiirid standardhälvet. Sinisega on
tähistatud 10 ml LB söötmesse külvatud kultuurid, mis kasvasid toatemperatuuril seisvas
tuubis. Rohelisega on tähistatud 5 ml LB söötmesse külvatud kultuurid, mis kasvasid 30 °C
juures loksutil.
Allikas: Autori andmed.
Jooniselt 4 on näha, et kasvufaasis oleva E. coli pSLlux kultuuri kasvu hindamiseks sobivad
optilise tiheduse ja luminestsentsi mõõtmine võrdselt hästi. Teisalt kui bakterid on saavutanud
oma maksimaalse tiheduse ehk jõudnud statsionaarsesse faasi, siis optiline tihedus jääb
22
esialgu püsima (joonis 4A), aga emiteeritava valguse hulk hakkab ajas langema (joonis 4B).
Järelikult on antud uurimistöö seisukohast kasulikum enne E. coli TiO2 nanokiledele
eksponeerimist mõõta kultuuri poolt emiteeritava valguse hulka kahes ajapunktis – kui
hilisemal ajahetkel luminestseerub kultuur varasemast rohkem, siis on kultuur endiselt
kasvufaasis ja sobib katse läbiviimiseks.
Erinevate kasvutingimuste võrdlemisel nähtub, et loksutil 30 °C juures kasvanud bakterid
tarbivad söötmes olevad toitained ära ja jõuavad statsionaarsesse faasi umbes 10 tunniga, ent
toatemperatuuril kasvav kultuur ei saavuta samasugust tihedust ka 22 tunni möödudes.
Eelkatses söötmesse lisatud erinevad bakterikogused maksimaalse tiheduse saavutamise
kiirust oluliselt ei muutnud. Tulenevalt sellest, et katseid TiO2 nanokilede mõju uurimiseks
sooviti alustada päevasel ajal, otsustati E. coli pSLlux kultuuri ette kasvatada toatemperatuuril
seisvas tuubis.
3.1.3. Sobivate lahjenduste valimine E. coli pSLlux’i arvukuse määramiseks
Bakterite arvukuse hindamisel on oluline, et neid tardsöötmele külvates kasvaksid välja
eraldiseisvad kolooniad, mida on võimalik kokku lugeda. Eelkatsete tulemusena leiti, et
sobivaim on jagada LB tardsöötmega Petri tass 4 sektoriks, millelest igale saab külvata 15 µl
vastava bakterisuspensiooni 102-, 10
3-, 10
4- või 10
5-kordset lahjendust (joonis 5). Bakterite
ühtlase kasvu tagamiseks sektori piires hõõruti bakterisuspensioon steriilse spaatliga
söötmesse ning kasvatati üleöö 30 °C juures.
Joonis 5. LB tardsöötmele külvatud Escherichia coli pSLlux suspensiooni lahjendustest
väljakasvanud kultuurid (A) pildistatuna päevavalguses, (B) pildistatuna pimedas ruumis.
Allikas: Autori fotod.
23
3.1.4. Bakteritilga räni monokristallist alustelt ja TiO2 nanokiledelt mahapesemise
efektiivsuse kontrollimine
Bakterid kinnituvad erinevate pindadega kokkupuutel sageli nende külge ja moodustavad
biofilmi (Sarapuu 2002: 73). Samas võivad nad erinevast materjalist pindade külge kinnituda
erineva tugevusega, mis võib esile kutsuda vigu katsetulemuste tõlgendamisel. Sellest
tulenevalt otsustati uurida, kui efektiivselt õnnestub E. coli pSLlux bakteritilka katses
kasutatavatelt TiO2 nanokiledelt ja räni monokristallist alustelt maha pesta. Pesemisel
tekkivate kadude määramiseks lisati 10 µl bakterisuspensiooni vastavalt räni monokristallist
alustele ja TiO2 nanokiledele, mida seejärel pesti 0,9% NaCl lahusega. Paralleelselt lisati
sama kogus bakterisuspensiooni otse 0,9% NaCl lahusesse. Alustelt pestud ja otse NaCl
lahusesse lisatud bakterite arvukuse määramise tulemused on toodud joonisel 6.
Joonis 6. Bakterite arvukus (CFU/ml) esialgses bakterisuspensioonis (roheline), räni
monokristallilt mahapestud tilgas (tumesinine) ja TiO2 nanokilelt mahapestud tilgas (hall).
Tulbad tähistavad kolme lugemise keskmist tulemust, veapiirid standardhälvet.
Allikas: Autori andmed.
Joonisel 6 on näha, et bakterite arvukus esialgses suspensioonis ja katsetes kasutatavatelt
alustelt mahapestud bakteritilgas erineb vea piires. Seega võib järeldada, et uurimistöösse
valitud pesemise protseduur on edukas ning räni monokristallist aluste ega TiO2 nanokilede
külge jäävate bakterite hulk katsetulemusi märkimisväärselt ei mõjuta.
24
3.2. TiO2 nanokilede mõju uurimine Escherichia coli pSLlux’iga
3.2.1. TiO2 nanokilede ja kontrollaluste mõju E. coli pSLlux’ile pimedas
Antud uurimistöös püstitatud hüpoteesi üheks osaks oli, et TiO2 nanoosakestest valmistatud
kiled ei avalda bakteritele lühikese aja jooksul märgatavat mõju, kui neid ei eksponeerita UV
kiirgusele. Hüpoteesi kontrollimiseks eksponeeriti E. coli pSLlux’i TiO2 nanokiledele ja räni
monokristallist alustele pimedas 20 minuti jooksul.
20-minutilise ekspositsiooni lõppedes oli tardsöötmetele külvatud bakterisuspensiooni-
tilkades bakterite arvukus visuaalsel hinnangul pisut väiksem kui 0 minutit eksponeeritud
alustel (lisa 2.1.). Samas oli bakterite arvukus kõikide töötluste korral endiselt üsna kõrge
ning ei sõltunud märkimisväärselt kasutatud aluse materjalist.
Joonis 7. 20 min pimedas räni monokristallist alustel (tumesinine) ja TiO2 nanokiledel (hall)
eksponeeritud E. coli pSLlux bakterisuspensiooni kolooniat moodustavate ühikute arv
võrreldes 0 min alustel eksponeeritud bakterisuspensiooni kolooniat moodustavate ühikute
arvuga. Tulbad tähistavad vähemalt kolme lugemise keskmist tulemust, veapiirid
standardhälvet.
Allikas: Autori andmed.
Joonisel 7 on toodud bakterite arvukuse määramisel saadud tulemused (lugemise andmed on
lisas 2.2.). Bakterite arvukuse võrdlemisel võeti aluseks (100%) 0 min alustel eksponeeritud
25
bakterisuspensiooni CFU, millest lähtuvalt arvutati teistel alustel ellu jäänud bakterite arvukus
protsendina esialgsest CFU-st. Kontrolliga võrreldes vähenes bakterite arvukus 20 minuti järel
nii TiO2 nanokiledel (alles 39,7% CFU/ml) kui räni monokristallist alustel (alles 38,5%
CFU/ml). Samas jäi 20-minutilise pimedas läbiviidud ekspositsiooni järel TiO2 nanokiledelt
ja räni monokristallist alustelt pestud bakterisuspensioonitilkades bakterite arvukuse erinevus
vea piiresse ehk aluse materjalist bakterite arvukuse vähenemine ei sõltunud. Väiksem
bakterite arvukus 20-minutilise ekspositsiooni järel võib olla tingitud sellest, et 20 minutiga
hakkas 10 µl suurune bakterisuspensioonitilk kõrgest suhtelisest õhuniiskusest (90%)
hoolimata kuivama ning osad bakterid hukkusid kuivamise tõttu.
Tulenevalt sellest, et 20-minutilise pimedas läbiviidud ekspositsiooni järel bakterite arvukus
aluse materjalist ei sõltunud, leidis kinnitust uurimistöös püstitatud hüpoteesi osa, kus väideti,
et TiO2 nanoosakestest valmistatud kiled ei avalda bakteritele lühikese aja jooksul märgatavat
mõju kui neid ei eksponeerita UV kiirgusele.
3.2.2. TiO2 nanokilede ja kontrollaluste mõju E. coli pSLlux’ile UV-valguses
Käesolevas uurimistöös püstitatud hüpoteesi peamiseks osaks oli, et TiO2 nanoosakestest
valmistatud kilede ergastamisel UV-kiirgusega on nende antibakteriaalne toime tõhusam kui
ainult UV-kiirgusel. Hüpoteesi kontrollimiseks eksponeeriti E. coli pSLlux’i TiO2
nanokiledele ja räni monokristallist alustele 20 minuti jooksul UV-valguses. Antibakteriaalse
toime kiiruse hindamiseks määrati bakterite arvukus alusele kantud bakterisuspensiooni-
tilkades iga 5 minuti järel.
Visuaalse hinnangu alusel (lisa 3.1.) võib väita, et TiO2 nanokiled omavad UV-kiirgusega
ergastades märkimisväärset antibakteriaalset toimet – 10-minutilise ekspositsiooni järel
kasvab aluselt pestud bakterisuspensioonitilgast kontrolliga võrreldes välja tunduvalt vähem
bakterikolooniaid, 15-minutilise ekspositsiooni järel on alles jäänud vaid üksikud kolooniad
ning 20-minutilise ekspositsiooni järel on bakterid kaotanud võime moodustada tardsöötmele
kolooniaid. Räni monokristallil UV-kiirgusele eksponeeritud bakterite puhul on samuti näha
ajast sõltuvat antibakteriaalset toimet, ent oma ulatuselt on see tunduvalt väiksem kui TiO2
nanokiledel UV-kiirguses.
Joonisel 8 on toodud bakterite arvukuse määramisel saadud tulemused (lugemise andmed on
lisas 3.2.). Bakterite arvukuse võrdlemisel võeti aluseks punktis 3.2.1. toodud 0 min
26
vastavatel alustel eksponeeritud bakterisuspensiooni CFU. Joonisel väljendub selgelt UV-
kiirguse ning TiO2 nanokilede toime ajas. Nimelt avaldus TiO2 nanokilede antibakteriaalne
mõju juba pärast 5-minutilist eksponeerimist, kui räni monokristallilt pestud
bakterisuspensioonitilgaga võrreldes oli TiO2 nanokilelt pestud bakterisuspensioonitilgas
baktereid 49,5% vähem. Aja jooksul vähenes UV-kiirguse mõjul TiO2 nanokiledel olevas
bakterisuspensioonis koloonia moodustamise võimega bakterite hulk veelgi – 10 minuti
möödudes oli bakterite arvukus 1,6% esialgsest, 15 minuti möödudes 0,5% ja 20 minuti
möödudes ei moodustunud tardsöötmele külvatud bakterisuspensioonitilkadest enam ühtegi
kolooniat.
Joonis 8. Räni monokristallist alustel (sinine) ja TiO2 nanokiledel (hall) UV-kiirgusele
eksponeeritud E. coli pSLlux bakterisuspensiooni kolooniat moodustavate ühikute arv
võrreldes 0 min alustel eksponeeritud bakterisuspensiooni kolooniat moodustavate ühikute
arvuga. Tulbad tähistavad vähemalt kolme lugemise keskmist tulemust, veapiirid
standardhälvet.
Allikas: Autori andmed.
Räni monokristallist alustel, kus bakteritsiidselt mõjus ainult UV-kiirgus, kahanes bakterite
arvukus võrreldes TiO2 nanokiledega palju aeglasemalt (joonis 8) ning pärast 20-minutilist
eksponeerimist oli räni monokristallist alustelt pestud bakterisuspensioonitilkades alles 11,3%
bakteritest. Samas ei olnud selles katses nähtud mõju seletatav ainult tilga kuivamisega, sest
74.1%
52.3%
41.5%
11.3%
24.6%
1.6%
0.5%
0.0%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0 min 5 min 10 min 15 min 20 min
Ekspositsiooniaeg
E. c
oli
pSL
lux
arvu
kus
võrr
eld
es
kon
tro
llig
a (e
ksp
on
ee
ritu
d 0
min
),
% C
FU/m
l
Eksponeeritud Si alustele
Eksponeeritud TiO₂ nanokiledele
27
võrreldes pimedas räni monokristallil läbi viidud ekspositsiooniga (joonis 7) oli 20 minuti
möödudes bakterite arvukus üle 3 korra madalam.
UV-kiirguses läbiviidud ekspositsiooni käigus täheldati antibakteriaalset mõju nii räni
monokristallist alustel kui TiO2 nanokiledel, kusjuures viimastel oli efekt tunduvalt suurem.
Arvestades seda, et soodsates tingimustes kahekordistub E. coli pSLlux’i arvukus 1 tunniga
(joonis 4) ning optimaalsetes tingimustes võib pooldumiseks vajaminev aeg olla veelgi lühem,
võib 15 minutit TiO2 nanokiledel UV-kiirgusele eksponeeritud bakterikultuuri arvukus heasse
kasvukeskkonda sattudes jõuda vähem kui 8 tunniga 0,5%-lt tagasi esialgse arvukuseni ehk
100%-ni. Seega omab antibakteriaalsete pindade väljatöötamise seisukohast olulist rolli vaid
tulemus, kus tardsöötmele ei moodustu enam ühtegi bakterikultuuri. Selline tulemus saadi
käesolevas uurimistöös bakterikultuuri 20 minutit TiO2 nanokiledel UV-kiirgusele
eksponeerides, kusjuures kinnitust leidis püstitatud hüpotees, mille kohaselt TiO2
nanoosakestest valmistatud kilede ergastamisel UV-kiirgusega on nende antibakteriaalne
toime tõhusam kui ainult UV-kiirgusel.
Tulenevalt sellest, et TiO2 nanokilede mõju avaldus ainult neid UV-kiirgusega ergastades,
võib eeldada, et UV-kiirguse energia aktiveeris TiO2 nanoosakesed, mille tulemusena need
omandasid võime läbi viia fotokatalüütilisi protsesse. Varasemalt on kirjanduses pakutud, et
fotokatalüütilise oksüdatsiooni käigus tekkivad hüdroksüülradikalid reageerivad bakterite
rakumembraanidega ning kahjustavad neid (Foster et al. 2011). Kuna antud uurimistöös oli
E. coli pSLlux’i välismembraan TiO2 nanokile pinnaga vahetus kokkupuutes, siis kehtis
taoline mehhanism suure tõenäosusega ka selle töö raames läbiviidud katsetes.
Paralleelselt käesolevas uurimistöös tehtud katsetega viis Meeri Visnapuu Tartu Ülikooli
Füüsika Instituudis samadel alustel samade tingimuste juures läbi ekspositsiooni E. coli
pSLlux’iga, mida ta peale eksponeerimist visualiseeris skaneeriva elektronmikroskoobiga
(lisa 4.). Saadud SEM-i piltidel on näha, et bakterite kuju ja välimus ei muutu ajas oluliselt,
kui neid eksponeerida pimedas TiO2 nanokiledele või räni monokristallist alustele pimedas
või UV-kiirguses. Teisalt on 20 minutit TiO2 nanokiledel UV-kiirgusele eksponeeritud
bakterite morfoloogia märgatavalt erinev ning tundub, et bakterirakk on laiali valgunud, mis
viitab suurtele membraanikahjustustele. Täiendavalt vaadeldi bioloogiliste membraanide
koosseisus kõrgelt esindatud küllastunud ja küllastumata rasvhapete lagunemist UV-kiirguse
toimel samade TiO2 nanokilede pinnal röntgenfotoelektronspektroskoopia (XPS) tehnikaga.
Selle meetodiga nähti, et rasvhapped oksüdeeruvad ning lagunevad juba 10-minutilise
28
ekspositsiooni tagajärjel, mis kinnitab veelgi seda, et TiO2 nanokiled omavad antibakteriaalset
toimet, kuna nad kahjustavad rakumembraane. Siiski ei saa rasvhapete lagunemise tulemusi
otse üle kanda bakterirakkudele, kuna viimastel on olemas erinevad kaitsemehhanismid
raskete keskkonnatingimustega toimetulekuks. (Visnapuu 2014)
Käesoleva töö tulemusena võib järeldada, et uuritud TiO2 nanoosakestest valmistatud
õhukesed kiled omavad UVA-kiirgusega aktiveerides kiiresti avalduvat tugevat
antibakteriaalset mõju. Nende kilede antibakteriaalse toime mehhanism seisneb bakteriraku
membraani kahjustamises, mille tulemusena bakterirakk hävib. Kuna UV-kiirguse
puudumisel uuritud TiO2 nanokiled rakkudele kahjulikku mõju ei omanud, siis on taolistel
kiledel kõrge potentsiaal isepuhastuvate katetena näiteks meditsiinis või toiduainetetööstuses.
29
Kokkuvõte
Titaandioksiidi nanoosakesed leiavad kasutust väga erinevates rakendustes, mis sageli
põhinevad TiO2 omadusel neelata lühilainelist valgust, mille käigus oksüdeeritakse orgaanilisi
molekule. Üheks hetkel arenemisjärgus olevaks TiO2 nanoosakeste rakendusalaks on
isepuhastuvad katted, mis leiaksid kasutust nii meditsiinis, toiduainetetööstuses kui ka
igapäevaelus aknaklaasidel.
Käesoleva töö eesmärkideks oli uurida, kas anataasi kristallstruktuuriga TiO2 nanoosakestest
valmistatud õhukesed kiled omavad antibakteriaalset toimet, milline on UVA-kiirguse toime
bakteritele, ning kas TiO2 nanoosakestest valmistatud õhukesi kilesid on võimalik UVA-
kiirgusega aktiveerida, saamaks tõhusamat antibakteriaalset toimet. Uurimistöös püstitatud
hüpotees leidis kinnitust: ergastades TiO2 nanoosakestest valmistatud kilesid UVA-
kiirgusega, on nende antibakteriaalne toime tõhusam, kui ainult UVA-kiirgusel või TiO2
nanokiledel pimedas.
Hüpoteesi tõestamiseks eksponeeriti Escherichia coli pSLlux bakterikultuuri TiO2
nanokiledel UVA-kiirgusele. Kontrollidena kasutati UVA-kiirgusele eksponeeritud E. coli
pSLlux bakterikultuuri räni monokristallist alustel ning bakterikultuuri TiO2 nanokiledel ja
räni monokristallist alustel pimedas. Ekspositsiooni lõppedes külvati bakterid LB
tardsöötmele ning analüüsiti nende arvukust.
Saadud katsetulemused näitasid selgelt, et UVA-kiirgus annab uuritud TiO2 nanokiledele
bakteritsiidse toime, sest juba viie minutiga vähenes bakterite arvukus TiO2 nanokiledel
märgatavalt rohkem kui räni monokristallist alustel. 20-minutilise ekspositsiooni järel TiO2
nanokilel enam elujõulisi baktereid ei leidunud, samas räni monokristallist alustel oli alles
umbes kümnendik bakteritest. Ilma UV-kiirgusega ergastamata TiO2 nanokiledel märgatav
antibakteriaalne toime puudus, seega oli UV-kiirgus vajalik TiO2 nanoosakeste
fotokatalüütiliseks aktiveerimiseks. Võrreldes saadud tulemusi teiste samalaadsete uuringute
tulemustega pakuti välja, et TiO2 nanokilede antibakteriaalse toime mehhanism seisneb
bakteriraku membraani kahjustamises.
30
Uurimistöö käigus kogutud andmete põhjal saab järeldada, et töös kasutatud TiO2 nanokiled
omavad kõrget potentsiaali isepuhastuvate katetena näiteks meditsiinis või
toiduainetetööstuses.
Antud töö edasiarendusena tuleks uurida samade kilede toimet teistele bakteriliikidele
veendumaks, et antibakteriaalne toime on universaalne. Lisaks tuleks meditsiinirakenduste
puhul viia läbi katsed imetajate rakukultuuridega, et välistada TiO2 nanokiledest tulenevad
ohud tavatingimustes. Selgitamaks välja uuritud TiO2 nanokilede täpset antibakteriaalset
mehhanismi, tuleks jätkata fotokatalüütilise mehhanismi-alaseid uuringuid. Kuigi töös
kasutatud TiO2 nanokiled olid kirjanduses varem uuritud kiledega võrreldes väga efektiivsed,
võib alternatiivse suunana keskenduda veelgi efektiivsemate antibakteriaalsete pindade
väljatöötamisele.
31
Kasutatud materjalid
Alberts, B., Johnson, A.; Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. (2002) Molecular
biology of the cell, fourth edition. New York: Garland Science.
Aminedi, R., Wadhwa, G., Das, N., Pal, B. (2013) Shape-dependent bactericidal activity of
TiO2 for the killing of Gram-negative bacteria Agrobacterium tumefaciens under
UV torch irradiation. Environmental Science and Pollution Research, nr 20(9),
lk 6521-6530.
Armelao, L., Barreca, D., Bottaro, G., Gasparotto, A., Maccato, C., Maragno, C.,
Tondello, E., Štangar, U. L., Bergant, M., Mahne, D. (2007) Photocatalytic and
antibacterial activity of TiO2 and Au/TiO2 nanosystems. Nanotechnology, nr 18(37),
artikkel 375709.
Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. (2013) A review of the biomaterials
technologies for infection-resistant surfaces. Biomaterials, nr 34(34), lk 8533-8554.
Cushnie, T. P. T., Robertson, P. K. J., Officer, S., Pollard, P. M., Prabhu, R., McCullagh, C.,
Robertson, J. M. C. (2010) Photobactericidal effects of TiO2 thin films at low
temperatures – A preliminary study. Journal of Photochemistry and Photobiology A:
Chemistry, nr 216 (2-3), lk 290-294.
Foster, H. A., Ditta, I. B., Varghese, S., Steele, A. (2011) Photocatalytic disinfection using
titanium dioxide: spectrum and mechanism of antimicrobial activity. Applied
Microbiology and Biotechnology, nr 90(6), lk 1847-1868.
Gupta, S. M., Tripathi, M., (2011) A review of TiO2 nanoparticles. Chinese Sci Bull, nr 56,
lk 1639−1657.
Hain, E., Happonen, P., Holopainen, M., Sotkas, P., Tenhunen, A., Tihtarinen-Ulmanen, M.,
Venäläinen, J. (2012) Bioloogia gümnaasiumile 1. Tallinn: Avita.
32
Ivask, A., Kahru, A., Virta, M. (2007) Recombinant whole-cell bioreporter systems based on
beetle luciferases. Handbook of Biosensors and Biochips. West Sussex, England: John
Wiley & Sons Ltd, lk 163-172.
Ivask, A., Rõlova, T., Kahru, A. (2009) A suite of recombinant luminescent bacterial strains
for the quantification of bioavailable heavy metals and toxicity testing. BMC
Biotechnology, nr 9(41), lk 1-15.
Joost, U., Saarva, A., Visnapuu, M., Nõmmiste, E., Utt, K., Saar, R., Kisand, V. (2014)
Purification of titania nanoparticle thin films: Triviality or a challenge? Ceramics
International, nr 40(5), lk 7125-7132.
Kahru, A., Lippmaa, E. (2010) Nanode ilu ja valu. Horisont, nr 3, lk 8-14.
Kivisaar, M. (2000) Bakteriraku ehitus ja metabolismi regulatsiooni üldpõhimõtted. Loetud:
http://www.ebc.ee/loengud/maia_gen/bf1.htm, 12.02.2014.
Kändler, T. (2009) Metallilised nanoosakesed ei ole elusolenditele ohutud. Loetud:
http://epl.delfi.ee/news/melu/metallilised-nanoosakesed-ei-ole-elusolenditele-
ohutud.d?id=51182308, 8.12.2013.
Kühn, K. P., Chaberny, I. F., Massholder, K., Stickler, M., Benz, V. W., Sonntag, H.-G.,
Erdinger, L. (2003) Disinfection of surfaces by photocatalytic oxidation with titanium
dioxide and UVA light. Chemosphere, nr 53(1), lk 71-77.
Macwan, D. P., Dave, P. N., Chaturvedi, S. (2011) A review on nano-TiO2 sol–gel type
syntheses and its applications. Journal of Materials Science, nr 46(11), lk 3669-3686.
Microbiology; Microbiology of food and animal feeding stuffs, 2008. General requirements
and guidance for microbiological examinations : EVS-EN ISO 7218:2008. Tallinn :
Standardiamet
Moan, J. (2004) Visible Light and UV Radiation. Loetud: http://www.uio.no/studier/emner/
matnat/fys/FYS3610/h04/undervisningsmateriale/Moan7.pdf, 20.02.2014
Nanotehnoloogia tumedam külg. Eesti Looduse kodulehekülg. Loetud:
http://www.eestiloodus.ee/uudised300.html, 08.12.2013.
33
Piccino, F., Gottschalk, F., Seeger, S., Nowack, B. (2012) Industrial production quantities and
uses of ten engineered nanomaterials in Europe and the world. Journal of Nanoparticle
Research, nr 14(9), artikkel 1109.
Prescott, L. M., Harley, J. P., Klein, D. A. (1999) Microbiology, fourth edition. The United
States of America: McGraw-Hill Companies.
Saarva, A. (2013) Titaandioksiidi nanoosakeste puhastamine : bakalaureusetöö. Tartu Ülikool,
Tartu.
Sarapuu, T. (2002) Bioloogia gümnaasiumile 1 osa. Tartu: Eesti Loodusfoto.
Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. (2007) Escherichia coli physiology in Luria-
Bertani broth. Journal of Bacteriology, vol 189, nr 23, lk 8746-8749.
Sunada, K., Watanabe, T., Hashimoto, K. (2003) Studies on photokilling of bacteria on TiO2
thin film. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry, nr 156(1),
lk 227-233.
The Nanodatabase. Loetud: http://nanodb.dk/material/titandioxid, 18.02.2014.
Visnapuu, M. Nano-TiO2 kilede antibakteriaalsus. Bioloogiliste proovide TEM. Ettekanne
KBFI Keskkonnatoksikoloogia laboratooriumi seminaril. Tallinn: 05.02.2014.
Wang, R.-M., Wang, B.-Y., He, Y.-F., Lv, W.-H., Wang, J.-F. (2009) Preparation of
composited Nano-TiO2 and its application on antimicrobial and self-cleaning coatings.
Polymers for Advanced Technologies, nr 21(5), lk 331-336.
Weir, A., Westerhoff, P., Fabricius, L., Hristovski, K., von Goetz, N. (2012) Titanium dioxide
nanoparticles in food and personal care products. Environmental Science & Technology,
nr 46(4), lk 2242-2250.
Yeung, K. L., Leung, W. K., Yao, N., Cao, S. (2009) Reactivity and antimicrobial properties
of nanostructured titanium dioxide. Catalysis Today, nr 143(3-4), lk 218-224.
34
Tänuavaldused
Käesolev töö teostati Keemilise ja Bioloogilise Füüsika Instituudi Keskkonnatoksikoloogia
Laboratooriumi In vitro ja ökotoksikoloogia grupis.
Kõige rohkem tahan tänada oma juhendajat KBFI ja TTÜ doktoranti Katre Juganson’i, kes
aitas leida vajalikke teoreetilisi materjale, ette valmistada katseid ning vastas lahkelt kõikidele
küsimustele.
Soovin tänada ka KBFI Keskkonnatoksikoloogia Laboratooriumi juhatajat Anne Kahru’t ning
Tartu Ülikooli Füüsika Instituudi vanemteadurit Vambola Kisand’it, kes lubasid mul enda
laborites töötada.
Väga suur tänu KBFI vanemteadurile Angela Ivask’ile, kelle geneetiliselt muundatud
bakterikultuuri katsetes kasutati ning kes aitas lahendada kõikvõimalikke probleeme.
Tänan Tartu Ülikooli Füüsika Instituudi doktoranti Urmas Joost’i, kes sünteesis vajalikud
nanokiled, valmistas UV-lambi, aitas katsevahendeid kasutada ning vastas rõõmuga kõikidele
küsimustele.
Tänan KBFI teadurit Monika Mortimer’i, kes jagas enda teadmisi ning aitas probleemidele
lahendusi leida.
Tänusõnad kuuluvad ka Tartu Ülikooli doktorandile Meeri Visnapuu’le, kes aitas kaasa
katsete läbiviimisel ning tegi bakteritest pildid skaneeriva elektronmikroskoobiga.
Käesolevat tööd finantseerisid Eesti Teadusagentuur (grandid IUT23-5, IUT2-25,
SF0690063s08), Eesti Teadusfond (grant 8561), Eesti Nanotehnoloogiate Arenduskeskus
(EU29996), ERDF projektid (‘‘IRGLASS’’ 3.2.1101.12 0027, ‘‘TRIBOFILM’’ 3.2.1101.12-
0028, “Nano-Com” 3.2.1101.12-0010, „High-technology Materials for Sustainable
Development” TK117, “Mesosystems: Theory and Applications” TK114) ja doktorikool
“Funktsionaalsed materjalid ja tehnoloogiad” (ETF projekt 1.2.0401.09-0079).
35
Lisa 1 Skaneeriva elektronmikroskoobi pilt TiO2 nanokilest
Allikas: Joost et al. 2014
36
Lisa 2 Bakterite eksponeerimine alustele pimedas
Lisa 2.1. Pimedas TiO2 nanokiledele ja räni monokristallist alustele eksponeeritud E.
coli pSLlux’i kolooniad tardsöötmel.
Fotodel kujutatud kolooniad kasvatati tardsöötmel üleöö 30 °C juures alustelt pestud E. coli
pSLlux’i tilga lahjendustest. Fotod valiti kolme paralleeli hulgast nii, et need iseloomustaks
enim keskmist tulemust. Fotod on tehtud pimedas.
Autori fotod
Lisa 2.2. Pimedas TiO2 nanokiledele ja räni monokristallist alustele eksponeeritud
E. coli pSLlux’i arvukuse hindamine
0 min, räni monokristallist alusel 0 min, TiO2 nanokilel
Kolooniate arv
CFU/ml %
Kolooniate arv
CFU/ml % 102x
lahj.
103x
lahj.
104x
lahj.
105x
lahj.
102x
lahj.
103x
lahj.
104x
lahj.
105x
lahj.
1. katse N/A 198 23 N/A 1.34*10
7 101.6 N/A 72 9 N/A 4.91*10
6 81.0
N/A 198 16 N/A 1.30*107 98.4 N/A 103 16 N/A 7.21*10
6 119.0
2. katse
N/A N/A 151 17 1.02*108 90.3 N/A N/A 78 15 5.64*10
7 71.0
N/A N/A 171 20 1.16*108 102.7 N/A N/A 100 8 6.55*10
7 82.4
N/A N/A 179 20 1.21*108 107.0 N/A N/A 186 6 1.16*10
8 146.6
Keskmine 100.0 100.0
Standardhälve 6.2 31.8
*N/A – antud lahjenduse juures kolooniate arvu ei loetud
37
20 min, räni monokristallist alusel 20 min, TiO2 nanokilel
Kolooniate arv
CFU/ml %
Kolooniate arv
CFU/ml % 102x
lahj.
103x
lahj.
104x
lahj.
105x
lahj.
102x
lahj.
103x
lahj.
104x
lahj.
105x
lahj.
2. katse
N/A N/A 69 4 4.42*107 39.2 N/A N/A 30 7 2.24*10
7 28.2
N/A N/A 76 18 5.70*107 50.5 N/A N/A 73 4 4.67*10
7 58.8
N/A N/A 40 8 2.91*107 25.8 N/A N/A 33 9 2.55*10
7 32.1
Keskmine 38.5 39.7
Standardhälve 12.4 16.6
*N/A – antud lahjenduse juures kolooniate arvu ei loetud
38
Lisa 3 Bakterite eksponeerimine alustele UV-valguses
Lisa 3.1. TiO2 nanokiledel ja räni monokristallist alustel UV-kiirgusele eksponeeritud
E. coli pSLlux’i kolooniad tardsöötmel.
Fotodel kujutatud kolooniad kasvatati tardsöötmel üleöö 30 °C juures alustelt pestud E. coli
pSLlux’i tilga lahjendustest. Fotod valiti kolme paralleeli hulgast nii, et need iseloomustaks
enim keskmist tulemust. Fotod on tehtud pimedas.
Autori fotod
Lisa 3.2. TiO2 nanokiledel ja räni monokristallist alustel UV-kiirgusele eksponeeritud
E. coli pSLlux’i arvukuse hindamine
5 min, räni monokristallist alusel 5 min, TiO2 nanokilel
Kolooniate arv
CFU/ml %
Kolooniate arv
CFU/ml % 102x
lahj.
103x
lahj.
104x
lahj.
105x
lahj.
102x
lahj.
103x
lahj.
104x
lahj.
105x
lahj.
1. katse N/A 115 17 N/A 8.00*10
6 60.7 140 15 2 N/A 9.39*10
5 15.5
N/A 165 19 6 1.12*107 84.6 170 17 1 N/A 1.13*10
6 18.7
2. katse
N/A N/A 143 17 9.70*107 86.0 N/A N/A 44 3 2.85*10
7 35.9
N/A N/A 104 13 7.09*107 62.9 N/A N/A 47 4 3.09*10
7 38.9
N/A N/A 135 7 8.61*107 76.3 N/A 157 27 0 1.12*10
7 14.0
Keskmine 74.1 24.6
Standardhälve 11.9 11.8
*N/A – antud lahjenduse juures kolooniate arvu ei loetud
39
10 min, räni monokristallist alusel 10 min, TiO2 nanokilel
Kolooniate arv
CFU/ml %
Kolooniate arv
CFU/ml % 102x
lahj.
103x
lahj.
104x
lahj.
105x
lahj.
102x
lahj.
103x
lahj.
104x
lahj.
105x
lahj.
1. katse N/A 69 12 2 4.91*10
6 37.2 52 5 N/A 1 3.45*10
5 5.70
N/A 106 11 1 7.09*106 53.8 15 N/A 1 N/A 9.09*10
4 1.50
2. katse
N/A N/A 94 9 6.24*107 55.4 91 15 2 N/A 6.42*10
5 0.81
N/A N/A 84 10 5.70*107 50.5 4 0 0 N/A 2.42*10
4 0.03
N/A N/A 107 13 7.27*107 64.5 7 1 N/A N/A 4.85*10
4 0.06
Keskmine 52.3 1.62
Standardhälve 9.9 2.36
*N/A – antud lahjenduse juures kolooniate arvu ei loetud
15 min, räni monokristallist alusel 15 min, TiO2 nanokilel
Kolooniate arv
CFU/ml %
Kolooniate arv
CFU/ml % 102x
lahj.
103x
lahj.
104x
lahj.
105x
lahj.
102x
lahj.
103x
lahj.
104x
lahj.
105x
lahj.
1. katse N/A 37 4 N/A 2.48*10
6 18.9 0 0 0 N/A 0.00 0.00
N/A 119 15 N/A 8.12*106 61.6 6 2 1 N/A 4.85*10
4 0.80
2. katse
N/A N/A 68 10 4.73*107 41.9 0 0 N/A N/A 0.00 0.00
N/A N/A 67 13 4.85*107 43.0 170 20 N/A N/A 1.15*10
6 1.45
N/A N/A 72 6 4.73*107 41.9 4 0 N/A N/A 2.42*10
4 0.03
Keskmine 41.5 0.46
Standardhälve 15.2 0.65
*N/A – antud lahjenduse juures kolooniate arvu ei loetud
20 min, räni monokristallist alusel 20 min, TiO2 nanokilel
Kolooniate arv
CFU/ml %
Kolooniate arv
CFU/ml % 102x
lahj.
103x
lahj.
104x
lahj.
105x
lahj.
102x
lahj.
103x
lahj.
104x
lahj.
105x
lahj.
2. katse
N/A 93 4 N/A 5.88*106 5.2 0 0 N/A N/A 0.0 0.00
N/A 148 25 5 1.05*107 9.3 0 0 N/A N/A 0.0 0.00
N/A N/A 33 3 2.18*107 19.4 0 0 N/A N/A 0.0 0.00
Keskmine 11.3 0.00
Standardhälve 7.3 0.00
*N/A – antud lahjenduse juures kolooniate arvu ei loetud
40
Lisa 4 Skaneeriva elektronmikroskoobi pilt räni
monokristallist alusel ja TiO2 nanokilel UV-kiirgusele ja
pimedas eksponeeritud E. coli pSLlux rakkudest
Allikas: Visnapuu 2014
41
Resümee
Viimastel aastakümnetel on nanotehnoloogiad väga kiiresti arenenud. Võrreldes tavasuuruses
materjalidega on uudsetel nanomaterjalidel suurusest sõltuvad füüsikalised ja keemilised
omadused (nt suurem eripind, kvantefektid). Titaandioksiidi nanoosakesed on kasutust
leidnud väga erinevates rakendustes alates värvidest isepuhastuvate pindade ning
päikesepatareideni. Mitmetes sellistes rakendustes kasutatakse nano-TiO2 omadust neelata
lühilainelist kiirgust, mille käigus tekkivad hüdroksüülradikaalid võivad oksüdeerida
orgaanilisi ühendeid.
Käesoleva töö eesmärgiks oli uurida TiO2 nanokilede toimet UV-valguses.
TiO2 nanokilede toime uurimiseks kasutati rekombinantset bioluminestseeruvat bakterit
Escherichia coli MC1061 (pSLlux), mille suspensiooni tilk asetati nanokilele, mida seejärel
eksponeeriti UV-kiirgusele 20 minutit. Kontrollidena eksponeeriti baktereid TiO2
nanokiledele pimedas ja keemiliselt inertsetele räni monokristallist alustele pimedas ja UV-
valguses. Pärast eksponeerimist pesti bakterid alustelt maha ning külvati agarsöötmetele.
Bakterite arvukust hinnati kolooniate kokku lugemisega.
Katsetulemused näitasid, et UV-kiirgusel on 20 minutilise ekspositsiooni järel üsna nõrk
antibakteriaalne mõju, ent kui kombineerida seda TiO2 nanokiledega, kaotavad bakterid sama
ajaga võime tardsöötmele kolooniaid moodustada. Pimedas läbiviidud kontrollkatse
antibakteriaalset mõju praktiliselt ei omanud. Tõenäoliselt põhjustas TiO2 nanokilede
antibakteriaalset mõju nende võime bakteriraku membraanikomponente fotokatalüütiliselt
lagundada. Uurimistöö põhjal saab väita, et töös kasutatud TiO2 nanokilede fotokatalüütilisel
aktiveerimisel omandavad need tugeva bakteritsiidse toime. Töö käigus kogutud andmete
põhjal saab järeldada, et töös kasutatud TiO2 nanokiled omavad kõrget potentsiaali
isepuhastuvate katetena.
42
Abstract
Antibacterial effects of photocatalytic nanoparticulate TiO2 thin films
Over the past few decades nanotechnology has developed rapidly. Compared with bulk
materials, novel nanomaterials size-dependant physico-chemical properties (e.g., higher
specific surface area, quantum effects). Currently, titanium dioxide nanoparticles (nano-TiO2)
have found use in wide range of applications from pigments to self-cleaning surfaces, solar
cells and sunscreens. Many of these applications exploit the ability of nano-TiO2 to absorb
short-wavelength light resulting in generation of reactive hydroxyl radicals that can oxidize
organic compounds.
The aim of the current work was to observe the antibacterial effects of nano-TiO2 thin films
under UV light.
The photocatalytic activity of nano-TiO2 films against recombinant constitutively
bioluminescent bacterium Escherichia coli MC1061 (pSLlux) was studied by adding a small
drop of bacterial suspension onto the film and exposing the samples to UV light for 20
minutes. Silicon wafers under UV light and respective treatments in dark were used as
controls. After incubation on the surfaces the colony forming ability of the bacteria was
estimated by plate count method.
The results of this study showed that UV light alone had only mild antibacterial effect in 20
minutes but in combination with nano-TiO2 thin films the bacteria completely lost their ability
to form colonies. For control, incubation of bacteria in the dark had only slight effect on
bacterial colony forming potential. The antibacterial effect of nano-TiO2 thin films was likely
caused by decomposition of membrane components. Hence, it can be concluded that
photocatalytic activation of nano-TiO2 thin films results in a significant antibacterial effect;
thus, the tested nano-TiO2 thin films have a strong potential as coatings for self-cleaning
surfaces.