RNAinterference (RNAi)
Gerard Sellarés MartínezMódulo 6 – Genómica y Proteómica
Antecedentes
1990 R. Jorgensen“Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase gene into petunia results in reversible co-supression of homologous genes in trans.” Plant Cell
1990 R. Jorgensen 1998 Andrew Fire & Craig Mello
1995 Guo S, Kemphues KJ. ”par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed” .Cell
1995 Guo S& Kemphues KJ
1998 Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Nature. 1998
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IntroducciónLa ribointerferencia o interferencia del RNA es un mecanismo de silenciamiento post-transcripcional de genes específicos, ejercido por moléculas de RNA que, siendo complementarias a un RNA mensajero (mRNA), conducen habitualmente a la degradación de éste (Fire and Mello,1998)
dsRNA
siRNA (19-23 pb)shRNA
miRNA
Chemistry & Biology 19, January 27, 2012
Componentes del mecanismo RNAi
Nature reviews, February 11, 2012
Mecanismos de silenciamiento
Amplificación de la señal
En plantas, hongos y C. elegans
Se generan nuevas moléculas de siRNA (secundarias), específicas para diferentes secuencias del mismo mRNA, generando un efecto de amplificación
Resistencia las infecciones virales
Mecanismos de silenciamiento
Ensamblaje de heterocromatina mediante RNAi en S. pombe
Nature 457, 413-420(22 January 2009)
Estas secuencias repetitivas y los cenRNAs atraen enzimas como la Histona Metil-Transferasa (HTMasas, de las siglas en inglés) tipo H3K9 (metilan la lisina9 de la histona H3), proteínas HP1 y otros complejos que median la formación de heterocromatina.
Utilización en el laboratorio
Se sintetiza dsRNA (o siRNAs/shRNAs en mamíferos) con una secuencia complementaria a la del gen de interés y se introduce en una célula u organismo, donde se reconoce como material genético extraño, lo que activa la ruta del RNAi.
Silenciamiento de genes (“Knockdown")
Utilización en el laboratorio
Obtención de una línea de ratones transgénicos para RNAi
Aplicaciones
Genómica funcional Medicina
Biotegnología
Terapias antivirales (Expresión génica viral en células cancerosas, HIV, Hepatitis A y B, etc)
Terapias en enfermedades neurodegenerativas (Enfermedad de Hungtington).
Terapia contra el Cáncer
Diseño de plantas alimenticias
Aprovecha el fenotipo estable y heredable del RNAi en plantas
C. Elegans y Drosophila como animales modelo (también Plantas).
Mapeo y construcción de librerías genómicas de RNAi
VentajasFácil de utilizar
Rapidez en la obtención (algunos días)
Viable en cualquier tipo celular
Válido en experimentos in vivo e in vitro
La eficacia del sistema de interferencia radica en que RISC
cataliza múltiples ciclos de interferencia in vivo
Disminuye tiempo, “coste” y aumenta la especificidad
Inconvenientes
Off-target (OTEs) Reducción no intencionada de la expresión
Limitaciones en el uso in vivo
Sensible a las nucleasas presentes en el plasma
Administración (Deben estar protegidos)
Vida media corta
Rápida eliminación
Estabilidad
Para hacer el knockdown se necesitan dosis muy elevadas. OTE son dosis dependientes
Generación de respuesta inmune (respuesta vía INF, secuencias CpG, etc)
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