Spezialvorlesung 2004, Folie 1
Aktuelles aus der Forschung betr. Immunologie
Beda M. Stadler„Blut und Abwehr“
Spezialvorlesung 2004
Lernziele• Einblick in die Forschung• Vertiefung und Vernetzung Blockinhalt• Was für eine Dissertation soll ich machen?• Wie schreibt man ein Paper?• Soll ich Forscher werden?• Grundlagen vs angewandte Forschung?
Spezialvorlesung 2004, Folie 2
Pocken als Forschungsprojekt
• Beobachtung• Literatur• Fragestellung• Wahl der
Methoden• Finanzierung• Forschungsplan• Publikation• Umsetzung• Akkzeptanz
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Spezialvorlesung 2004, Folie 3
Forschungsprojekt: Dissertation
• Beobachtung• Literatur • Fragestellung• Wahl der Methoden• Finanzierung• Forschungsplan• Publikation• Umsetzung• Akkzeptanz
"Pure red-cell aplasia due to
anti-erythropoietin antibodies"
Spezialvorlesung 2004, Folie 4
FallbeschreibungEin 1915 geborener Patient wurde im April1998 wegen einer chronisch progredientenNiereninsuffizienz unserem nephrologischenAmbulatorium zugewiesen. Die Abklärungen(Normwerte in Klammern) ergaben eine chronischeNiereninsuffizienz bei beidseitigenSchrumpfnieren unklarer Ätiologie, eine normochrome,normozytäre hyporegeneratorischeAnämie: Hämoglobin 9,3 g/dl (12,3–15,8),Retikulozyten korrigiert 11‰ (5–18); einensekundären Hyperparathyreoidismus: intaktesParathormon 429 pg/ml (10–65) sowie eineleichte metabolische Azidose. Die Erythropoietinkonzentrationim Serum war mit 27,9 U/ml(40–400) bei einem Hämatokrit von 28%(41–53) erniedrigt. Die Kreatinin-Clearancebetrug 16 ml/min/1,73 m2 (70–120). Wegenweiterer Verschlechterung der Nierenfunktionwurde bei dem biologisch deutlich jüngerenPatienten im Juli 1998 eine chronische Hämodialysebehandlungeingeleitet.
Bereits im April 1998 wurde wegen der renalenAnämie bei einem Hämoglobinwert von 9,3g/dl (12,3–15,8) eine Behandlung mit Epoetinalpha (Eprex®) subkutan in einer Dosis von10000 U (138 U/kg Körpergewicht) wöchentlicheingeleitet. Wegen eines Eisenmangels –Transferrinsättigung 8,5% (20–40), Ferritin27,3 mg/l (10–330) – wurde gleichzeitig eineperorale Eisensubstitution begonnen. Unterdieser Therapie kam es innerhalb von 2 Monatenzu einem Anstieg des Hämoglobinwertesbis auf 13 g/dl. In den folgenden Monatenkonnte unter Reduktion der Epoetindosis derHämoglobinwert auf >11 g/dl eingestellt werden(Siehe nächste Folie).
Dr. Gérald Keusch, Stadtspital Waid, Zürich
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Klinischer VerlaufHämoglobin (g/dl)
Retikulozyten (%0)
EPO Dosis (U/kg Körpergewicht/Woche)
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Forschungsprojekt: Dissertation
• Beobachtung• Literatur • Fragestellung• Wahl der Methoden• Finanzierung• Forschungsplan• Publikation• Umsetzung• Akkzeptanz
Übersichtsartikel EPO? PRCA? Autoimmunität?
Originalarbeiten Methoden? In vitro/in vivo
Modelle?
Spezialvorlesung 2004, Folie 7
Literatur1. Schellekens H. Bioequivalence and the immunogenicity of biopharmaceuticals. Nat Rev Drug Discov2002; 1:457–4622. Bergrem H, Danielson BG, Eckardt K-U, Kurtz A, Stridsberg M. A case of antierythropoietin antibodies following
recombinant human erythropoietin treatment. In: Erythropoietin: Molecular Physiology and Clinical Application. Marcel Dekker, New York, NY,1993:266–275
3. Peces R, de la Torre M, Alcázar R, Urra JM. Antibodies against recombinant human erythropoietin in a patient with erythropoietin-resistant anemia. N Engl J Med1996; 335:523–524
4. Prabhakar SS, Muhlfelder T. Antibodies to recombinant human erythropoietin causing pure red cell aplasia. Clin Nephrol1997; 47:331–335
5. Casadevall N, Dupuy E, Molho-Sabatier P, Tobelem G, Varet B, Mayeux P. Autoantibodies against erythropoietin in a case with pure red-cell aplasia. N Engl J Med1996; 334:630–663
6. Casadevall N, Nataf J, Viron B et al. Pure red-cell aplasia and antierythropoietin antibodies in patients treated with recombinant erythropoietin. N Engl J Med2002; 346:469–475
7. Krantz SB. Pure red-cell aplasia. N Engl J Med1974; 291:345–3508. Casadevall N. Antibodies against rHuEPO: native and recombinant. Nephrol Dial Transplant2002; 17 [Suppl 5]:42–47 9. Weber G, Gross J, Kromminga A, Loew HH, Eckardt K-U. Allergic skin and systemic reactions in a patient with pure red
cell aplasia and anti-erythropoietin antibodies challenged with different epoetins. J Am Soc Nephrol2002; 13:2381–238310. Gershon SK, Luksenburg H, Cote TR, Braun MM. Pure red-cell aplasia and recombinant erythropoietin. N Engl J
Med2002; 346:1584–158611. Krüger A, Schröer W, Röhrs F, Vescio G. PRCA in a patient treated with epoetin beta. Nephrol Dial Transplant2003;
18:1033–103412. Storring PL, Tiplady RJ, Gaines Das RE et al. Epoetin alfa and beta differ in their erythropoietin isoform compositions and
biological properties. Br J Haematol1998; 100:79–8913. Skibeli V, Nissen-Lie G, Torjesen P. Sugar profiling proves that human serum erythropoietin differs from recombinant
human erythropoietin. Blood2001; 98:3626–363414. Cavill I, Williams JD. Benefits of recombinant human erythropoietin. Lancet2002; 360:1606–1607
15. etc...
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Haematopoiese
Erythropoietin (EPO)
EPOEPO
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Erythrozytenentwicklung
Erythroblast
Retikulozyt
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Sauerstoff, EPO und die Niere
Spezialvorlesung 2004, Folie 11
EPO Produktion
peritubuläresKapillarnetzwerk
Interstitielle Zellen des peritubulären Kapillar- netzwerks der Niere produzieren EPO
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Erythropoietin (EPO)
EPO ist ein Zytokin,wird rekombinant hergestellt
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Therapeutische Eiweisse
Spezialvorlesung 2004, Folie 14
Anaemie
• Häufig assoziert mitschweren Nierenschäden
• Symtome: Müdigkeit, Atemnot und verminderte Mobilität
• Der primäre Defekt ist ein EPO Mangel
• Konservative Behandlung mit Eisen und Folsäure • Blut Transfusionen bei schweren Anaemien
(Risiko: Eisen Überdosierung, Infekte und Allosensibilisierung)
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Pure Red Cell Aplasia (PRCA)
• PRCA– sehr selten – selektiver Defekt des
Konochenmarks in der Erythrozyten Produktion
• Schwere Anaemie, weisse Blutzellen und Plättchen normal
• Zwei Typen– congenital– erworben
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Infektionen
Thymoma
Haematologische Malignien
Solide Tumoren
Nierenversagen
Rheumatologische Krankheiten
Schwerer Ernährungsmangel
ABO-inkompatible Knochenmark Transplantation
Schwangerschaft
Idiopathisch
Medikamente (EPO?)
Gründe: erworbene PRCA
Antikörper
gemeinsamerNenner?
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Antikörper gegen Zytokine?
z.B. anti-InsulinAntikörper gegen
natürliches undrecombinantesInsulin
“anti-insulin” in 95 hits
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Antikörper & therap. Proteine1/100,000 1/10,000 1/1,000 1/100 1/10 1/11/1,000,000
2
4 5 1
3
6
7
8
9
10
1414
12
11
13
94 rHu-growth hormone rHu-erythropoietin scrHu-TPA 1414
61 Bovine insulin Salmon calcitonin 11 IFN alfa 2b
72 Porcine insulin 12GM-CSF IFN beta 1a, 1b
3 138rHu-insulin rHu-factor VIII IL-2
105 Gonadotropin-releasing hormone IFN alfa 2a
rHu=recombinant humanrHu=recombinant human
Spezialvorlesung 2004, Folie 19
Forschungsprojekt: Dissertation
• Beobachtung• Literatur • Fragestellung• Wahl der Methoden• Finanzierung• Forschungsplan• Publikation• Umsetzung• Akkzeptanz
Gibt es natürliche Antikörper gegen EPO?
Spezialvorlesung 2004, Folie 20
Was verursacht eine PRCA?
• Immunisierung?• Präexistierende natürliche
anti-EPO Autoantikörper?• existiert eine
Autoimmunkrankheit?• Induzieren Blutransfusionen
eine PRCA?• Moleculares Mimikry durch
Xenoantigene?
Spezialvorlesung 2004, Folie 21
Anti-EPO Antikörper
Zucker oder Eiweiss? Spezifität und pathophysiologische Rolle?
EPOEPO
Spezialvorlesung 2004, Folie 22
Physiologische Rolle
Spezialvorlesung 2004, Folie 23
Forschungsprojekt: Dissertation
• Beobachtung• Literatur • Fragestellung• Wahl der Methoden• Finanzierung• Forschungsplan• Publikation• Umsetzung• Akkzeptanz
Hypothese ablehnen Negative Kontrolle
Hypothese bestätigen Positive Kontrolle
Laborausrüstung Geräte Know How
Bewilligungen Tierversuche Einschlussverordnung
Spezialvorlesung 2004, Folie 24
Antikörper Nachweis
ELISAEnzyme Linked ImmunoSorbent Assay
Antigen (EPO)
Spez. Antikörper
Enzym markierterAntikörper Substrat
farblos
farbig
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Affinitätschromatographie
Antigen (EPO)Antigen (EPO)
Gel (Agarose)
AntiserumAntiserumSalz
SpezifischeSpezifischeAntikörperAntikörperSerumbestandteileSerumbestandteile
und ungebundene Antikörperund ungebundene Antikörper
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Neutralisierendes Epitop
Spezialvorlesung 2004, Folie 27
anti-EPO Antikörper
EPO abhängigeTF-1 Zellen mit EPO Rezeptor rhEPO
Negative Kontrolle
Positive Kontrolle
AntikörperTest
Neutralisierende Antikörper
Funktionelle Assays
Spezialvorlesung 2004, Folie 28
Forschungsprojekt: Dissertation
• Beobachtung• Literatur • Fragestellung• Wahl der Methoden• Finanzierung• Forschungsplan• Publikation• Umsetzung• Akkzeptanz
Ethik Wissensch. Freiheit Staatl. Förderung
SNF CTI/KTI Inst. Budget
Private Förderung Stiftungen Industrie
Spezialvorlesung 2004, Folie 29
Wer bezahlt die Forschung?
Spezialvorlesung 2004, Folie 30
Forschungsprojekt: Dissertation
• Beobachtung• Literatur • Fragestellung• Wahl der
Methoden• Finanzierung• Forschungsplan• Publikation• Umsetzung• Akkzeptanz
Methoden Etablierung
Pilotexperimente Resultate go/no go Entscheide
Spezialvorlesung 2004, Folie 31
Anti-EPO in normalen Seren
Blut Spender
Normal(n=17)
SLE(n=22)
Rheumatic (n=50)
Allergic (n=21)
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7A
nti-E
PO A
ntik
örpe
r (EL
ISA
)
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IVIG
330ml (11.2 g)Elution (pH=2.75)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18Fraction No.
OD
280
EPO-Säule
EPO Affinitätssäule
1.125 mg
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Gereinigte anti-EPO Antikörper
Effluent der rhEPO-Säule
Eluate der rhEPO- Säule
0
0.5
1
1.5
0.1 1 10 100 1000
Antikörper Konzentration mg/ml
OD
450Fractionen Test
im EPO ELISA
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Neutralisierende anti-EPO
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
neg. Contr. pos. Contr. neutral.anti-EPO
normalerAntikörper
EPO 0.1U/mlGM-CSF 0.1ng/ml
100% Hemmung
Zellp
rolif
erat
ion
OD
562-
650
Spezialvorlesung 2004, Folie 35
Forschungsprojekt: Dissertation
• Beobachtung• Literatur • Fragestellung• Wahl der Methoden• Finanzierung• Forschungsplan• Publikation• Umsetzung• Akkzeptanz
Wie schreibt manein Paper?
Top Journals Vorträge Reviews
Spezialvorlesung 2004, Folie 36
Wie schreibt man ein Paper
Schreiben Publizieren• Resultate• Diskussion• Einführung• Zusammenfassung• Referenzen• Fussnoten• Titel
• Titel• Zusammenfassung• Einführung• Resultate• Diskussion• Referenzen• Fussnoten
Spezialvorlesung 2004, Folie 37
Forschungsprojekt: Dissertation
• Beobachtung• Literatur • Fragestellung• Wahl der Methoden• Finanzierung• Forschungsplan• Publikation• Umsetzung• Akkzeptanz
Patent? Produkt? Businessplan? Finanzierung? Kommunikation Marketing
Spezialvorlesung 2004, Folie 38
Innovationsprozess
Grundlagenforschung
Angewandte Forschung F&E
Wissens-Valorisierung
Mar
ktId
eeScience to Market
Spezialvorlesung 2004, Folie 39
“The valley of Death”
(t)0- 3- 10 + 3
Grundlagen-forschung
(CHF)
? Markt
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Zusammenfassung
• Beobachtung• Literatur • Fragestellung• Wahl der
Methoden• Finanzierung• Forschungsplan• Publikation• Umsetzung• Akkzeptanz
Wer vertritt die Wissenschaft?
Raus aus dem Elfenbeinturm
Proaktive Kommunikation
Spezialvorlesung 2004, Folie 41
Proaktive Kommunikation
Fragen?