7/29/2019 Teza de Doctorat - Varroa
1/25
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp.prezent n stupinele din zona Transilvaniei
229
UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICINVETERINAR CLUJ-NAPOCA
COALA DOCTORALFACULTATEA DE ZOOTEHNIE I BIOTEHNOLOGII
Ing. chimist ANTONIA CRISTINA MARIA M. ODAGIU
TEZ DE DOCTORAT
CERCETRI PRIVIND DEZVOLTAREA I VALIDAREAUNEI METODE DE GENOTIPIZARE A PARAZITULUIVARROA SP. PREZENT N STUPINELE DIN ZONA
TRANSILVANIEI(REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT)
CONDUCTORTIINIFIC
Prof. univ. dr. AUGUSTIN VLAIC
CLUJ NAPOCA
2010
7/29/2019 Teza de Doctorat - Varroa
2/25
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp.prezent n stupinele din zona Transilvaniei
230
Teza de doctorat intitulat CERCETRI PRIVIND DEZVOLTAREA I
VALIDAREA UNEI METODE DE GENOTIPIZARE A PARAZITULUI VARROA
SP. PREZENT N STUPINELE DIN ZONA TRANSILVANIEI i propune
dezvoltarea unei metode de identificare a genotipului cruia i aparine parazitul Varroa sp.
prezent n stupinele din Transilvania, precum i caracterizarea parametrilor de performan a
metodei n condiiile Laboratorului Zonal de Genotipizare a Animalelor al Universitii de
tiine Agricole i Medicin Veterinar Cluj Napoca, n vederea validrii procedurii.
INTODUCERE
Datorit importanei mierii ct i a produselor apicole secundare (polen, lptior de
matc, propolis, cear) tributar factorilor nutritivi pe care i conin precum i aciunii
terapeutice a acestora, prevenirea i combaterea bolilor albinelor constituie una dintre
preocuprile majore ale apicultorilor pe plan mondial (Bura M., 1996; Dezmirean D. i
colab., 2008; Mrghita L. Al., 2002).
Un alt factor ce contribuie la importana pstrrii strii de sntate a albinelor, l
constituie calitatea lor de vector n procesul de polenizare al plantelor, dar i de
perspectivele deschise de progresul biotehnologiilor care le transform n virtuali ageni de
vehiculare al transgenelor provenite de la plantele modificate genetic (Dezmirean D. icolab., 2007; Rakosy-Tican Elena, 2005).
n acest context, o tot mai mare importan se acord factorilor genetici care sunt
implicai n rezistena natural a unor specii sau populaii de albine la ageni patogeni
specifici, sau parazii, dari a paraziilor la aciunea produselor destinate combaterii lor.
7/29/2019 Teza de Doctorat - Varroa
3/25
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp.prezent n stupinele din zona Transilvaniei
231
CAPITOLUL I
ASPECTE PRIVITOARE LA COMPORTAMENTUL IGIENIC
ALAPIS MELLIFERA L.
Bolile albinelor pot fi de natur necontagioas sau contagioas. Cele de natur
necontagioas au cauze fiziologice, pe cnd cele contagioase sunt provocate de ageni
bacterieni, virali, micotici, sau parazii (Mrghita L. Al., 2002).
Datorit efectelor sale extrem de nocive i rspndirii largi Varroa destructor
(jacobsoni) constituie o problem major pentru apicultorii din ntreaga lume. Varroa sp.este un parazit ce face parte din regnul Animalia, ncrengtura Arthropoda, Clasa
Arachnida, Ordinul Acari, Familia Parasitidae, Genul Varroa, Specia destructor(Drees
B.M. i colab., 1999).
Combaterea eficient a parazitului constituie una dintre cele mai mari provocri ale
apicultorilor din ntreaga lume (Tew J. E., 2000; Moosbeckhofer R. i colab., 2003; Donz
G., 1998; Al-Abbadi A. i colab., 2003). Una dintre cele mai mari probleme ale apicultorilor
de azi const n rezistena parazitului la tratamentul cu Apistan (pesticid piretroid avnd
component activ tau fluvalinatul), una dintre substanele cu cea mai mare utilizare n
combaterea Varroa destructor, dari la cele cu Amitraz i Cumafos (Pettis J. S., 2003).
Rezistena parazitului Varroa sp. la principalii produi de combatere, bazai pe
piretroizi s-ar putea explica prin mecanisme identificate la momentul de fa. Aceasta, ns,
n contextul mai larg al dezvoltrii rezistenei la pesticide att a plantelor ct i al altor
organisme (echinoderme, insecte, arahnide etc.), care se pare c sunt guvernate de procesesimilare (Doyle K. i colab., 1991; Sibbesen O. i colab., 1995; Besten P.J., 1998; Valles
S.M. i colab., 2003; Tan J. i colab., 2005; Eleftherianos I. i colab., 2008, .a.).
Unul dintre ele este reprezentat de prezena anumitor esteraze (monooxigenazele),
care stau la baza unui mecanism metabolic de rezisten specific, mediat de acestea -
detoxifierea. n prezena monooxigenazelor piretroizii sintetici sunt oxidai, ceea ce conduce
la anihilarea activitii lor toxice asupra paraziilor (Sammataro Diana i colab., 2005).
Aceste monooxigenaze fac parte dintr-un grup mai extins (Lewis D. F.V., 2001) localizat n
reticulul endoplansmatic i este desemnat ca Citocrom P 450 (CYP sau P450). Acestea
http://www.jbc.org/search?author1=Ole+Sibbesen&sortspec=date&submit=Submithttp://www.jbc.org/search?author1=Ole+Sibbesen&sortspec=date&submit=Submit7/29/2019 Teza de Doctorat - Varroa
4/25
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp.prezent n stupinele din zona Transilvaniei
232
aparin superfamiliei de proteine care conin cofactorul Hem (hemoproteine). Denumirea
atribuit acestui grup enzimatic se datoreaz localizrii celulare a acestora (cito), dar i
caracteristicilor spectrofotometrice (crom) cnd fierul din Hem este redus, P450 absoarbe
radiaiile luminoase cu lungimea de und carcteristic de 450 nm.
Reacia de baz prin care Citocromul P450 i manifest rolul catalitic, este tipic
monooxigenazelor (oxidare prin introducerea unui atom de oxigen ntr-un substrat organic
RH i reducere prin formarea apei cu participarea celuilalt atom de oxigen):
RH + O2 + 2H+ + 2e ROH + H2O
La echinoderme a fost evideniat dependena de P450 a metabolismului compuilorpiretroidici (Besten P. J. i colab., 1990; Besten P. J., 1998).
n cazul insectelor, a fost confirmat prezena oxidazelor din complexul enzimatic
microzomal P450, care utilizeaz sistemul NADPH/NADH pentru a cliva reductor
oxigenul atmosferic, conducnd la o funciune organici o molecul de ap (Schuler Mary
A., 1996; Dong K., 2007; Soderlund D. M., 2008). Descrierea acestor mecanisme a facilitat
explicarea fenomenului de rezisten a parazitului Varroa sp. la piretroizi. Pe baza lor
tulpinile rezistente la produii de combatere i-au dezvoltat capacitatea de a detoxifica
insecticidele prin oxidare.
Cellalt mecanism al rezistenei poate fi explicat prin mutaiile punctiforme produse
la nivelul genei, care controleaz canalele sodiului. Canalele sodiului caracterizate de un
potenial electric sunt constituite integral din proteine transmembranare i sunt responsabile
de faza de cretere rapid a potenialului de aciune al celulei care face parte din categoria
celor cu excitabilitate ridicat. Insecticidele piretroide au efect de reducere a cineticii
activrii i dezactivrii canalului sodiului. Consecina direct este deschiderea prelungit a
canalelor individuale, ceea ce conduce la paralizia i n final moartea insectelor ce vin n
contact cu aceti compui (Wang R. i colab., 2002; Wang R. i colab., 2003; Wang, R. i
colab., 2003). Multe dintre insectele ce prezint rezisten la piretroizi au suferit mutaii
punctiforme la nivelul genei canalului sodiului. Teste efectuate asupra oocitelor deXenopus
ce au exprimate canalele sodiului, au demonstrat c aceste mutaii reduc sensibilitatea
acestor canale la piretroizi, ceea ce confirm faptul c acesta reprezint mecanismul majorde rezisten la piretroizi la diverse specii de insecte (Soderlund D.M. i colab., 2003).
7/29/2019 Teza de Doctorat - Varroa
5/25
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp.prezent n stupinele din zona Transilvaniei
233
Wang Ri colab. (2003) au reuit s evidenieze gena pentru canalul sodiului de la arahnide
gena VmNai la Varroa destructorO. Izolarea integral a genei VmNa a reprezentat un
moment important pentru caracterizarea complet a modului de funcionare a acestui
mecanism de rezisten la produse pe baz de piretroizi.
Cel mai cunoscut mecanism de rezisten a albinelor la boli i duntori, pe baza
cruia se poate realiza selecia, este datorat comportamentului igienic al acestora, descris
iniial de Park O.W. (1937), citat de Morse, R.A. & Flottum, K. Eds., 1997. Acest
comportament complex const n dou activiti distincte desfurate n dou etape
successive (Lapidge K.L. i colab., 2002). Primul implic descpcirea celulelor n care seafl larvele infestate, iar cel de al doilea const n eliminarea efectiv a corpului larvei din
celulele descpcite. Pornind de la constatrile lui Park (1937), Rothenbuhler (1964a,b)
presupune existena a dou mecanisme diferite care stau la baza controlului acestor
activiti. Conform acestei aseriuni, fiecare dintre aceste dou activiti este controlat de o
gen cu dou alele, iar comportamentul este transmis la descendeni conform mecanismului
mendeleean. Spre exemplu, dac mperecherea se produce ntre un trntor a crui
comportament igienic este controlat de ambele alele recesive i o matc ce posed doar
cte o alel recesiv pentru fiecare tip de comportament, vor rezulta doardoi descendeni
(un trntori o albin) ce posedambele alele recesive (fig. 3).
Fig. 3.Transmiterea comportamentului igienic laApis mellifera L.(http://members.aol.com/queenb95/genetics.html)
7/29/2019 Teza de Doctorat - Varroa
6/25
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp.prezent n stupinele din zona Transilvaniei
234
CAPITOLUL II
BAZELE TEORETICE ALE METODOLOGIEI DE GENOTIPIOZARE A
PARAZITULUI VARROA SP.
Dup prelevarea i conservarea probelor n condiiile impuse de protocol, procedeul
implic: extracia ADN, amplificarea, restricia, migrarea n gel de agarozi secvenierea.
Izolarea ADN trebuie s fie caracterizat de o eficien ct mai mare, precum i de
obinerea unei cantiti suficiente, de puritate corespunztoare, care mai apoi s poat fi
utilizat n scopul amplificrii, migrrii i eventual secvenierii atunci cd scopul final alanalizei o impune (Vlaic A., 1997; Vlaic A. i colab., 2005). Cea mai utilizat metod de
cuantificare a probelor de ADN se bazeaz pe spectrofotometria de absorbie molecular n
UV. Acizii dezoxiribonucleici dublu catenari prezint un maximum de absorbie la = 260
nm. Majoritatea probelor, ns, conin contaminani, respectiv proteine i ADN i/sau ARN
unicatenar, cu un maximum de absorbie la = 280 nm. O alt categorie de contaminani
specifici acestui tip de probe este reprezentat de fenoli i tiocianai, cu un maximum de
absorbie la = 230 nm. Reacia n Lan a Polimerazei - PCR se bazeaz pe caracteristicile
replicrii ADN-ului. Este o tehnic rapid, care permite obinerea n cantiti suficiente,
pentru scopuri analitice, a unor fragmente specifice de ADN aflate iniial n cantiti foarte
reduse. n studiul de fa s-a recurs la adoptarea tehnicii perfecionate de amplificare,
respectiv Real Time PCR (RT PCR). Principiul metodei se bazeaz pe faptul c fiecare
prob sufer o amplificare PCR n prezena unui fluorocrom prezent n amestecul de reacie,
care produce fluorescen doar atunci cnd produsul specific este recunoscut sau sintetizat.Pragul de fluorescen rezult din analiza curbei de reacie i este determinat n partea
liniar a acesteia. El corespunde fazei n care se nregistreaz cea mai mare eficien a
amplificrii. Tehnica RFLP se bazeaza pe existena, n genomul organismului studiat
(Varroa sp. n cazul de fa), a unor situs-uri de restricie, asupra crora acioneaz specific
anumite enzime, numite enzime de restricie. n urma aciunii acestora, se produce tierea
macromoleculei de ADN i obinerea unor fragmente de diferite lungimi. Distribuia
situsurilor de restricie corespunztoare unei anumite enzime este specific pentru fiecare
specie (Vlaic A. i colab., 2008).
7/29/2019 Teza de Doctorat - Varroa
7/25
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp.prezent n stupinele din zona Transilvaniei
235
CAPITOLUL III
CONCEPTUL DE VALIDARE DE METODE
Procedura de validare a unei metode analitice nou elaborate sau existente urmrete
demonstrarea faptului c acea metod corespunde scopului utilizrii pentru care a fost
elaborat sau selectat i c performanele sale caracteristice, stabilite prin studii de
laborator, satisfac cerinele pentru ca metoda s poat fi aplicat. Principalii parametri care
fac obiectul validrii sunt: selectivitate/specificitate, precizie, exactitate, domeniul de
lucru, liniaritate, limit de detecie, limit de cuantificare, robustee, sensibilitate,
incertitudine. Aceste criterii sunt prevzute i n normele ISO i ale IUPAC i, prin urmare,
i n nota explicativ a Comisiei de specialitate a Uniunii Europene.
CAPITOLUL IV
SCOPUL OBIECTIVELE I IMPORTANA CERCETRII
Scopul tezei de doctorat a vizat dou problematici n strns conexiune, respectiv
identificarea genotipului speciei care paraziteaz Apis mellifera carpatica L. n
Transilvania, precum i propunerea spre validare a metodei de genotipizare pe baz de
ADNprovenit de la parazitul Varroa sp. n condiiile Laboratorului Zonal de Genotipizare a
Animalelor Domestice a USAMV Cluj Napoca, lund n considerare prezena i
importana comportamentului igienic al albinei melifere n rezistena la aciunea parazitului
Varroa.
Planul experimental al cercetrii a prevzut luarea n studiu a comportamentului
igienic al albinelor localizate randomizat n stupine din cele 10 judee din Transilvania
(Alba, Bistria - Nsud, Braov, Cluj, Covasna, Harghita, Hunedoara, Mure, Slaj i
Sibiu), precum i dezvoltarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp. i
validarea acesteia n condiiile Laboratorului Zonal de Genotipizare a AnimalelorDomestice a USAMV Cluj - Napoca.
http://ro.wikipedia.org/wiki/Albahttp://ro.wikipedia.org/wiki/Bistri%C5%A3a-N%C4%83s%C4%83udhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Bistri%C5%A3a-N%C4%83s%C4%83udhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Bistri%C5%A3a-N%C4%83s%C4%83udhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Bistri%C5%A3a-N%C4%83s%C4%83udhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Bistri%C5%A3a-N%C4%83s%C4%83udhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Bistri%C5%A3a-N%C4%83s%C4%83udhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Bistri%C5%A3a-N%C4%83s%C4%83udhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Bra%C5%9Fovhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Bra%C5%9Fovhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Bra%C5%9Fovhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Clujhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Covasnahttp://ro.wikipedia.org/wiki/Harghitahttp://ro.wikipedia.org/wiki/Hunedoarahttp://ro.wikipedia.org/wiki/Mure%C5%9Fhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Mure%C5%9Fhttp://ro.wikipedia.org/wiki/S%C4%83lajhttp://ro.wikipedia.org/wiki/S%C4%83lajhttp://ro.wikipedia.org/wiki/S%C4%83lajhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Sibiuhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Sibiuhttp://ro.wikipedia.org/wiki/S%C4%83lajhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Mure%C5%9Fhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Hunedoarahttp://ro.wikipedia.org/wiki/Harghitahttp://ro.wikipedia.org/wiki/Covasnahttp://ro.wikipedia.org/wiki/Clujhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Bra%C5%9Fovhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Bistri%C5%A3a-N%C4%83s%C4%83udhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Alba7/29/2019 Teza de Doctorat - Varroa
8/25
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp.prezent n stupinele din zona Transilvaniei
236
Importana cercetriiLa noi n ar, nu au fost efectuate studii moleculare asupra caracteristicilor
parazitului Varroa sp. i de asemenea, nu a fost ntreprins un studiu integrat ce vizeaz
implicarea comportamentul igienic al varietii autohtone de albine n rezistena la boli n
greneral i la Varroa sp. n particular.
Procedeul de validare a unei metode analitice nou elaborate sau existente urmrete
demonstrarea faptului c acea metod corespunde scopului utilizrii pentru care a fost
elaborat sau selectat i c performanele sale caracteristice, stabilite prin studii de
laborator, satisfac cerinele pentru ca metoda s poat fi aplicat (Kennedy S., 1997). n
validarea metodelor analitice principalii parametri care fac obiectul validrii sunt:
selectivitate/specificitate, precizie, exactitate, domeniul de lucru, liniaritate, limit de
detecie, limit de cuantificare, robustee, sensibilitate i incertitudine. Aceste criterii sunt
prevzute i n normele ISO i IUPAC .
Enunate fiind principiile generale care stau la baza procedeelor de validare, trebuie
subliniat faptul c acestea prezint caracteristici specifice pentru fiecare tip de analizi, de
asemenea, sunt specifice i pentru laboratoarele n care sunt aplicate. n consecin,implementarea acestora n laboratoarele de genetic molecular prezint o serie de
particulariti, trebuind s rspund unor exigene specifice (OECD, 2007; Jennings L. i
colab., 2009).
n acest context, prezentul studiu i aduce aportul la caracterizarea metodei analitice
de de izolare, cuantificare i amplificare a ADN din parazitul Varroa destructor O. Din
punct de vedere al performanelor analitice i totodat rezultatele obinute permnit
ncadrarea aacestora n categoria celor care pot parcurge cu succes exigenele procedeelor
de validare n condiiile asigurrii calitii n laboratoarele de biologie molecular (IUPAC,
ISO: 2005, 17025).
Genotipizarea are un potenial ridicat n depistarea tulpinilor aparinnd
Varroa sp. care au dezvoltat rezisten la tratamentul chimic i a cror existen a fost
demonstrat nc din anii 90 (ben Hamida T., 1997). n urma aplicrii genotipizrii i
confruntrii cu datele din literatur se pot evita cheltuieli inutile cu achiziionarea i
7/29/2019 Teza de Doctorat - Varroa
9/25
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp.prezent n stupinele din zona Transilvaniei
237
aplicarea tratamentelor cu Amitraz, Apistan, Cumafos .a. care se dovedesc ineficiente
i aplicarea direct a unor soluii diferite de combatere.
CAPITOLUL V
EVIDENIEREA COMPORTAMENTULUI IGIENIC LAAPIS MELLIFERA
CARPATICA L. DIN ZONA TRANSILVANIEI
Rezultatele obinute demonstreaz c n nici una dintre stupinele studiate, familiile de
albine analizate nu au manifestat comportament igienic, procentul mediu de descpcire a
nregistrat valoarea maxim n judeul Cluj, maximumul nregistrat fiind de 78,72%, situat
mult sub limita de 91% de la care familiile de albine se consider c manifest rezisten
natural la boli i parazii ca urmare a comportamentului igienic.
Cea mai mic medie pentru procentul de descpcire a fost nregistrat n judeul
Harghita, 67,54%.
CAPITOLUL VI
REZULTATE PRIVIND DEZVOLTAREA METODEI DE GENOTIPIZARE APARAZITULUI VARROA SP. PREZENT N STUPINELE DIN ZONA
TRANSILVANIEI
Acest demers constituie un proces laborios care implic o succesiune de etape (fig. 30).
7/29/2019 Teza de Doctorat - Varroa
10/25
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp.prezent n stupinele din zona Transilvaniei
238
Prelevarea probelor
Izolarea ADN
Purificarea ADN
Amplificarea ADN
Restricia produsului de amplificare
cu enzimeleSacI iXhoI
Migrarea n gel de agaroz 2%
i vizualizarea gelului
Secvenierea
Identificarea genotipului
Fig. 30. Etapele procesului de genotipizare a parazitului Varroa sp.
n urma migrrii produsului de amplificare supus restriciei cu enzimele Xho I i
Sac Ia rezultat profilul electroforetic al celor 10 migrri, fiecare corespunztoare unei zone
de colectare a paraziilor (fig. 36).
7/29/2019 Teza de Doctorat - Varroa
11/25
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp.prezent n stupinele din zona Transilvaniei
239
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
700 pb
400 pb
200 pb
150 pb
XX
S
X
Sn n
SS SS
n n
X X
S S
n
X
S
X
SS
nn n n n
XX X
1- Alba, 2 Bistria Nsud, 3 Braov, 4 - Cluj, 5 - Covasna, 6 - Harghita,
7 - Hunedoara, 8 - Mure, 9 - Slaj, 10 Sibiu, X Xho I, S Sac I, n fragment nedigerat
Fig. 36. Profilul electroforetic al probelor de ADN provenit de la parazitul Varroa sp.
obinut n urma restriciei cu enzimeleSac IiXho I(original)
Secvenierea a fost realizat de ctre compania Mycrosinth n Elveia. Rezultatele
secvenierii au evideniat structura de interes prezent n subunitatea I a genei mitocondriale
citocromoxidazei (CO I) a paraziilor aparinnd genotipului Varroa sp. recoltai din
stupine localizate n Transilvania. A rezultat urmtoarea secven (n format FASTA):
ATTTATTTTGATTTTTTGGACACCCAGAAGTTTATATTTTAATTTTGCCTGGTTTTGGTATTATTTCTCAGTAATTTGTATACAGAGAGGGAAGAAGCAGCCTTTTGGAAATTTAGGGATAATTTACGCTATAATAACTATTGGTATTTTAGGTTTTATTGTATGAGCTCATCATATATTTACAGTAGGAATAGATATTGATACTCGAGCATATTTTACTGCAGCTACAATAATTATTGCGGTTCCTACTGGTATTAAAATTTTTTCTTGATTAGCAACAATTCATGGTTCTATAGTTAAATTAGATGTCCCAATAATTTGATCTTTAGGTTTTATTTTTTTATTTACTTTAGGGGGTATTACTGGTGTAATTTTAGCTAATTCTTCTATTGATATTGTTTTACATGATACTTATTATGTAGTAGCACATTTTCACTATGTATTAAGAATAGGGGCT
Compararea structurii secvenei izolate de noi din ADN provenit de la indivizi
Varroa sp. prezeni n stupinele din Transilvania, cu genotipurile existente n baza de date
NCBI, a crei rezultat a constat n suprapunerea de 100% cu secvenele cu numerele de
acces AF106900.1, AJ84872.1.i AY372063.1 (fig. 40), a condus la constatatrea c
genotipul Varroa existent n Transilvania coincide cu genotipul China 2, ce paraziteazApis
cerana n Asia.
7/29/2019 Teza de Doctorat - Varroa
12/25
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp.prezent n stupinele din zona Transilvaniei
240
Query 1 atttattttgattttttggacacccagaagtttatattttaattttgcctggttttggta 60
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1 ATTTATTTTGATTTTTTGGACACCCAGAAGTTTATATTTTAATTTTGCCTGGTTTTGGTA 60
Query 61 ttatttCTCATGTAATTTGTATACAGAGAGGGAAGAAGCAGCCTTTTGGAAATTTAGGGA 120
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 61 TTATTTCTCATGTAATTTGTATACAGAGAGGGAAGAAGCAGCCTTTTGGAAATTTAGGGA 120
Query 121 TAATTTACGCTATAATAACTATTGGTATTTTAGGTTTTATTGTATGAGCTCATCATATAT 180
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 121 TAATTTACGCTATAATAACTATTGGTATTTTAGGTTTTATTGTATGAGCTCATCATATAT 180
Query 181 TTACAGTAGGAATAGATATTGATACTCGAGCATATTTTACTGCAGCTACAATAATTATTG 240
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 181 TTACAGTAGGAATAGATATTGATACTCGAGCATATTTTACTGCAGCTACAATAATTATTG 240
Query 241 CGGTTCCTACTGGTATTAAAATTTTTTCTTGATTAGCAACAATTCATGGTTCTATAGTTA 300||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 241 CGGTTCCTACTGGTATTAAAATTTTTTCTTGATTAGCAACAATTCATGGTTCTATAGTTA 300
Query 301 AATTAGATGTCCCAATAATTTGATCTTTAGGTTTTAtttttttATTTACTTTAGGGGGTA 360
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 301 AATTAGATGTCCCAATAATTTGATCTTTAGGTTTTATTTTTTTATTTACTTTAGGGGGTA 360
Query 361 TTACTGGTGTAATTTTAGCTAATTCTTCTATTGATATTGTTTTACATGATACTTATTATG 420
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 361 TTACTGGTGTAATTTTAGCTAATTCTTCTATTGATATTGTTTTACATGATACTTATTATG 420
Query 421 TAGTAGCACATTTTCACTATGTATTAAGAATAGGGGCT 458
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 421 TAGTAGCACATTTTCACTATGTATTAAGAATAGGGGCT 458
Fig. 40.Secvenele genotipurilor originale China 2 (Anderson i Trueman, 2000;Ting Y. i
colab., 2004; Solignac M. i colab., 2005) obinute pentru Varroa destructori a celor
obinute n stupinele din Transilvania
CAPITOLUL VII
VALIDAREA METODEI DE GENOTIPIZARE A PARAZITULUIVARROA DESTRUCTOR O.
Pe baza testrii parametrilor de reacie implicai n procedeul de izolare a ADN din
parazitul Varroa destructorO., a fost elaborat un flux de operaii care au avut drept rezultat
dezvoltarea unei metode de izolare i cuantificare a ADN.
n urma caracterizrii parametrilor de performan ai metodei (selectivitate/
specificitate, precizie, exactitate, parametrii analizei de regresie liniar, liniaritate, domeniul
7/29/2019 Teza de Doctorat - Varroa
13/25
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp.prezent n stupinele din zona Transilvaniei
241
de lucru, test de liniaritate, limit de detecie, limit de cuantificare robustee, i
incertitudinea de msurare) a rezultat c procedeul are o capabilitate (proficiency)
corespunztoare i este n conformitate cu scopul pentru care a fost selectat (tabelul 25).
Tabelul 25
Gradul de ndeplinire a criteriilor de validare selectate pentru metoda spectrofotometric de
absorbie molecular UV-VIS dezvoltat n vederea cuantificrii ADN izolat din parazitul
Varroa destructorO.
Parametrul Rezultat impus Rezultat realizat
1 2 3
Selectivitatea Obinerea spectrului de
absorbie molecular UV-VIS la
= 230 nm, = 260 nm i
respectiv = 280 nm, pentru
diferite cantiti de ADN (ng/l)
izolate de la parazitul Varroa
destructorO.
Tehnic specific
Precizia RSD% < 3,50 Repetabilitate RSD% = 1,98%
Precizia intermediar RSD% = 1,64%
Exactitatea 85% R 105% R = 99,60%
Parametrii analizei de
regresie liniar
Curba de etalonare are o
reprezentare liniar de forma
y = a + bx
y = 0,0675 + 0,0009x
Absorbana(Absorbance)
Cantitatea de ADN extras din parazitul Varroa destructorO., ng/l
Quantity of DNA extracted from Varroa destructorO. mite, ng/l
7/29/2019 Teza de Doctorat - Varroa
14/25
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp.prezent n stupinele din zona Transilvaniei
242
Tabelul 25 continuare
1 2 3
Liniaritate Dispersie redus a valorilor
individuale n jurul dreptei de
regresie
400
450
500
550
600
650
700
750
-0,58 -0,08 0,42 0,92 1,42
Domeniu de lucru Testul de omogenitate a
dispersiilor
Valoarea de ncercare PG < 5,35
PG = 1,484
Testul de liniaritate Valoarea abaterii standard reziduale
(0,8139) indic o dispersie redus a
valorilor individuale n jurul liniei de
regresie calculate.
Limita de detecie i
limita de cuantificare
Limita de cuantificare trebuie s
fie superioar cu cel puin un
ordin de mrime Limitei de
detecie
xLC = 0,002500 ng/l
xLD = 0,000859 ng/l
Robusteea Influena minim a variaiilor
parametrilor metodei
-Stabilitatea n timp a soluiei de
ADN izolat din parazitul Varroa
destructorO.
Metoda are un caracter robust, din
punct de vedere a stabilitii n timp a
soluiei de ADN (rproaapt, r48hi r96h).
- izolat ADN proaspt -
Cantitatea de ADN extras din parazitul Varroa destructorO., ng/l
Quantity of DNA extracted from Varroa destructorO. mite, ng/l
r = 0,9833
Absorbana(Absorbance)
Absorbana (Absorbance)
CantitateadeADNextrasdin
parazitulVarroadestructorO.,ng/l
QuantityofDNAextractedfrom
VarroadestructorO.mite,ng/l
7/29/2019 Teza de Doctorat - Varroa
15/25
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp.prezent n stupinele din zona Transilvaniei
243
Tabelul 25 continuare
1 2 3
- izolat ADN la 48 ore dup preparare
- izolat ADN la 96 ore dup preparare
-Influena temperaturii Metoda are un caracter robust dac se
lucreaz la temperatura ambiental
normal 15 - 200C i se evit variaiile de
temperatur (tabelul 21).
Incertitudinea de
msurare
Stabilirea bugetului de
incertitudini.
Cea mai mare contribuie le bugetul de
incertitudini este adus de volumul total de
soluie supus cuantificri (soluie tampon
+ ADN izolat).
0,0086592
3,21066
3,2363877
0,407738
0,747674,391795
0,1318
0,025
0 1 2 3 4 5
u_absorban (ADN)
u_volum (Tips)
u_volum (Total)
u_volum (Ap pur)
u_volum (Nonidet)
u_volum (tampon)
u_volum (Eppendorf)
u_puritate (Tris)
Absorbana(Absorbance)
r = 0,9827
Cantitatea de ADN extras din parazitul Varroa destructorO., ng/l
Quantity of DNA extracted from Varroa destructorO. mite, ng/l
Absorbana(Absorbance)
r = 0,9759
Cantitatea de ADN extras din parazitul Varroa destructorO., ng/l
Quantity of DNA extracted from Varroa destructorO. mite, ng/l
7/29/2019 Teza de Doctorat - Varroa
16/25
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp.prezent n stupinele din zona Transilvaniei
244
Tabelul 32
Gradul de ndeplinire a criteriilor de validare selectate pentru metoda de amplificare a
fragmentului de ADN mitocondrial localizat la nivelul genei CO-I a parazitului
Varroa destructorO.
Parametrul Rezultat impus Rezultat realizat
1 2 3
Limita de detecie Amplificarea devine vizibil
dup un numr redus de cicluri
de amplificare (< 21)
Ct =16,83
Reproductibilitatea Nu exist diferene ntre
rezultatele obinute de analiti
diferii care realizeaz
amplificarea n acelai
Termocycler
Precizia Valoare ct mai redus a
deviaiei standard pentru
amplificarea aceleiai probe n
20 de repetiii
s = 0,638
Sensibilitatea Cantitate ct mai redus de
ADN ce poate fi amplificat
(< 1 g)
500 ng
700 pb
400 pb
150 pb
500 pb
400 pb
150 pb
7/29/2019 Teza de Doctorat - Varroa
17/25
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp.prezent n stupinele din zona Transilvaniei
245
Liniaritatea Dispersie redus a valorilor
individuale n jurul dreptei de
regresie
Robusteea Influena minim a variaiilor
parametrilor metodei
-Stabilitatea n timp a soluiei de
ADN izolat din parazitul Varroa
destructorO. (amplificare ADN:
izolat proaspt - a, dup 48h - b
i dup 96h - c)
-Influena temperaturii de
ataare a primerilor
-n condiile prezervrii probelor n
condiii corespunztoare, au fost obinute
geluri identice.
a
b
c
Metoda are un caracter robust dac se
lucreaz la temperatura de ataare a
primerilor de 500C.
MediavalorilorCT
TheaveraeofC
Tvalues
700 pb
500 pb
700 pb
500 pb
700 pb
500 pb
150 pb
Log din cantitatea de ADNLog of DNA quantity
7/29/2019 Teza de Doctorat - Varroa
18/25
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp.prezent n stupinele din zona Transilvaniei
246
Tabelul 32 continuare
1 2 3
Incertitudinea de
msurare
Stabilirea bugetului de
incertitudini.
Cea mai mare contribuie le bugetul de
incertitudini este adus de volumul total de
soluie supus amplificrii (soluie tampon
+ ADN izolat).
0,0086592
1,1859058
0,0250,0375
0,015
0,1001278
0,3184415
0,2700263
0,2000003 2,1606608
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Valo
T
ipulincertitudinii(Typeofincertitude)
Aceste constatri permit ncadrarea metodei de izolare i cuantificare i amplificare a
ADN din parazitul Varroa destructor O. n categoria celor care pot parcurge cu succes
exigenele procedeelor de validare n condiiile asigurrii calitii n laboratoarele debiologie molecular (IUPAC, ISO: 2005, 17025).
CONCLUZII
Datorit faptului c finalitatea tezei de doctorat a vizat o abordare complex a
problematicii dezvoltrii i validrii unei metode de genotipizare a parazitului Varroa
sp. n stupinele din zona Transilvaniei, n conexiune cu particularitile albinei
melifere (Apis mellifera L.) din punctul de vederea al aspectelor etologice i al
mecanismelor de rezisten la boli i parazii, concluziile formulate debuteaz cu
aceste aspecte.
Privitor la studiul comportamentului igienic al Apis mellifera L., n stupinele din
Transilvania, rezultatele studiului concretizate n nregistrarea valorilor medii ale
procentului de descpcire cuprinse n intervalul 67 78% (cu valoarea medieminim de 67,54% nregistrat n judeul Harghita i maxim de 78,72% n judeul
7/29/2019 Teza de Doctorat - Varroa
19/25
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp.prezent n stupinele din zona Transilvaniei
247
Cluj) au demonstrat c n nici una dintre stupinele studiate, familiile de albine
analizate nu au manifestat comportament igienic, limita de la care familiile de albine
se consider c manifest rezisten natural la boli i parazii ca urmare a
comportamentului igienic fiind de 91%.
Genotipul identificat n urma studiului nostru n stupinele din Transilvania,
corespunde numrului de acces n Banca de Gene AF 106900 este genotipul China 2
(Anderson i colab., 2000), unul dintre cele dou genotipuri Varroa din cadrul
varietii extreme de largi prezente n Asia capabile s paraziteze iApis mellifera L.
Acesta se suprapune 100% cu genotipurile evideniate de Ting Z. si col. (2004) nChina, avnd numarul de acces n baza de date NCBI - AY372063.1 i n Europa, de
Solignac M. i colab. (2005) avnd cu numrul de acces n baza de date NCBI
AJ84872.1
Cuantificarea parametrilor de performan ai metodei de amplificare a ADN din
parazitul Varroa destructor O. enumerai mai sus i analiza rezultatelor obinute,
confirm faptul c aceasta corespunde scopului pentru care a fost selectat i n
consecin poate fi validat.
RECOMANDRI
Pentru combaterea eficient a parazitului Varroa destructorO. este necesar aplicarea
unui management specific rezistenei la duntori, inndu-se cont de faptul c orice
organism, n condiii de constrngere, caut s gseasc soluii de supravieuire. Acesttip de management trebuie s includ tehnici legate de: bune practici n managementul
stupului, meninerea unui grad redus de infestare, dar i aplicarea produselor de
combatere n cantitile omologate i de calitate ecologic.
Identificarea rezistenei parazitului Varroa destructor O. la Apistan i cuantificarea
acesteia, constituie premisa pentru elaborarea unor strategii eficiente pentru combaterea
parazitului. Cunoscndu-se genotipul Varroa sp., precum i faptul c rezistena se
datoreaz apariiei unei mutaii punctiforme la nivelul genei canalului sodiului, prin
7/29/2019 Teza de Doctorat - Varroa
20/25
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp.prezent n stupinele din zona Transilvaniei
248
aplicarea secvenierii se poate dezvolta un sistem de diagnoz eficient, bazat pe
diferenele genetice ntre formele rezistene i cele sensibile.
Este necesar implementarea, la nivel naional, a unui sistem de monitorizare a formrii
i dezvoltrii rezistenei parazitului Varroa destructor O. la tratamentul cu ageni de
combatere piretroidici, dari a celor pe baz de compui organofosforici sau antibiotice,
dei, alturi de o metodologie competent pentru diagnoza acesteia, utilizarea lor este
din ce n ce mai rar datorit efectelor de remanen.
Cuantificarea parametrilor de performan ai metodei de genotipizare a parazitului
Varroa destructor O. (prin aplicarea direct la etapele de de izolare, cuantificare iamplificare a ADN) i analiza rezultatelor obinute, n condiiile Laboratorului Zonal de
enotipizare a Animalelor Domestice, confirm faptul c aceasta poate fi propus spre
validare, contribuind de aceast manier la sporirea competenei laboratorului.
7/29/2019 Teza de Doctorat - Varroa
21/25
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp.prezent n stupinele din zona Transilvaniei
249
BIBLIOGRAFIE SELECTIV
1. Andersen C.L., J.L. Jensen and T. F. rntoft, 2004, Normalization of Real-TimeQuantitative Reverse Transcription-PCR Data: A Model-Based Variance
Estimation Approach to Identify Genes Suited for Normalization, Applied toBladder and Colon Cancer Data Sets, Cancer research, No. 64, 5245 5250
2. denBesten P.J. 1998, Cytochrome P450 monooxygenase system in echinoderms,Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and
Endocrinology, Vol. 121, No. 1 - 3, 139 146
3. Brown, T.A., 2002, Genomes, 2nd Edition, BIOS Scientific Publishers Ltd., 101, 121,122
4. Bruneau E., Jacobs F., and Trouiller J., 1997, Rsultats de la campagne dedtectionde la rsistance de Varroa aux pyrthrinodes en Belgique - 1997. Abeilles et
Compagnie, No. 60, 5 6
5. Bura M., Creterea intensiv a albinelor, 1996, Editura Helicon, Timioara6. Bura M., Silvia Ptruic, V.A. Bura, 2005, Tehnologie Apicol, Ed. Solnes,
Timioara
7.Burkardt H. J., Standardization and quality control of PCR analyses, Clin. Chem.Lab. Med, 2000, Vol. 38, No. 2, 87 91
8. Cuia Eliza, 2006 - 2008, Determinarea rezistenei naturale la boli a populaiilorde albine (A. M. Carpatica) din Romania pe baza unor teste specifice i
realizarea unei metodologii optime de ameliorare pentru acest character, Proiect
CEEX, Modulul II, EP
9. Colton T., 1974, Statistics in Medicine, Little Brown Publishers, 372 pag.10. Coier Viorica, A. Vlaic, 2007, Abordarea practic a problemelor de genetic
animal, Editura Todesco, Cluj - Napoca
http://www.sciencedirect.com/science/journal/07428413http://www.sciencedirect.com/science/journal/07428413http://www.sciencedirect.com/science?_ob=PublicationURL&_tockey=%23TOC%234926%231998%23998789998%2331471%23FLA%23&_cdi=4926&_pubType=J&view=c&_auth=y&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=b559d837238ba1051e7c30103f75eba7http://www.sciencedirect.com/science?_ob=PublicationURL&_tockey=%23TOC%234926%231998%23998789998%2331471%23FLA%23&_cdi=4926&_pubType=J&view=c&_auth=y&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=b559d837238ba1051e7c30103f75eba7http://www.sciencedirect.com/science/journal/07428413http://www.sciencedirect.com/science/journal/074284137/29/2019 Teza de Doctorat - Varroa
22/25
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp.prezent n stupinele din zona Transilvaniei
250
11. Defilando Baker M. D., 1988, Variability and biotypes of Varroa jacobsoniOudemans, American Bee Journal, Vol. 128, No. 8, 567 568
12. Dezmirean S. Daniel, L. Al. Mrghita, Graia I. Dezmirean, G. Dini, O.Bobi, L.Laslo, A. Moise, Antonia Odagiu, A. Fiiu, I. Paca, C. Bojan, Simona Brsan, O.
Maghear, C. Coroian, M. Man; 2007, Reccomandations regarding prophylaxis of
honey contamination during primary processing, Apicultura de la tiin la
agribusiness i apiterapie, 82-84
13. Dezmirean D., L. Al. Mrghita, Oltica Giorgiana Stanciu, Otilia Bobi, Laura Laslo,Adela Moise, O.Maghear, Cristina Bojan, 2008, Mineral composition of honeydewhoney produced in Transylvania determined by Atomic Absorbtion
Spectrometry, Bulletin USAMV-CN, Vol. 65, No.1 - 2, 233-237
14. Gonccalves M.C., M. M. Klerks, M. Verbeek, J. Vega, J. F. van den Heuvel, 2002,The use of molecular beacons combined with NASBA for the sensitive detection
of Sugarcane Yellow Leaf Virus, European Journal of Plant Pathology No. 108,
401407
15. de Graaf D.C., W. Ritter, F. J. Jacobs, Marleen Brunian, H. Inberechts, K. Mintiens,Y. Van der Stede, B. Verheyden, A.K. Fauske, P. Boujon, Gabriela Chioveanu, D.
Dezmirean, G. Formato, F. Mutinelli, H.-J. Roest, D. Titera, S.F. Pernal, Katia
Knapen, 2009, Lessons from the first international proficiency test for the
detection of spores from the honey bee pathogen Paenibacillus larvae,
Accreditation Quality Assurance, No. 14, 273-276
16. Martin S. J., 2004, Acaricide (pyrethroid) resistance in Varroa destructor, BeeWorld, No. 85, 67 - 69
17. Mrghita L. Al., 2003, Albinele i produsele lor, Editura Ceres, Bucureti18. Mrghita L. Al., D. Dezmirean - Coordonatori, 2007, Apicultura de la tiin la
agribusiness i apiterapie, Editura AcademicPres, Cluj - Napoca
19. Milani N., G. Della Vedova, 2002, Decline in the proportion of mites resistant tofluvalinate in a population of Varroa destructor not treated with pyrethroids,
Apidologie, No. 33, 417 - 422
7/29/2019 Teza de Doctorat - Varroa
23/25
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp.prezent n stupinele din zona Transilvaniei
251
20. Odagiu Antonia, A. Vlaic, L. Al. Mrghita, D. Dezmirean, I. Cornoiu, Laura Laslo,2007, Research into the hygienic behaviour of honeybees in Transylvania,
Proceedings of the 42nd Croatian&2nd International Symposium on Agriculture, 13-16
February, 302 306
21. Odagiu Antonia, A. Vlaic, L. Al. Mrghita, D. Dezmirean, 2007, The hygienicbehavior testing honeybee colonies from Transylvanian area, n Apicultura
de la tiin la agribusiness i apiterapie, Mrghita L. Al., D. Dezmirean -
Coordonatori, Editura AcademicPres, Cluj Napoca, 17 - 19
22. Odagiu Antonia., A.Vlaic, L. Al. Mrghita, I. Oroian, D. Dezmirean, Dana Pusta,2008, The Validation of the DNA Extraction Method from Apis mellifera L.,
Bulletin of University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, Animal
Science and Biotechnologies, Vol. 65, No.1 - 2, 387 390
23. Odagiu Antonia, I. Oroian, A. Vlaic, Al. Mrghita, P. Mazzone, E. Caprio, D.Dezmirean, 2009, Assessing Linearity of the Parasite Varroa destructor DNA
Amplification, ProEnvironment/ProMediu, Vol. 2, No. 4, 226 229 (319 322)
24. PattiElzen and D. Westervelt, 2004, A scientific note on reversion of fluvalinateresistance to a degree of susceptibility in Varroa destructor, Apidologie, No. 35,
519 520
25. Peirson S. N., J. N. Butler, and R. G. Foster, 2003, Experimental validation ofnovel and conventional approaches to quantitative real-time PCR data analysis,
NucleicAcid Res., Vol. 31, No. 14, 118 125
26. Peters I. R., C. R. Helps, E. J. Hall, and M. J. Day, 2004, Real-time RT-PCR:considerations for efficient and sensitive assay design, J. Immunol. Methods, Vol.
286, Nos. 1- 2, 203217
27. Ponchel F., C. Toomes, K. Bransfield, F. T. Leong, Susan Douglas, Sarah Field,Sandra Bell, Valerie Combaret, A. Puisieux, A.J. Mighell, P. A. Robinson, C. F.
Inglehearn, J. D. Isaacs and A. F. Markham, 2003, Real-time PCR based on SYBR-
Green I fluorescence: An alternative to the TaqMan assay for a relative
quantification of gene rearrangements, gene amplifications and micro genedeletions, BMC Biotechnology, Vol. 3, No. 18, 1 13
7/29/2019 Teza de Doctorat - Varroa
24/25
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp.prezent n stupinele din zona Transilvaniei
252
28. Rakosy - Tican Elena, 2005, Inginerie genetica vegetala: note de curs, Casa Crii detiin, Cluj-Napoca
29. Rakosy Tican Elena, L. Al. Mrghita, 2007, The bees as vehicles for transgenetransfer from genetically moddified plants to other organisms theoretical
issues, n Apicultura de la tiin la agribusiness i apiterapie, Mrghita L. Al.,
D. Dezmirean - Coordonatori, Editura AcademicPres, Cluj Napoca, 184 188
30. Rieu I. and S. J. Powers, 2009, Real - Time Quantitative RT-PCR: Design,Calculations, and Statistics, Plant Cell, No. 21, 1031 1033
31. Soderlund D. M., 2008, Pyrethroids, knockdown resistance and sodium channels,Pest Management Science, Vol. 64, No. 6, 610 - 616
32. Solignac M., D. Vautrin, E. Baudry, F. Mouguel, A. Loiseau and J-M Cornuet, 2004,A Microsatelitte-Based Linkage Map of the Honeybee, Apis mellifera L.,
Genetics, No. 167, 253 - 262
33. Spivak M., and G. S. Reuter, 2001, Varroa destructor infestation in untreatedhoney bee (Hymenoptera: Apidae) colonies selected for hygienic behavior, Journal
of Economic Entomology, Vol. 94, No. 2, 326 331
34. Tnase I. Gh., G. L. Radu, Al. Pan, Mihaela Buleandr, 2007, Validarea metodeloranalitice. Principii teoretice i studii de caz, Editura PRINTECH, Bucureti
35. Vlaic A., 1997, Inginerie genetic, realizri, sperane, neliniti, Editura Promedia Plus
36. Vlaic A., T. Oroian, Simona Pacalu, 2001, Genotypization of bulls used forartificial insemination at k-casein and-lactoglobulin locus, Bulletin USAMV-
CN, Vol. 55 56, 112 117
37. Vlaic A., T. Oroian, 2004, Elemente de genetic pentru zootehniti, EdituraAcademicPres, Cluj Napoca
38. Vlaic A., Viorica Coier, Antonia Odagiu, T. Oroian, V. Blteanu, 2005, Analysis ofgenetic diversity in five cattle breeds from Romania, Bulletin USAMV-CN, Seria
ZB, Vol. 61, 332
7/29/2019 Teza de Doctorat - Varroa
25/25
Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp.prezent n stupinele din zona Transilvaniei
39. Vlaic A., V. A. Blteanu, F. D. Pop, Anda Raluca Rusu, 2008, Molecular methodsused for detection of cattle milk in buffalo, ewe and dairy products, Lucrri
tiinifice, seria Zootehnie, Iai, Vol. 51, 1016 - 1021
40. Ting Z., L. Anderson, Z. Y. Huang, S. Huang, J. Yao, T. Ken, Q. Zhang, 2004,Identification ofVarroa mites (Acari: Varroidae) infestingApis cerana andApis
mellifera in China, Apidologie, No. 35, 645 - 654
41. ***, 1993, ISO 3534 - 1/VIM, International Vocabulary of Basic and GeneralTerms in Metrology, International Standards Organization, Geneva, Switzerland,
IInd
Edition42. ***, 1995, SR 13 434, ISO/GUM, Guide to the expression of uncertainty in
measurement, International Standards Organization, Geneva, Switzerland
43. ***, 2001, IUPAC Recommendations, Selectivity in analytical chemistry, PureApplied Chemistry, Vol. 73, No. 8, 1381 - 1386
44. ***, 2003, Validation of analytical procedures: Methodology, InternationalConference on Harmonization Federal Register, Vol. 60, 27463
45. ***, 2003, Ghidul ILAC-G17 privind incertitudinea de msurare, SR ENV13005, International Standards Organization, Geneva, Switzerland
46. ***, 2005, Standardul SR EN ISO/CEI 17025 : 2005, International StandardsOrganization, Geneva, Switzerland
Recommended