Synthetische Biologie und Nanosysteme* ausgewählte Beispiele *
Vorlesungsreihe "Biophysik der Systeme"2008-02-06
Ausrichtung der Forschung
SequenzierungstechnikDNA-/Gensynthese
Mikrofluidik
Fortschritte in
VerständnisVerständnis AnwendungAnwendung
Reduktion der KomplexitätMinimale Zelle
Transkriptionsbasierte Schalter und Oszillatoren
de novo Design biologischer Systeme
induzierbare Reaktionchemischer/optischer Stimulus
selbstorganisierte StrukturenDNA/RNA als Template
gerichtete EvolutionProtein Engineering
Erweiterung des genetischen Codesnicht-natürliche Aminosäuren
logische biochemische Netzwerkemolekulare Biocomputer
Metabolic Pathway EngineeringSynthese/Abbau chemischer
Substanzen
DNA Maschinen
Ausrichtung der Forschung
SequenzierungstechnikDNA-/Gensynthese
Mikrofluidik
Fortschritte in
VerständnisVerständnis AnwendungAnwendung
Reduktion der KomplexitätMinimale Zelle
Transkriptionsbasierte Schalter und Oszillatoren
de novo Design biologischer Systeme
induzierbare Reaktionchemischer/optischer Stimulus
selbstorganisierte StrukturenDNA/RNA als Template
gerichtete EvolutionProtein Engineering
Erweiterung des genetischen Codesnicht-natürliche Aminosäuren
logische biochemische Netzwerkemolekulare Biocomputer
Metabolic Pathway EngineeringSynthese/Abbau chemischer
SubstanzenSeminar 12.12.07
DNA Maschinen
Beispiel 1:
Chemotaxis in E. coli
bestehender Signalweg, Sensitivität auf neuen Effektor
Umdesign Signalweg
Chemotaxis in E. coliTopp & Gallivan, JACS 129: 6807 (2007)
CheZ reguliert Dephosphorilierung von CheY:ermöglicht Rotation gegen UZS ◊ Mobilität
WT
CheZ
geradlinigeFortbewegung
Taumeln
Chemotaxis in E. coliTopp & Gallivan, JACS 129: 6807 (2007)
Riboswitches kontrollieren die Genexpression abhängig von Liganden
Chemotaxis in E. coliTopp & Gallivan, JACS 129: 6807 (2007)
CheZ kombiniert mit Riboswitch:◊ Mobilität abhängig von Ligandenkonzentration
Chemotaxis in E. coliTopp & Gallivan, JACS 129: 6807 (2007)
konzentrationsabhängige Mobilität◊ Migration entlang Gradienten zu höherer Konzentration ("Pseudotaxis")
Beispiel 2:
Lichtgesteuerte Expression in E. coli
bestehender Signalweg, Sensitivität auf neuen Effektor
Neudesign Rezeptor
Lichtgesteuerte Expression in E. coli
Phytochrom: Chimäre aus 2 Modulen- extrazellulärer Photorezeptor (Cph1 aus Cyano-Bakterium Synechocystis)- intrazellulärer Regulator (EnvZ aus E. coli, zuständig für osmotische Regulation)
Transformation in EnvZ E. colifür die Synthese von PCB in E. coli:ho1 und pcyA Gene aus Synechocystis
EnvZ
Cph1
on off
Levskaya et al., Nature 438: 441 (2005)
Lichtgesteuerte Expression in E. coli
SelektionChimäre Cph8 mit hohem hell-dunkel "Kontrast"
+EnvZ
Belichtungszeit: 4h bei 37°C
Levskaya et al., Nature 438: 441 (2005)
Lichtgesteuerte Expression in E. coli
◊ räumliche Kontrolle der Genexpression◊ Auflösung: 108 Bakterien (Pixel) pro square inch
Levskaya et al., Nature 438: 441 (2005)
Beispiel 3:
Gerichtete Evolution
bestehendes Protein
veränderte Funktionalität
Mutation Selektionsdruck
verbesserte VarianteAusgangsprotein
Gerichtete Evolution
Erzeugung der Bibliothek (107-1010)- Mutagenese einer Oligonukleotid-Kassette- fehleranfällige PCR
Umklonierung in Plasmid und Transformation z.B. in E. coliGenpool
Kopplung von Phenotyp und Genotyp- Affinität: Phage display oder Yeast cell display - Funktionalität: E. coli, in vitro Kompartimentisierung
Selektion und Screening- Affinität: über Antigen- Funktionalität: FACS (fluorescent activated cell sorting)
Antigen
Gerichtete Evolution
in vitro Kompartimentisierung:Wasser-in-Öl-(in-Wasser) Emulsionen
◊ kleine Reaktionsvolumina: hohe Konzentration, schnelle Kinetik
◊ 1010 pro ml: hoher Durchsatz
◊ Selektionsdruck frei wählbar
◊ kompatibel mit Mikrofluidik,FACS: 107 pro h
Mastrobattista et al., Chem. Biol. 12: 1291 (2005)
Gerichtete Evolution: Anwendungen
typischerweise 6-12 Runden
Biokatalysatoren
- veränderte Substratspezifität- veränderte/verbesserte Enantioselektivität- erhöhte Aktivität (50x) in unnatürlichem Reaktionsmilieu- erhöhte Thermostabilität (+15°C)
Antikörper
- Affinitätssteigerung 10-100x- Affinität für neues Antigen: 100-1000x schlechter als in der Natur
Erweiterung des genetischen Codes
Standard-Code
stellenspezifisch,cotranslational
anstatt dernatürlichen AS
Ribosomaler Einbau nicht-natürlicher AminosäurenWang et al., Annu. Rev. Biophys. Biolmol. Struct. 35: 225 (2006)
Anforderungen:- orthogonales tRNA-Codon Paar- orthogonale aminoacyl-tRNA-Synthetase- nnAS im Cytosol
Ribosomaler Einbau nicht-natürlicher AminosäurenWang et al., Annu. Rev. Biophys. Biolmol. Struct. 35: 225 (2006)
amber stop codon (UAG) supression- orthogonales tyrosyl-tRNA/tyrosyl-RS Paar aus Methanococcus janaschii- gerichtete Evolution der tRNA in E. coli mit negativ/positiv-Selektion- gerichtete Evolution der Substratspezifität der RS
Ribosomaler Einbau nicht-natürlicher AminosäurenWang et al., Annu. Rev. Biophys. Biolmol. Struct. 35: 225 (2006)
Fluorescein
?
Beispiel 5:
DNA Computing
Durchführung logischer oder kombinatorischer Rechenoperationen
mithilfe von DNA Sequenzen
DNA ComputingAdleman, Science 266: 1021 (1994)
Kombinatorisches ProblemHamiltonscher Pfad in Graph
Existiert ein Weg von 0 nach 6, der alle Knoten genau einmal durchläuft?
DNA ComputingAdleman, Science 266: 1021 (1994)
Kombinatorisches ProblemHamiltonscher Pfad in Graph
Algorithmus
1. Generation zufälliger Wege
2. Auswahl Pfade von 0 nach n
3. Auswahl Pfade mit n Knoten
4. Auswahl Pfade, die alle Knoten durchlaufen
5. "wahr" / "falsch"
DNA ComputingAdleman, Science 266: 1021 (1994)
Knoten und Kanten20mer DNA
Algorithmus
1. Ligation
2. PCR mit Primer O0 und O6
3. Agarose-Gel: Bande mit 140bp
4. Affinitätsselektion von ssDNA mit O1,…,O5
5. Probe: PCR mit O0 / O1, O0 / O2,…, O0 / O6
2
1
3
Logische biochemische NetzwerkeSeelig et al., Science 314: 1585 (2006)
boolsche Logik"0": niedrige Konzentration"1": hohe Konzentration
in out
AND
Logische biochemische NetzwerkeZhang et al., Science 318: 1121 (2007)
Signalverstärkung- kinetisch inhibiert (Zeitskala Experiment)- Katalysator (Input) beschleunigt Reaktion um 104
- Entropie-getrieben
DNA Maschinen
DNA-Läufer entlang DNA-Schiene
Unidirektionalität durch
Zerstörung der SchieneZugabe der Treibstoffsträngein definierter Reihenfolge
Restriktionsenzym
Passivierung der Schienedurch Treibstoffstränge
Treibstoff
Treibstoff
Abfall
Yin et al., Nature 451: 318 (2008)Bath & Turberfield, Nat. Nanotech. 2: 275 (2007)
Beispiel 7:
DNA/RNA Strukturen
Die Doppelhelix als spezialisierter Legobaustein
nm-Abmessungen, Sequenzspezifität,Persistenzlänge ~50nm
regelmäßige Strukturen: DNAFeldkamp & Niemeyer, Angew. Chem. Int. Ed. 45: 1856 (2006)
SchleifeninduzierenBiegung
regelmäßige Strukturen: RNAChworos et al., Science 306: 2068 (2004)
RNA-Doppelhairpin-Quadrant als Puzzleteil
Verschmelzen durch langsames Abkühlen
30°C, 30min 50°C ◊ 4°C, 16h
3-dimensionale Strukturen
Goodman et al., Science 310: 1661 (2005)Shih et al., Nature 427: 618 (2004)
Aldaye & Sleiman, JACS 129: 13376 (2007)
beliebige Strukturen in 2D: DNA-Origami
7 kb lange virale Einzelstrang DNA + viele kurze (30 b) Helferstränge◊ eindeutige Struktur
Rothemund, Nature 440: 297 (2006)
beliebige Strukturen in 2D: DNA-Origami
- hohe Flexibilität- hohe Ausbeute- kurze Abkühlzeit (75min)
Rothemund, Nature 440: 297 (2006)
beliebige Strukturen in 2D: DNA-Origami
Funktionalisierungenan Helfersträngen
Rothemund, Nature 440: 297 (2006)
zur RNA Detektion Probe
Ke et al., Science 319: 180 (2008)
zur Positionierung von - Quantendots- Goldpartikeln- Proteinen
weiterführende Infos
Synthetische Biologie Übersichtsartikel- Brenner & Sismour, Nat. Rev. Gen. 6: 533 (2005) - Drubin et al., Genes Dev. 21: 242 (2007)
Internationales SB Meetinghttp://www.syntheticbiology3.ethz.ch/index.htm
Wettbewerb iGEM 2006http://www.igem2006.com/
Ribosome EngineeringPeter Schultz Lab, http://schultz.scripps.edu/
Logische Biochemische NetzwerkeFritz Simmel Lab, TUMDieter Braun Lab, LMU
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