Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia
Técnicas de Imunologia
Citometria de FluxoCitometria de Fluxo
Slides adaptados de uma colecção amavelmente cedida por Alexandre Salvador (BioAtlântico)
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O que é um Citometro de Fluxo?O que é um Citometro de Fluxo?
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O que é um Citómetro de Fluxo?O que é um Citómetro de Fluxo?
É um aparelho que permite analisar vários É um aparelho que permite analisar vários
parâmetros (celulares?)parâmetros (celulares?)
Capta e digitaliza a dispersão de fotões, provocada Capta e digitaliza a dispersão de fotões, provocada
pela passagem de partículas em suspensão pela passagem de partículas em suspensão
alinhadas uma a uma, num fluxo laminar, frente a alinhadas uma a uma, num fluxo laminar, frente a
um feixe de luz.um feixe de luz.
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Componentes Básicos de um Citómetro de Fluxo
• Suspensão de partículasSuspensão de partículas• Fluxo laminarFluxo laminarFluídosFluídosFluídosFluídos
ÓpticaÓpticaÓpticaÓptica
ElectrónicaElectrónicaElectrónicaElectrónica• Conversão do sinal em valores analógico-digitaisConversão do sinal em valores analógico-digitais• Aquisição, Processamento, Análise e Aquisição, Processamento, Análise e
Armazenamento por computadorArmazenamento por computador
• Fonte de iluminação Fonte de iluminação • Captação da dispersão da luz e da fluorescênciaCaptação da dispersão da luz e da fluorescência• Filtração da dispersão e da fluorescênciaFiltração da dispersão e da fluorescência
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Exemplos do que podemos Exemplos do que podemos analisar por Citometria de Fluxo:analisar por Citometria de Fluxo:
MetabolismosMetabolismos
ReceptoresReceptores ADNADN CitoquinasCitoquinas
EnzimasEnzimas
Antigénios celularesAntigénios celularesTamanhoTamanho
ComplexidadeComplexidade
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Propriedades de FSC e SSCPropriedades de FSC e SSC
LaserLaser
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Óptica - Canal de Dispersão Óptica - Canal de Dispersão Frontal ( tamanho- FS )Frontal ( tamanho- FS )
Sensor de FSSensor de FS
LaserLaser
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Óptica - Canal de Dispersão Óptica - Canal de Dispersão Lateral ( complexidade- SS )Lateral ( complexidade- SS )
LaserLaser
Sensor de FSSensor de FS
Sensor SS 90Sensor SS 9000
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Óptica - Dispersão da Óptica - Dispersão da FluorescênciaFluorescência
LaserLaser
Sensor de FSSensor de FS
Detectores de FluorescênciaDetectores de Fluorescência(PMT1, PMT4 etc.)(PMT1, PMT4 etc.)
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Óptica - Propriedade dos FiltrosÓptica - Propriedade dos Filtros
Filtro ou Espelho Dicróico Colocado a Filtro ou Espelho Dicróico Colocado a 4545oo
Luz Luz ReflectidaReflectida
Luz TransmitidaLuz TransmitidaFonte de LuzFonte de Luz
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BDBD
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Low Sample Pressure12µl/min
LaminarFlow
Sheath SheathSample
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O que pode então dizer um O que pode então dizer um Citometro de fluxo de uma célula?Citometro de fluxo de uma célula?
Tamanho (FSC)Tamanho (FSC)
Complexidade (SSC)Complexidade (SSC)
Fluorescência relativa.Fluorescência relativa.
(FL1, FL2, FL3, FL4,...)(FL1, FL2, FL3, FL4,...)
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O que é a Fluorescência?
LaserLaser
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Intensidade de Fluorescência
Emitted Fluorescence Intensity Binding Sites
FITC FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
Intensidade de Fluorescência
Num
ero
de e
vent
os
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Currently Available Fluorochromes (Visible Light Emission)
Fluorochrome Laser (nm) Emission (nm)
FITC 488 525 Cy3 488 565 R-PE (PE) 488 575 PE-Texas Red (PE-TR) 488 615 Pe-Cy5 (TC1) 488 667 PerCP (BD2) 488 675 PerCP/Cy5.5 (BD) 488 695 PE-Cy7 488 767
Texas Red 595 615
APC 633, 635 660 Cy5 633, 635 667 APC-Cy7 633, 635 767
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Espectros de Emissão
PerCP
Wavelength (nm)
400 450 500 550 600 650 700
1000
800
600
400
200
0
RPE APCFITC PI
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Pulso electrónico
LaserLaser
LaserLaser
LaserLaser
TimeTime
Volt
age
Volt
age
TimeTime
Volt
age
Volt
age
TimeTime
Volt
age
Volt
age
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Tipos de diagramas
1 parâmetro1 parâmetro HistogramaHistograma
2 parâmetros2 parâmetros Dot PlotDot Plot Contour plotContour plot Density plotDensity plot
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Dot plot Histograma
As Regiões ou Portas electrónicas
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TRANSFERENCIA DE ENERGIA POR RESSONÂNCIA
Ener
gía
Ener
gía
Fluo
resc
encia
Fluo
resc
encia
Molécula ReceptoraTexas Red/Cy5/Cy7Molécula ReceptoraTexas Red/Cy5/Cy7
Molécula DonadoraPE
Molécula DonadoraPE
GSGS
ESES
Transferencia no radiativa de energíaTransferencia no radiativa de energía
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1 LASER (488nm) 3 COLORES
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1 LASER (488nm) 4 COLORES
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1 LASER (488nm) 5 COLORES
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Cytomics™ FC500
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Cytomics™ FC500OPTICA:
2 lasers colineares:2 lasers colineares: 488 nm488 nm 633 nm633 nm
Detectores:Detectores: FS con dos ángulos de FS con dos ángulos de
captura captura (1-8°, 1-19°)(1-8°, 1-19°) Side ScatterSide Scatter 5 PMT sensibles al rojo 5 PMT sensibles al rojo
(de 185 a 900 nm)(de 185 a 900 nm)
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Cytomics™ FC500OPTICA:
488DLP
500LP
600DLP
550D
LP
525BP
620DSP620S
P
710DLP
755LP
675BP
FL1
FL
2
FL
5FL4
FL3
Detailed Filter Specs
Side Scatter
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COMPENSATION
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500 600 700 800
Wavelength nm
Intensity
FITCFITCFITCFITC PEPE ECDECD PC5PC5
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500 600 700 800
Intensity
FITCFITCFITCFITC PEPE ECDECD PC5PC5
FL1525
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500 600 700 800
Intensity
FITCFITCFITCFITC PEPE ECDECD PC5PC5
FL1525
FL2575
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500 600 700 800
Intensity
FITCFITCFITCFITC PEPE ECDECD PC5PC5
FL1525
FL2575
FL3620
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500 600 700 800
Intensity
FITCFITCFITCFITC PEPE ECDECD PC5PC5
FL1525
FL2575
FL3620
FL4675
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12
<0.1
1
Nominal Measured
SignalFL1
FL2
FL3
FL4
FITCFITCFITCFITC
500 600 700
100
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FITCFITCFITCFITC PEPE ECDECD PC5PC5
FITC+FITC+FITC+FITC+
PE+PE+
ECD+ECD+
PC5+PC5+
FL1
FL2
FL3
FL4
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FL1
FL2
FL3
FL4
FITCFITCFITCFITC PEPE ECDECD PC5PC5
????????????????
????????
????????
????????
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FL1
FL2
FL3
FL4
FITCFITCFITCFITC PEPE ECDECD PC5PC5
85.5%
10.5%
3.1%
0.9%
0.7%
67.8%
25.0%
6.5%
0.3%
8.4%
66.7%
24.6%
0.2%
4.2%
2.3%
93.3%
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FL1
FL2
FL3
FL4
FITCFITCFITCFITC PEPE ECDECD PC5PC5
100% 1.1% 0.4% 0.2%
12.3% 100% 12.7% 4.5%
3.6% 36.8% 100% 2.4%
1.0% 9.5% 36.9% 100%
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Uncompensated vs Compensated
FL1
FL
2
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FL1
FL
2COMPENSATION IS INTENSITY
DEPENDENT
uncompensated partially compensated
fully compensated
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COMPENSATE INSTRUMENT USING STAINED CELLS
1. Adjust PMT voltages using unstained cells
2. Adjust compensation for each fluorochrome