Teresa de Diego Puente2007
ESTABILIZACIÓN ENZIMÁTICA POR
INGENIERÍA PROTEICA
ESTABILIZACIÓN ENZIMÁTICA POR
INGENIERÍA PROTEICA
ASIGNATURA SíNTESIS BIOCATALÍTICAAlumnos: Segundo Curso de la Licenciatura de Bioquímica
TEMA: ESTABILIZACIÓN ENZIMÁTICA POR INGENIERÍA PROTEICA
SÍNTESIS BIOCATALÍTICA
BIOQUÍMICA INDUSTRIAL
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR “B” E INMUNOLOGÍADEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR “B” E INMUNOLOGÍA
DESCRIPTORES
ASIGNATURA SíNTESIS BIOCATALÍTICA
► Tipos de Biocatalizadores.
► Estabilidad y Estabilización.
► Diseño del Medio de Reacción.
► Aplicaciones en Síntesis Orgánica, Química
Fina y Biomedicina.
Biocatalizador Medio Reactor
OBJETIVOS GENERALES
1. Fundamentos de la estructura y estabilidad de losbiocatalizadores.
2. Estabilización de los biocatalizadores.3. Catalizadores semisintéticos4. Empleo de Medios no convencionales5. Diseño de un proceso biocatalítico de intéres
industrial.
ASIGNATURA SíNTESIS BIOCATALÍTICA
OBJETIVOS GENERALES
2. Estabilización de los biocatalizadores.
Tema 4. Modificación química de biocatalizadores.
Tema 5. Inmovilización de biocatalizadores. Enzimas. Células. Orgánulos.
Tema 6. Estabilización enzimática por ingeniería proteica
ASIGNATURA SíNTESIS BIOCATALÍTICA
⇒ Conocimientos de estructura de proteínas y función de enzimas, de termodinámica y de química orgánica.
⇒ Conocimientos básicos de las técnicas de ingeniería genética o DNA recombinante.
CONOCIMIENTOS PREVIOS
ESTABILIZACIÓN ENZIMÁTICA POR INGENIERÍA PROTEICA
Estabilización enzimáticapor ingeniería proteica.
EnzimologíaMetodologías de
investigaciónbioquímica
Estructura demacromoléculas
Dinámica deMacromoléculas
Técnicas de experimentación
bioquímica
Genética molecular eingeniería genética
BioquímicaIndustrial
Primer curso Segundo curso
CONOCIMIENTOS TRANSVERSALES
OBJETIVOS
1. Definir la estabilización enzimática por Ingeniería de Proteínas.
2. Conocer las tecnologías que se precisan para el desarrollo de un proceso de Ingeniería Proteica por diseño racional.
3. Comprender las bases de un procedimiento de evolución molecular dirigida de proteínas termoestables .
4. Aplicaciones y Perspectivas Futuras.
ESTABILIZACIÓN ENZIMÁTICA POR INGENIERÍA PROTEICA
ENZIMAESTABILIZADA
Ingeniería del Medio
de ReacciónInmovilización Modificación
QuímicaIngeniería Proteica
ESTABILIZACIÓN DE ENZIMAS
ESTABILIZACIÓN ENZIMÁTICA POR INGENIERÍA PROTEICA
ENZIMAS ESTABLES
INTRÍNSECAMENTE
LPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILLTGTTGPQSFDSNWIPLSTQLGYTPCWISPPPFMLN DTQVNTEYMVNAITALYAGSGNNKLPVLTWSQGGL VAQWGLTFFPSIRSKVDRLMAFAPDYKGTVLAGPL DALAVSAPSVWQQTTGSALTTALRNAGGLTQIVPT TNLYSATDEIVQPQVSNSPLDSSYLFNGKNVQAQA VCGPLFVIDHAGSLTSQFSYVVGRSALRSTTGQAR SADYGITDCNPLPANDLTPEQKVAAAALLAPAAAA IVAGPKQNCEPDLMPYARPFAVGKRTCSGIVTP
MODIFICACIÓN DE SU SECUENCIA AMINOACÍDICA
ESTABILIZACIÓN ENZIMÁTICA POR INGENIERÍA PROTEICA
ENZIMAS ESTABLES INTRÍNSECAMENTE
LPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWIPLSTQLGYTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVNAITALYAGSGNNKLPVLTWSQGGLVAQWGLTFFPSIRSKVDRLMAFAPDYKGTVLAGPLDALAVSAPSVWQQTTGSALTTALRNAGGLTQIVPTTNLYSATDEIVQPQVSNSPLDSSYLFNGKNVQAQACGPLFVIDHAGSLTSQFSYVVGRSALRSTTGQARSADYGITDCNPLPANDLTPEQKVAAAALLAPAAAAVAGPKQNCEPDLMPYARPFAVGKRTCSGIVTP
Rediseño de Proteínas
I. Diseño Racional por Mutagénesis dirigida
II. Evolución Molecular dirigida
ESTRATEGIAS PARA LLEVAR A CABO UNA MODIFICACIÓN ENZIMÁTICA POR INGENIERÍA PROTEICA
DISEÑOY PREDICCIÓN
2
DNARECOMBINANTE
3
PURIFICACIÓN4
FUNCIÓNCONFORMACIÓN
5
ANÁLISISESTRUCTURAL
1
INGENIERÍA DE PROTEÍNAS POR DISEÑO RACIONAL
DISEÑOY PREDICCIÓN
2
DNARECOMBINANTE
3
PURIFICACIÓN5
FUNCIÓNCONFORMACIÓN
6
ANÁLISISESTRUCTURAL
1
INGENIERÍA DE PROTEÍNAS POR DISEÑO RACIONAL
ANÁLISIS ESTRUCTURAL
ESTRUCTURA FUNCIÓNTRIDIMENSIONAL ESTABILIDAD
► Difracción de rayos X
► Resonancia Magnética Nuclear
Difracción de rayos X
Patrón de difracción de Rayos X
Cristal de la lisozima
ANÁLISIS ESTRUCTURAL
Difracción de Rayos X
ANÁLISIS ESTRUCTURAL
Resonancia Magnética Nuclear► Proteínas en disolución► RMN multidimensional► 800 MHz► [1mM] de proteína► < 40 kDa
NATIVA DESNATURALIZADA
ANÁLISIS ESTRUCTURAL
Mioglobina
Lisozima
ANÁLISIS ESTRUCTURAL
Cápsida de un Adenovirus humano (2 BVI)
Ribozima
ANÁLISIS ESTRUCTURAL
HYDROLASE (CARBOXYLIC ESTERASE) 11-JUL-95LIPASE (E.C.3.1.1.3) (TRIACYLGLYCEROL HYDROLASE) ORGANISM_SCIENTIFIC: CANDIDA ANTARCTICA;
CRYST1 95.100 50.200 99.500 90.00 90.60 90.00 P 21 4 1LBT 173
ORIGX1 1.000000 0.000000 0.000000 0.00000 1LBT 174
ORIGX2 0.000000 1.000000 0.000000 0.00000 1LBT 175
ORIGX3 0.000000 0.000000 1.000000 0.00000 1LBT 176
SCALE1 0.010515 0.000000 0.000110 0.00000 1LBT 177
SCALE2 0.000000 0.019920 0.000000 0.00000 1LBT 178
SCALE3 0.000000 0.000000 0.010051 0.00000 1LBT 179
MTRIX1 1 -0.033200 0.007500 -0.999400 46.86330 1LBT 180
MTRIX2 1 -0.005700 -1.000000 -0.007300 48.28900 1LBT 181
MTRIX3 1 -0.999400 0.005500 0.033200 49.58020 1LBT 182
ATOM 1 N LEU 1 -13.383 6.632 8.895 1.00 22.02 1LBT
ATOM 2 CA LEU 1 -12.982 7.995 8.460 1.00 22.02 1LBT
ATOM 3 C LEU 1 -13.953 8.446 7.381 1.00 22.02 1LBT
ATOM 4 O LEU 1 -14.331 7.657 6.515 1.00 22.02 1LBT
ATOM 5 CB LEU 1 -11.563 7.960 7.903 1.00 10.93 1LBT
ATOM 6 CG LEU 1 -10.630 9.123 8.203 1.00 10.93 1LBT
ATOM 7 CD1 LEU 1 -10.577 9.382 9.693 1.00 10.93 1LBT
ATOM 8 CD2 LEU 1 -9.251 8.791 7.653 1.00 10.93 1LBT
ATOM 9 N PRO 2 -14.417 9.706 7.454 1.00 18.56 1LBT
1LBT
Banco de Datos de Proteínas (Protein Date Bank, .pdb)
Información de parámetros cristalográficos
Información de átomo,residuo y cadena
Coordenadas atómicas
Factor de poblaciónFactor Térmico
ANÁLISIS ESTRUCTURAL
Banco de Datos de ProteínasANÁLISIS ESTRUCTURAL
Diagrama de Ramanchandran Estructura Tridimensional
1LBT
Banco de Datos de ProteínasANÁLISIS ESTRUCTURAL
Rayos X38.253 42.668 proteínas RMN
5.628
>46.000 Totales5000 Por año
19762007
RasMolhttp://www.umass.edu/microbio/rasmol/getras.htm
Protein Explorer
http://proteinexplorer.org
PyMolhttp://pymol.sourceforge.net
ANÁLISIS ESTRUCTURALProgramas de visualización de moléculas
ANÁLISIS ESTRUCTURAL
ANÁLISIS ESTRUCTURAL
Porelemento
Aminoácidos
Por cadena, por estructura secundaria
COLOR
MOVIMIENTO : Rotar, trasladar, ampliar, reducir, cortar, etcFORMA: varillas, bolas, cintas, etc
DISEÑOY PREDICCIÓN
2
DNARECOMBINANTE
3
PURIFICACIÓN4
FUNCIÓNCONFORMACIÓN
5
ANÁLISISESTRUCTURAL
1
INGENIERÍA DE PROTEÍNAS POR DISEÑO RACIONAL
INVESTIGACIÓNBÁSICA
OBJETIVO: ESTABILIZACIÓN DEL
BIOCATALIZADOR
INTERÉS INDUSTRIAL
DISEÑO RACIONAL
DISEÑO RACIONAL
Proteínas Extremófilas:● Temperatura: termófilos y psicrófilos• pH: alcalófilos y acidófilos• [sal]: halófilos• Presión: barófilos o piezófilos...
Taq Polimerasa
Las proteínas son más compactas
Aislada del hipertermófiloThermus aquaticus
Tª óptima: 72-75ºC
REGLAS DE DISEÑO PROTEÍNAS TERMOESTABLES
DISEÑO RACIONAL
INCREMENTO
● Empaquetamiento intramolecular● Aminoácidos formadores de hélice α● Pro● Puentes salinos● Enlaces carga-neutro● Estabilización de dipolos en hélices● Estabilización por redes de carga superficial
DISMINUCIÓN● Bucles superficiales● Asn● Movilidad extremo N-terminal
●Reemplazamiento de pares iónicos internos
●Reemplazamiento interno de la His, Cys y Tyr
●Alteración de los grupos cargados de la superficieEstabilidad frente
al pH
●Alteración de los grupos carboxilo de la superficie
●Conversión de Met por Gln, Val, Ile o Leu
●Conversión de Cys por Ala o SerEstabilidad frentea metales pesados
● Conversión de Trp por Phe o Tyr● Conversión de Met por Gln, Val, Ile o Leu
● Conversión de Cys por Ala o SerEstabilidad frentea la oxidación
● Incremento de las interacciones iónicas
● Incremento de las interacciones hidrofobicas
● Incremento de puentes de hidrogenoTermoestabilidad
● Introducción de puentes disulfuro
EstrategiaObjetivo
DISEÑO RACIONAL
TERMOESTABILIZACIÓN ENZIMÁTICA
ΔG =ΔH-TΔS
ΔG
ΔH
ΔS
POR RIGIDIFICACIÓN DE LA ESTRUCTURA
PROTEICA
DISEÑO RACIONAL
MUTACION [1] Phe 123 Trp –1 MVLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASE 59 60 DLKKHGVTVLTALGAILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISEAIIHVLHSRH 119 120 PGDWGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKELGYQG 153
MUTACIÓN [2] Ser 108 Leu –1 MVLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASE 59 60 DLKKHGVTVLTALGAILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFILEAIIHVLHSRH 119 120 PGDFGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKELGYQG 153 STABILITY
MUTACIÓN [3] Ser 108 Lys1 MVLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASE 5960 DLKKHGVTVLTALGAILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFIKEAIIHVLHSRH 119
120 PGDFGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKELGYQG 153
MUTACIÓN [4] Ala 130 Lys –1 MVLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASE 59 60 DLKKHGVTVLTALGAILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISEAIIHVLHSRH 119 120 PGDFGADAQGKMNKALELFRKDIAAKYKELGYQG 153
Mioglobina (1mlm) .Proteína globular con 153 aaAfectan a la estabilidad de la proteína frente a altas presiones
Bases de datos de proteínas mutadashttp://pmd.ddbj.nig.ac.jp/ 218,873 entradasINSTITUTO DE INGENIERÍA PROTEICA (Japón)
DISEÑO RACIONAL
BIOINFORMÁTICA
PREDICCIÓN
1ª GENERACIÓNFiabilidad: 50-60%
2ª GENERACIÓNFiabilidad: 70%
MODELADO COMPARATIVO
Programas de modelado proteicoPREDICCIÓN
Programas de modelado proteicoPREDICCIÓN
Modelado comparativo y Teoría evolutiva3ª GENERACIÓN
Fiabilidad: > 70%
Selección evolutivade proteínas
Visualización y manipulación de proteínas y péptidos
Visualización y análisis de la proteína nativa
Simulación de la influencia de una mutación concreta sobre el plegamiento proteico.
Predicción de bucles en la estructura
Interpretación de de cambios sobre la dinámica de la proteína
Comparación de estructuras proteicas
Cálculo de las interacciones atómicas y moleculares que ocurren en la conformación de la proteína nativa y mutada
Programas de modelado proteico
PREDICCIÓN
DISEÑO Y PREDICCIÓN
Homología en secuencia primaria
DISEÑOY PREDICCIÓN
2
DNARECOMBINANTE
2
PURIFICACIÓN3
FUNCIÓNCONFORMACIÓN
4
ANÁLISISESTRUCTURAL
1
INGENIERÍA DE PROTEÍNAS POR DISEÑO RACIONAL
DNA Vector de clonación
Enzimas de restricción
Ligasas
DNA recombinante
Introducción en una célula hospedadora Selección de células con el gen clonado
Expresión de los fragmentos clonados:
Proteínas recombinantes
Gen de interés
Proteínas recombinantes mutadas
DNA RECOMBINANTE
MUTAGÉNESIS DIRIGIDA
TCTAGA
ACAACA
ACA
TCT
TCTTCT
TCTAGA
TCT
TCTAGA
ACATGT
PROTEÍNAS NATIVAS
PROTEÍNASMUTADAS
AATGCGCGTCTAAGCCGAATATTACGCGCACATTCGGCTTATObjetivo: Ser→Cys
Fragmento sintético
(M. Smith, 1993)DNA RECOMBINANTE
Secuenciación de genes
DNA RECOMBINANTE
Base de datos de genes
DNA RECOMBINANTE
Base de Datos Internacional de Secuencias Nucleotídicas
DNA RECOMBINANTE
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez /.
PubMed All Databases BLAST OMIM Books TaxBrowser Structure
Search All Databases
for Go
SITE MAP Alphabetical List Resource Guide About NCBI An introduction to NCBI GenBank Sequence submission support and software Literature databasesPubMed, OMIM, Books, and PubMed Central Molecular databasesSequences, structures, and taxonomy Genomic biology The human genome, whole genomes, and related resources Tools Data mining Research at NCBI People, projects, and seminars Software engineering Tools, R&D, and databases Education Teaching resources and on-line tutorialsHow to reach us
What does NCBI do?
Established in 1988 as a national resource for molecular biology information, NCBI creates public databases, conducts research in computational biology, develops software tools for analyzing genome data, and disseminates biomedical information - all for the better understanding of molecular processes affecting human health and disease. More...
National Center for Biotechnology Information U.S. National Library of Medicine
8600 Rockville Pike, Bethesda, MD 20894 Copyright, Disclaimer, Privacy, Accessibility
Hot Spots
Assembly Archive
Clusters of
orthologous groups
Coffee Break, Genes & Disease, NCBI Handbook
Electronic PCR
Entrez Home
Entrez Tools
Gene expression omnibus (GEO)
Human genome resources
Influenza Virus Resource
Map Viewer
dbMHC
Mouse genome resources
My NCBI
ORF finder
Rat genome resources
Centro Nacional de Información de Biotecnología, USAhttp//www.ncbi.nlm.nih.gov
DNA RECOMBINANTE
» Base de datos de secuencias de DNA y proteínas.GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)EMBL (http://www.ebi.ac.uk/ebi_docs/embl_db/ebi/topembl.html)PIR (http://www-nbrf.georgetown.edu/)SWISS-PROT (http://www.ebi.ac.uk/swissprot/)
» Base de datos de estructuras de 3D y análisis de estructuras 3D.PDBSUM (http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/)SCOP (http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/)CATH (http://www.cathdb.info/latest/index.html)DALI (http://www.ebi.ac.uk/dali/)SWISS-MODEL (http://swift.cmbi.kun.nl/swift/servers/moddssp-ubmit.html)
» Otras bases de datos de interés en ingeniería de proteínas.PMD (http://pmd.ddbj.nig.ac.jp/)Brenda (http://www.brenda.uni-koeln.de/)
DNA RECOMBINANTE
DNA RECOMBINANTEBase de datos de Enzimas
DISEÑOY PREDICCIÓN
2
DNARECOMBINANTE
3
PURIFICACIÓN4
FUNCIÓNCONFORMACIÓN
5
ANÁLISISESTRUCTURAL
1
INGENIERÍA DE PROTEÍNAS POR DISEÑO RACIONAL
Grado de purificación Aplicación
DNA recombinante:
- Sobreexpresión del gen- Introducción ligandos
PURIFICACIÓN
DISEÑOY PREDICCIÓN
2
DNARECOMBINANTE
3
PURIFICACIÓN4
FUNCIÓNCONFORMACIÓN
5
ANÁLISISESTRUCTURAL
1
INGENIERÍA DE PROTEÍNAS POR DISEÑO RACIONAL
FUNCIÓN Y CONFORMACIÓN
EFECTOS DE LA MODIFICACIÓN
FUNCIÓNACTIVIDAD
NATIVA
MUTANTE
FUNCIÓN Y CONFORMACIÓNTERMOESTABILIDAD CONFORMACIONAL
Temperatura (ºC)
ΔGFr
acci
ón d
esna
tura
lizad
a (%
)
ProteinaNatural
ProteínaMutada 1
Proteínamutada 2
ΔΤm
ΔΤm
A280
λ m
ax (
nm )
330
332
334
336
338
340
342
Inte
nsid
ad F
luor
esce
ncia
( %
)
0
20
40
60
80
100
(
)
( )
λ emision ( nm )
300 350 400
Inte
nsid
ad d
e Fl
uore
scen
cia
Imax, λ max A B
40 50 60Temperatura (ºC)
Espectroscopía de Fluorescencia. Espectroscopía de Fluorescencia.
FUNCIÓN Y CONFORMACIÓNTERMOESTABILIDAD CONFORMACIONAL
Dicroísmo Circular. Dicroísmo Circular.
MioglobinaM1M2M3
M1M2M3
Δε28
0 [M
-1cm
-1]
Temperatura (ºC)
FUNCIÓN Y CONFORMACIÓNTERMOESTABILIDAD CONFORMACIONAL
Calorimetría Diferencial de barrido Calorimetría Diferencial de barrido
FUNCIÓN Y CONFORMACIÓN
Temperature (ºC)
30 40 50 60 70 80 90 100-30
-20
-10
0
Exo
Cp
(kJº
C-1
mol
-1)
TERMOESTABILIDAD CONFORMACIONAL
DISEÑO RACIONAL
TERMOESTABILIZACIÓN
ENZIMÁTICA
Introducción depuentes disulfuro
Estabilización de la hélice alfa
Lisozima Proteína de Drosophila
1. Conocimiento de estructura, función y el gen
Nicholson, H., Tronrud, D.E., Becktel, W.J., Matthews, B.W. Analysis of the effectiveness of prolinesubstitutions and glycine replacements in increasing the stability of phage T4 lysozyme. Biopolymersv32 pp.1431-1441 , 1992
DISEÑO RACIONAL: EJEMPLO 1
Lisozima del fago T4 (164 aa)
1L56.pdb
164 aa
+
Difracción de rayos X
1,8Å
Termoestabilidad: Introducción de puentes disulfuroLisozima del fago T4
4 puentes disulfuro naturales
DISEÑO RACIONAL: EJEMPLO 1
Lisozima del fago T44 puentes disulfuro naturales
Ile3 - Cys97
Cys3 - Cys97
2. Modelado Proteico
3. Mutagénesis Dirigida
pAGAATTATGAATTGTTTTGAAATGTTACys
Oligonucleótido sintético (Ile:TAT)
Termoestabilidad: Introducción de puentes disulfuro
DISEÑO RACIONAL: EJEMPLO 1
Nicholson, H., Tronrud, D.E., Becktel, W.J., Matthews, B.W. 1992. Analysis of the effectiveness of proline substitutions and glycine replacements in increasing the stability of phage T4 lysozyme. Biopolymers, 32, 1431-1441.
Lisozima del fago T4
5. TermoestabilidadSustrato: Pared celular de M. Luteus (A540)Actividad Especifica :U/mg enzima
NATIVA = MUTANTE
Termoestabilidad conformacional
T e m p e r a tu r a ( o C )
3 0 3 5 4 0 4 5 5 0 5 5 6 0 6 50 .4 9
0 .5 0
0 .5 1
0 .5 2
0 .5 3
0 .5 4
0 .5 5
0 .5 6
Δε28
0 [M
-1cm
-1]
Desactivación termica: t1/2Nativa: 11min < Mutante: 28 min
Dicroismo circular
1.270MUTANTE065NATIVA
ΔΔG(kcaL mol-1)
Tm
(ºC)
Dicroismo Circular
Termoestabilidad: Introducción de puentes disulfuro
DISEÑO RACIONAL: EJEMPLO 1
Nicholson, H., Tronrud, D.E., Becktel, W.J., Matthews, B.W. 1992. Analysis of the effectiveness of proline substitutions and glycine replacements in increasing the stability of phage T4 lysozyme. Biopolymers, 32, 1431-1441.
4 puentes disulfuro naturales7-97
9-164Ile-Leu21-142Thr-Thr
Lisozima del fago T4
ILE 7 – Cys 97
Cys 7- Cys 97
Mutagénesisdirigida
+23+16+15+12+7+5Oxidante
-8-5-10-3-6-2Reductor
3-97, 9-164 y 21-142
9-164 y 21-1427-97 y 9-16421-1429-1647-97Ambiente
Pares de residuos mutados
Determinación de la temperatura de fusión (DSC) Tm (ºC)
Termoestabilidad: Introducción de puentes disulfuro
Matthews, B.W., Nicholson, H. and Becktel, W.J. 1987. Enhanced Protein Thermostability from Site-Directed Mutations that Decrease the Entropy of Unfolding. Biochemistry, 84, 6663-6667.
DISEÑO RACIONAL: EJEMPLO 1
Amino terminal
Carboxilo terminal
N-terminal
His, Lys y Arg
Ser, Thr, Asn o Asp.
C-terminal
Asp y Glu
Termoestabilidad:Estabilización de la hélice α
DISEÑO RACIONAL: EJEMPLO 2
Dominio Proteína de Drosophila: Modelo Todo α
A
B
C
Marsall et. al., 2002
DISEÑO RACIONAL: EJEMPLO 2
Cadena ASer 5 ⇒ Glu 5Leu 8 ⇒ Lys 8
Cadena BThr 22 ⇒ Glu 22Gln 28 ⇒ Asp 28
Cadena CAsn 36 ⇒ Arg 36Ile 42 ⇒ Arg 42
Termoestabilidad: Estabilización de la hélice α
DISEÑO RACIONAL: EJEMPLO 2Termoestabilidad: Estabilización de la hélice αDominio Modelo Todo α Nativa Mutantes
AA
B
C
B
C
Marsall et. al., 2002Marsall et. al., 2002
Dominio Modelo Todo α Nativa Mutantes
AA
B
C
B
C
Marsall et. al., 2002
DISEÑO RACIONAL: EJEMPLO 2Termoestabilidad: Estabilización de la hélice α
Desnaturalización termal (DC)
Proteína Tm (ºC)Natural 49M1 53M2 72M3 50M4 53M5 68M6 88
Temperatura
Frac
ción
des
natu
raliz
ada
Termoestabilidad: Estabilización de la hélice α
Marshall, S. A., Morgan, Ch. S. y Mayo, S. 2002. Electrostatics significantly affect the stability of designed homeodomainvariants. J. Mol. Biol. 316 (1), 189-199.
DISEÑO RACIONAL: EJEMPLO 2
- His, Lys y Arg, (N-terminal) Ser, Thr, Asn y Asp.
- Exclusión de Asp y Glu (C-terminal)
- Fuerzas electrostáticas de atracción o repulsión entre residuos con grupos cargados que estén adyacentes (varios residuos de Glu o Lys)
- Volumen estérico de los grupos adyacentes de los residuos de Asn, Thr, Ser y Leu
- Presencia de residuos de Pro
RestriccionesDiseño Racional: Estabilización de la hélice α
DISEÑO RACIONAL
Rediseño de Proteínas
I. Diseño Racional por Mutagénesis dirigida
II. Evolución Molecular dirigida
ESTRATEGIAS PARA LLEVAR A CABO UNA MODIFICACIÓN ENZIMÁTICA POR INGENIERÍA PROTEICA
INGENIERÍA DE PROTEÍNAS POR EVOLUCIÓN MOLECULAR DIRIGIDA
SELECCIÓN2
DNA RECOMBINANTE
1
ANÁLISISESTRUCTURAL
EVOLUCIÓN MOLECULAR DIRIGIDA
1a Generación
2ª Generación 3ª Generación
4ª Generación
Evolución Natural Millones de años
Evolución Dirigida Semanas o mesesESCALA TEMPORAL
Generación : MUTACIÓN - SELECCIÓN
SELECCIÓN
EVOLUCIÓN MOLECULAR DIRIGIDA
SELECCIÓN2
DNA RECOMBINANTE
1
INGENIERÍA DE PROTEÍNAS POR EVOLUCIÓN MOLECULAR DIRIGIDA
ANÁLISISESTRUCTURAL
A. ERROR POR PCR o PCR MUTAGÉNICA (Lio and Wise, 1990)
Generación de librerías de mutantes al azar
DNA RECOMBINANTE
denaturation
denaturation
extension
Generación de librerías de mutantes al azar
A. ERROR POR PCR o PCR MUTAGÉNICA (Lio and Wise, 1990)
DNA RECOMBINANTE
Tasa
de
mut
ació
n (%
)
Generación de librerías de mutantes al azar
DNA RECOMBINANTE
B. “DNA BARAJADO” (Stemmer, 1994)
PCRSin cebadores
DesnaturalizaciónHibridación
Producto del“barajado”
Elongación
DNasa
Recombinación aleatoria in vitro
DNA RECOMBINANTE
Error por PCR DNA barajado
Genes
Librería de genes mutados
Librería de proteínas mutadas
Nuevos genes con modificaciones
deseadas
Transformación
Selección
Repetición(opcional)
EVOLUCIÓN DIRIGIDA
Proteínas quiméricas
INGENIERÍA DE PROTEÍNAS POR EVOLUCIÓN MOLECULAR DIRIGIDA
SELECCIÓN2
DNARECOMBINANTE
1
ANÁLISISESTRUCTURAL
SELECCIÓN DE LOS MEJORES VARIANTES
Métodos de Selección ~ “Éxito de la evolución”● EficacesiSensiblesiPrecisosiRápidos: Alta capacidad de procesamientoiRevelar la propiedad buscada
Métodos colorimétricos Robotización
Selección de las enzimas termoestables
6 generaciones de mutagénesis al azar
Recombinación
66.56sF9
656H7
5H3
5H1
5E12
5D464.5
5H8
644G4
623H5
58.22A12
57.31A5D1
52.5Nativa
Tm(ºC)ENZIMAS
Esterasa
ii
i i
i
i
ii
i
ii
i
i
i
Sustrato
Giver, L., Gershenson, A., Freskgard, P.O. y Arnold, F. 1998. Directed evolution of thermostableesterase. Biochem. 95, 12809-12813.
ProductoA405
30º y 50ºC
Selección de las enzimas termoestables
Librería de genesMutantes
Thermus thermofilus Leu-
Librería de mutantes Leu+ ENZIMAS
MUTANTES
↑Tª
Tamakoshi M., Nakano, Y., Kakizawa S., Yamagishi, A. y Oshima, T. 2004. Extremophiles, 5(1), 17-22.
Sistema de Selección
5 generaciones de mutagénesis
aleatoria
Selección:
INGENIERÍA DE PROTEÍNAS POR EVOLUCIÓN MOLECULAR DIRIGIDA
SELECCIÓN2
DNARECOMBINANTE
1
ANÁLISISESTRUCTURAL
CARACTERIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS MUTADAS
EVOLUCIÓN MOLECULAR DIRIGIDA
Mutante de lipasa de Rhizopus arrhizus
NATIVA MUTANTE
Glu190 Val190
Niu. W-N, Li Z-P, Zhang D-W, Ming-Rui Yu M-R y Tan T-W. 2006. Improved thermostability and the optimum temperature of Rhizopus arrhizus lipase by directed evolution. J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 43 (1), 33-39.
INGENIERÍA DE PROTEÍNAS POR DISEÑO SEMI-RACIONAL
DNARECOMBINANTE
PURIFICACIÓNFUNCIÓNCONFORMACIÓN
ANÁLISISESTRUCTURAL
Mutaciones al azar
INVESTIGACIÓN BÁSICA
APLICACIONES DE LA INGENIERÍA DE PROTEÍNAS Y PERSPECTIVAS FUTURAS
BIOCATÁLISIS
► Estructura - función de las proteínas► Proceso de Plegamiento Proteico► Flexibilidad conformacional Nuevos fármacos► Diseño de enzimas nuevas y/o quiméricas.
INVESTIGACIÓN BÁSICA:
BIOINFORMÁTICA
BIOLOGÍA DE SISTEMAS
APLICACIONES DE LA INGENIERÍA DE PROTEÍNAS Y PERSPECTIVAS FUTURAS
APLICACIONES DE LA INGENIERÍA DE PROTEÍNAS Y PERSPECTIVAS FUTURAS
BIOCATÁLISIS
Proteínas Naturales
Proteínas Recombinantes
► BiomedicinaNuevos Fármacos
► Industria Química-Farmacéutica.TermoestablesEspecificidad, Regioespecificidad
Proteínas Recombinantes
Modificadas
Propiedades únicas
EJEMPLOS DE ENZIMAS MODIFICADAS POR INGENIERÍA DE PROTEÍNAS
OBJETIVO ENZIMA RESULTADO MÉTODO Referencia
Enantio-selectividad
Hidrolasa de epóxido
↑ 13 Error por PCR + DNA
barajado
Van Loo et al., 2004
Actividad Anhidrasacarbónica
↑ 40 Mutagénesis+Recombina
ción
Gould andTawfik, 2005
Eficacia catalítica
N-acetiltransferasa
↑10.000 DNA barajado
Castle et al.,2004
Temoestabilidad Xilanasa Tm ↑ 35ºC Mutagénesisdirigida
Palackal et al., 2004
Estabilidad en medio orgánico
Subtilisina E ↑ 170
(60% DMF)
Error por PCR
Chen andArnold,
1993
Regio-especificidad
Galactoxidasa Oxida Glucosa en posición 6
Mutagénesisaleatoria
Sun et.al.,2002
Dependencia cofactor
Lactato deshidrogenasa
NAD→NADP Mutagénesis(PCR)
Flores andEllinngton,
2005
Nombrecomercial Tipo de enzima Principal
aplicaciónAquazym® Ultra Alpha-amilasa Industria textilCarezyme® Celulasa Industria detergentesCellusoft® Celulasa Industria textilClear-Lens® LIPO Lipase Limpieza personalDuramyl® Alpha-amilasa Industria detergentesEndolase® Celulasa Industria detergentesEverlase® Proteasa Industria detergentesLipolase® Lipasa Industria detergentesNovozym® 735 Lipasa Industria textilOvozyme® Subtilisina (proteasa) Industria detergentesSavinase® Proteasa Industria detergentesTermamyl® Alpha-amilasa Industria detergentesThermozyme® Alpha-amilasa Industria textil
ENZIMAS COMERCIALES MODIFICADAS POR INGENIERÍA DE PROTEÍNAS
Gracias por su atención.
PRÁCTICAS
1.Modificación de la Lisozima de pollo
2. Rediseño del núcleo del represor ARC
3. Comparación de la isopropil-malatodeshidrogenasa mesófila y termófila
DISEÑO RACIONAL DE PROTEINAS
TERMOESTABLES
Por elemento
Aminoácidos
Por cadena, por estructura secundaria
RASMOLCOLOR
MOVIMIENTO : Rotar, transladar ampliar reducir, cortar, etcFORMA: varillas, bolas, cintas, etc
PRÁCTICAS
Yamada et al., 1993. J.Biol. Chem., 268, 10588-10592
MÁS ESTABLE(4,O kcal/molL)
1. Modificación de la Lisozima de polloPRÁCTICAS
Met Lys
Waldburger et al., 1995. Nature Struct. Biol., 2, 122-128.
2. Rediseño del núcleo del represor ARC
PRÁCTICAS
Kirino et al., 1994. Eu. J. Biochem., 220, 275-281Numata et al., 1995. Protein Eng., 8, 39-43
3. Comparación de la isopropil-malato deshidrogenasa mesófila (Escherichia coli) y termófila (Thermus termophillus)
PRÁCTICAS