Proteinchemie an Oberflächen -
von der spezifischen Interaktion
zur Proteinresistenz
Dissertation zur Erlangung des Grades eines
Doktor der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
der Fakultät für Chemie Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Dipl.-Biochem. Rolf Chelmowski
Lehrstuhl für Physikalische Chemie I Bochum 2008
Der Zweifel ist der Beginn der Wissenschaft.
Wer nichts anzweifelt, prüft nichts.
Wer nichts prüft, entdeckt nichts.
Wer nichts entdeckt, ist blind und bleibt blind.
Teilhard de Chardin (1881-1955),
frz. Theologe, Paläontologe u. Philosoph
. .
I
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 7
1.1 Einführung in die Protein-Oberflächen Wechselwirkung 7 1.2 Zielsetzung 8 2 Theoretische Grundlagen 10
2.1 Mechanismen der Proteinadsorption auf Festkörperoberflächen 10 2.2 Triebkräfte der Adsorption von Proteinen an Festkörperoberflächen 11 2.2.1 „Schwache“ Wechselwirkungen 11 2.2.2 Ionische Wechselwirkungen 11 2.2.3 Hydrophobe Wechselwirkungen 11 2.2.4 Konformationsentropie 12 2.2.5 Gesamtbild des Mechanismus der unspezifischen Proteinadsorption an 13 Oberflächen 2.2.6 Einfluss des umgebenden Mediums auf die Proteinadsorption 13 2.3 „Klassische“ proteinresistente Oberflächen 14 2.3.1 Beobachtungen zur „klassischen“ Proteinresistenz und OEG-SAMs 15 2.3.2 Erklärungsansätze für das Phänomen der „klassischen“ Proteinresistenz 15 2.3.3 Alternative proteinresistente Oberflächen 16 2.4 Herstellung ultradünner organischer Filme mittels Selbstorganisation 17 2.4.1 Herstellung von selbstassemblierenden Monolagen aus Peptidthiolen 18 2.5 Streptavidin/Biotin-System 19 2.6 Strepatvidin/Meerrettichperoxidase (HRP) System 21 2.7 Darstellung anderer verwendeter Proteine 22 2.7.1 Rinder-Serum-Albumin (BSA) 22 2.7.2 Fibronectin 23 2.8 Substrate für die Oberflächenexperimente 23
. .
II
2.9 Messmethoden zur Oberflächenanalytik 24 2.9.1 Mikrokontaktstempeln 24 2.9.2 Oberflächenplasmonenresonanz - Spektroskopie 27 2.9.3 Rastersondenmikroskopie 30 2.9.3.1 Rastertunnelmikroskopie 30 2.9.3.2 Rasterkraftmikroskopie 31 2.9.3.3 Rasterkraftmikroskopie im Kontaktmodus 33 2.9.3.4 Rasterkraftmikroskopie im Tapping-Modus 34 2.9.4 Infrarot-Spektroskopie 37 2.9.5 Röntgen-Photoelektronenspektroskopie 38 2.9.6 Röntgenabsorptionsspektroskopie 39 3 Die biologische Aktivität oberflächengebundener Mehrschichtensysteme: das Biotin- Streptavidin-Peroxidase System 40 3.1 Präparation der Substrate 42 3.1.1 Substrate für die SPR-Messungen 42 3.1.2 Substrate für die AFM_Messungen 43 3.1.2.1 Mikrokontaktstempeln (µCP) 43 3.1.3 Substrate für die Aktivitätstests 44 3.2 Oberflächenplasmonenresonanz-Messungen 45 3.2.1 Variierung der Biotinthiol-Konzentration 45 3.2.2 Kontrolle der Streptavidinbelegung 46 3.2.2.1 Echt-Zeit Adsoptionskinetik von Streptavidin 47 3.2.2.2 Diffusionslimitierte Streptavidinbeladung 49 3.2.3 Unspezifische Adsorption der Proteine auf einem OH-terminierten SAM 51 3.2.4 Das Streptavidin/Peroxidase-System 51 3.2.4.1 Adsorption der Peroxidase 51 3.2.4.2 Unspezifische Adsorption der Peroxidase 52 3.2.4.3 Korrelation zwischen Streptavidin und Peroxidase 53 3.2.4.4 Diskussion 54 3.2 Rasterkraftmikroskopie 55 3.3 Aktivitätstests 57
. .
III
4 Click-Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung 61 4.1 Addition von Azodoferrocen an 11-thioacetyl-undekansäurepropargylamid in Lösung 63 4.1.1 Azidoferrocen 63 4.1.2 11-thioacetyl-undekansäure-propargylamid 64 4.1.3 Ferrocenthiol 66 4.1.3.1 IRRAS-Messungen 66 4.1.3.2 XPS-Messungen 68 4.1.3.3 NEXAFS-Messungen 69 4.1.4 Zusammenfassung: Click-Chemie in Lösung 71 4.2 Addition von Azidoferocen 11-thioacetyl-undekansäure-propargylamid an der Oberfläche 71 4.2.1 Click-Reaktion am vollständigen Alkinthiol-SAM 71 4.2.1.1 IRRAS-Messungen 71 4.2.1.2 XPS-Messungen 72 4.2.2 Click-Reaktion am gemischt terminierten Alkinthiol-SAM 73 4.2.2.1 50% Alkinthiol-SAM 73 4.2.2.2 10% Alkinthiol-SAM 75 4.2.3 Zusammenfassung 77 4.3 Reaktion von Ethinyl-ferrocen an Azidoundekanthiol an der Oberfläche 77 4.3.1 Ethinyl-Ferrocen 77 4.3.2 Azido-terminiertes Undekandisulfid 77 4.3.3 N-((1H-1,2,3-triazol-4-yl) ferrocenyl)-11-mercapto-undekanthiol 78 4.3.4 Zusammenfassung 80 4.4 Addition von Azido-Essigsäure an 11-thioacetylundekansäureprpargylamid an der Oberfläche 80 4.4.1 Azido-Essigsäure 80 4.4.2 11-thioacetyl-undekansäure-propargylamid 81 4.4.3 N-((1H-1,2,3-triazol-4-yl) acetyl)-11-mercapto-undekanamid 81 4.4.4 Zusammenfassung 82
. .
IV
5 Synthese und Charakterisierung proteinresistenter Peptidthiole auf 83 der Basis von Peptiden 5.1 Synthese und Charakterisierung der Peptide 85 5.2 Synthese und Charakterisierung der Peptidthiole 85 5.2.1 Peptid-1-Thiol 86 5.2.2 Peptid-2-Thiol 89 5.3 Herstellung der Peptid-SAMs 91 5.4 Oberflächenplasmonenresonanz 93 5.4.1 Adsorption von Streptavidin 93 5.4.2 Adsorption von BSA 96 5.4.3 Adsorption von Fibronectin 97 6 Zusammenfassung und Ausblick 99 6.1 Die biologische Aktivität oberflächengebundener Mehrschichtensysteme: das Biotin- Streptavidin-Peroxidase System 99 6.2 Cklick-Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung 100 6.3 Proteinresistente Peptidthiole 101 7 Literaturverzeichnis 102 Anhang A: Abkürzungsverzeichnis 115Anhang B: Abbildungsverzeichnis 117Anhang C: Tabellenverzeichnis 121Anhang D: Liste der Publikationen 122Anhang E: Lebenslauf 123Anhang F: Danksagung 124
. .
- 5 -
. .
- 6 -
Kapitel 1 Einleitung
- 7 -
1 Einleitung
1.1 Einführung in die Protein-Oberflächen Wechselwirkung
Die Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Oberflächen spielen sowohl in der Natur als
auch bei vielen Anwendungen - insbesondere im Bereich der Sensorik - eine wichtige Rolle 1-
6. Künstliche Oberflächen (z.B. SiO2, SAMs, Polymere) weisen in ihrer Wechselwirkung mit
Proteinen sehr unterschiedliche Eigenschaften auf 5, 6. In der Regel haften Proteine an
Oberflächen, ein proteophobes Verhalten wird nur in wenigen Fällen beobachtet. Die
verschiedenen und vielfältigen Implikationen von Protein-Oberflächen-Wechselwirkungen
werden im Folgenden an zwei anwendungsorientierten Beispielen verdeutlicht: Dem
Einwachsen medizinischer Implantate und der Herstellung von Biosensoren.
In der Medizin werden neben Metallen (z.B. Silber, Gold, Titan) auch zahlreiche hydrophobe
Kunststoffe zur Herstellung von Implantaten aller Art genutzt 7. Im Allgemeinen ist der
Einheilungserfolg, die Wiederherstellung der verlorenen Organfunktion und die dauerhafte
Gewebeverträglichkeit der „Fremdkörper“ nicht gegeben, die wesentlichen Probleme
bestehen in der Ausbildung von Biofilmen auf den Implantatoberflächen 4, 8-11. Wegen der
großen Bedeutung für den Heilungserfolg wurde in den vergangenen Jahren und Jahrzehnten
zum Teil sehr aufwendige empirische Untersuchungen durchgeführt, um die Biofilmbildung
auf den Implantatoberflächen zu verhindern und die entsprechenden Reaktionen des
Immunsystem zu unterdrücken. In den USA werden jährlich ca. 20 Millionen chirurgische
Eingriffe durchgeführt, wobei vorübergehend und/oder dauerhaft ein Implantat in den
Patientenkörper eingesetzt wird 11. In 10% aller Fälle kommt es zur Biofilmbildung und
nachfolgender Entzündung in der Implantatumgebung. Bis heute gibt es keine Therapieform,
die einen einmal im Organismus gebildeten Biofilm vollständig zu zerstören vermag. Oftmals
sind weitere Operationen nötig; im Extremfall muss das Implantat chirurgisch entfernt
werden. Die Kosten für die Weiterbehandlung von durch Implantate verursachten Infektionen
belaufen sich in den USA auf jährlich 11 Milliarden US Dollar. Es wird davon ausgegangen,
dass diese Summe in Zukunft mit der Zahl der operativen Eingriffe noch weiter ansteigt.
Der größte Anteil der für Implantate verwendeten Kunststoffe ist hydrophob und ermöglicht
damit eine relativ starke, unspezifische Adsorption von Proteinen. Diese unselektive
Proteinadsorption bildet die molekulare Basis für eine spätere Verankerung des Biofilms. Zur
Zeit werden verschiedene Strategien zur Vermeidung der Proteinadsorption erprobt: Die
Kapitel 1 Einleitung
- 8 -
Beschichtung von Implantatoberflächen mit anti-bakteriellen Substanzen brachte nicht den
gewünschten Erfolg und birgt die Gefahr der körperinternen Resistenzbildung 12, 13. Eine
weitere Strategie zielt darauf ab, das Gewebe zum Zeitpunkt der Operation stärker mit dem
Implantat zu verbinden, damit ein Biofilm erst gar nicht entstehen kann 10.
Bei Anwendungen im Bereich der Biosensorik werden maßgeschneiderte Sensoroberflächen
hergestellt, die den gezielten Nachweis von spezifischen Biomolekülen erlauben 14. Bei der
Entwicklung derartiger Sensoren gilt es eine schnelle, kostengünstige, parallel durchführbare
und sichere Detektion von Biomolekülen zu ermöglichen. Von den zu detektierenden
Biomolekülen bilden die Proteine aus medizinischer und pharmakologischer Sicht die
interessanteste Gruppe. Der spezifische Nachweis von Proteinen bietet die Grundlage für
Allergie-Tests, HIV-Tests, Immunitäts-Tests, Krebs-Früherkennung, Medikamenten-
Wirksamkeits-Test usw. Bei vielen dieser Sensoren geht es nicht nur darum, ein einzelnes
Protein nachzuweisen, sondern in vielen Fällen ist der parallele Nachweise vieler
unterschiedlicher Proteine erforderlich. Aus diesem Grund stoßen insbesondere sogenannte
Proteinchips, die Kombination mehrerer, miniaturisierter Sensoren für verschiedene Proteine
in einem Bauteil, momentan auf großes Interesse.
Für den Aufbau hochspezifischer Biosensoren ist es nicht nur erforderlich, das erwünschte
Protein mit hoher Spezifität an die Oberfläche anzukoppeln und dann zu detektieren, sondern
auch die unspezifische Ankopplung anderer Proteine möglichst weitestgehend zu
unterdrücken. Die letzt genannte Anforderung ist nicht trivial, da - wie oben aufgeführt -
Proteine grundsätzlich sehr stark an Oberflächen haften. Die Entwicklung proteinresistenter
Oberflächen ist deswegen für die Biosensorik von großer Bedeutung.
Die Charakterisierung unspezifisch angekoppelter Proteine (Biomoleküle) und das
Verständnis der dahinter befindlichen Vorgänge sind entsprechend genauso wichtig wie die
Entwicklung proteinresistenter Oberflächen. Für letzteres spielt insbesondere die Entwicklung
von Molekülen eine Rolle, die eine Langzeitanwendung ermöglichen (Stabilität des
Moleküls).
1.2 Zielsetzung
Wie in Kapitel 1.1 beschrieben, sind die Wechselwirkungen von Proteinen mit Oberflächen
von essentieller Bedeutung für viele Teilgebiete der Naturwissenschaften und der Medizin.
Ein tieferes Verständnis dieser Wechselwirkung ist entsprechend sehr interessant.
Kapitel 1 Einleitung
- 9 -
Ein Teil dieser Arbeit widmet sich genau dieser Fragestellung und beschäftigt sich mit der
Adsorption von Proteinen auf unspezifischen Oberflächen und der ebenso wichtigen
unspezifischen Adsorption von Proteinen auf eigentlich spezifischen Oberflächen (wie z.B.
speziellen Biosensorchips).
Hierbei wird ein System aus Biotin und dem biotinbindenden Protein Streptavidin verwendet.
Zusätzlich wird ein weiteres Protein verwendet (Meerrettichperoxidase), welches über einen
Biotinanker an das Streptavidin binden kann. Dieses 3-teilige Baukasten-System steht
stellvertretend für andere Biosensoren, die zumeist nah genau dem gleichen Prinzip arbeiten
(„Lock-and-Key-System“).
Die spezifischen/unspezifischen Oberflächen, auf denen die Proteine (Streptavidin/
Meerrettichperoxidase) adsorbiert werden, werden über selbstorganisierende Thiol-
Monolagen (SAMs) generiert.
Im zweiten Teilbereich dieser Arbeit wird die Proteinresistenz in Bezug auf
Langzeitanwendungen untersucht. Hierzu wird die Synthese und Charakterisierung
alternativer proteinresistenter Thiole betrachtet, da die klassischen proteinresistenten Thiole
(Oligoethylen-Glykole, OEG-Thiole) genau an dieser Stelle versagen. Zur Generierung von
alternativen proteinresistenten Thiolen sollen die klassischen Ansätze analysiert werden. Die
Ergebnisse dieser Analyse werden dann auf eine alternative Molekülklasse übertragen.
Konkret wurde in dieser Arbeit versucht, die Eigenschaften der klassischen proteinresistenten
Thiole auf Peptide zu übertragen. Peptide bieten sich gerade im Bereich Medizin an, da sie
körperverwandte Bausteine sind. Zusätzlich sind die Synthesen längerer Peptidsequenzen
automatisiert und standardisiert verfügbar. Gesamtziel der Arbeit ist es also, Peptidsequenzen
zu ermitteln, die es ermöglichen, aus den entsprechenden Peptidthiolen selbstassemblierende
Monoschichten mit proteophoben Eigenschaften auf Goldsubstraten aufzubauen.
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
- 10 -
2 Theoretische Grundlagen
2.1 Mechanismen der Proteinadsorption auf Festkörperoberflächen
Wenn eine wässrige Proteinlösung mit einer Festkörperoberfläche in Kontakt kommt, wird für
fast alle Materialien eine spontane Adsorption der Proteine beobachtet 5. Nach dem
derzeitigen Stand der Forschung resultiert diese Oberflächenaktivität aus einer Reihe von
direkten (elektrostatische Wechselwirkungen, hydrophobe Wechselwirkungen) und indirekten
(mit der Verdrängung von Wasser in Zusammenhang stehende, entropische Effekte)
Ursachen, die nicht an einem bestimmten einzelnen Strukturmerkmal der Proteine
festgemacht werden können.
In vielen Fällen wird das Protein durch die Adsorption auf der Festkörperoberfläche
denaturiert, d.h. so in seiner Form verändert, dass es seine eigentliche Funktion verliert.
Generell besitzen Proteine einen sehr komplexen Aufbau, der sich aus der betreffenden
Aminosäurensequenz und der daraus resultierenden Sekundär- und Tertiärstruktur ergibt. Die
20 verschiedenen Aminosäuren können in 3 unterschiedliche Gruppen unterteilt werden:
- Aminosäuren mit unpolaren, hydrophoben Seitenketten
- Aminosäuren mit positiv oder negativ geladenen Seitenketten
- Aminosäuren mit polaren, hydrophilen Seitenketten.
Der Proteinkern ist oft hydrophob und stabilisiert die Proteintertiärstruktur. Die äußere
Oberfläche des Proteins besteht vornehmlich aus polaren und geladenen Aminosäuren. Dieser
amphiphile Charakter der Proteine ist zum Teil für ihre hohe Oberflächenaktivität
verantwortlich. Das Ausmaß der Proteinadsorption an einer festen Grenzschicht hängt aber
nicht nur von der Struktur des Proteins ab, sondern wird wesentlich von den physikalisch-
chemischen Eigenschaften der Festkörperoberfläche bestimmt. Generell gilt, dass die
Oberflächenaffinität der Proteine für hydrophobe Oberflächen größer ist als für hydrophile.
Allerdings gibt es auch hier Ausnahmen, zum Beispiel beobachtet man auch auf einigen
hydrophilen Oberflächen die Adsorption von Proteinen (z.B. Glas (Si-OH) 5).
Auf der Basis der in den zum Teil sehr umfangreichen Untersuchungen der letzten Jahre
erzielten Ergebnisse sind einige allgemeine Regeln aufgestellt worden, die das Phänomen der
Proteinadsorption recht gut beschreiben. Die wichtigsten dieser - weitgehend empirischen -
Befunde sind im nächsten Abschnitt zusammengefasst.
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
- 11 -
2.2 Triebkräfte der Adsorption von Proteinen an Festkörperoberflächen
Im folgenden Abschnitt werden die unterschiedlichen, mit der Adsorption von Proteinen auf
Festkörperoberflächen in Zusammenhang stehenden Wechselwirkungen vorgestellt.
2.2.1 „Schwache“ Wechselwirkungen
Die „schwachen“ Wechselwirkungen (WW), die in ihrer Summe jedoch beachtlich sein
können, umfassen 15:
- WW zwischen zwei permanenten Dipolen
- WW zwischen einem permanenten und einem induzierten Dipol
- WW zwischen zwei induzierten Dipolen (London- oder Dispersions-Kräfte bzw. van-
der-Waals-Kräfte)
-
Die Wechselwirkungen hängen von der Geometrie der wechselwirkenden Strukturen ab und
spielen vor allem bei kleinen Abständen zur Oberfläche eine wichtige Rolle.
2.2.2 Ionische Wechselwirkungen
Die elektrostatischen WW hängen nicht nur von der Ladungsdichte, d.h. der Anzahl an
geladenen Aminosäuren im Protein ab, sondern auch von der elektrolytischen Umgebung des
Proteins (Puffer) bzw. von der Ladungsdichte an der Interaktionsoberfläche. Gelöste mono-
(Na+, K+) oder divalente (Ca2+, Mg2+) Metallionen können die geladenen Aminosäuren
gegenüber Wechselwirkungen mit der Oberfläche abschirmen. Im Vergleich zu den
„schwachen“ Wechselwirkungen sind auch die elektrostatischen WW geometrie- und
richtungsabhängig, allerdings besitzen sie eine größere Reichweite und können betragsmäßig
größer als die van-der-Waals-Kräfte sein.
2.2.3 Hydrophobe Wechselwirkungen
Die hydrophobe Wechselwirkung bildet die wichtigste Triebkraft für die Adsorption von
Proteinen an Grenzflächen 5, 6. Unpolare Gruppen besitzen in wässrigen Puffern allgemein nur
eine sehr schwache Löslichkeit. Dies wird durch eine starke Entropieabnahme erklärt, die
durch die Ausbildung hochgeordneter „Wasserkäfige“ (engl. „low-entropy water“) entlang
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
- 12 -
der hydrophoben Kontaktflächen zustande kommt. Hydrophobe Wechselwirkungen können
durch die Tatsache erklärt werden, dass WW zwischen unpolaren Gruppen und WW zwischen
polaren Gruppen (z.B. Wasser-Wasser) günstiger sind als WW zwischen unpolaren und
polaren Gruppen. Hydrophobe Aminosäureseitenketten kommen auf der Proteinoberfläche in
der Regel nur vereinzelt vor, im Proteinkern dagegen sind hydrophobe Seitenketten häufiger
anzutreffen. Der hydrophobe Proteinkern „fällt auseinander“, wenn die hydrophoben
Aminosäureseitenketten mit der Oberfläche in Wechselwirkung treten. Bei diesem Vorgang
geht die Tertiärstruktur des Proteins meist irreversibel verloren. Der Betrag der hydrophoben
WW zur Gesamtbindungsenergie von Proteinen an Oberflächen dominiert deutlich über
elektrostatische und van-der-Waals WW. Die hydrophobe WW hängt stark von der Polarität
der Oberfläche ab. Am stärksten ist die WW mit hydrophoben Oberflächen, da die Oberfläche
durch die Proteinadsorption vor dem direkten, entropisch ungünstigen Kontakt mit Wasser
bewahrt wird. Im Vergleich zu den polaren WW besitzen die hydrophoben WW nur eine
extrem niedrige Reichweite und sind außerdem nicht orientierungsabhängig.
2.2.4 Konformationsentropie
Wie bereits zuvor erwähnt, handelt es sich bei Proteinen um komplexe Makromoleküle, deren
Tertiärstruktur durch intramolekulare Wechselwirkungen im Proteinkern (oft hydrophobe
WW) stabilisiert wird. Die Faltungsstabilität eines Proteins, d.h., der Unterschied zwischen
der Enthalpie eines gelösten, ungefalteten und eines gelösten, gefalteten Proteins liegt
zwischen 20 und 60 kJ/mol und ist damit nicht besonders groß. Daraus folgt, dass es sich bei
den Proteinen nicht etwa um starre dreidimensionale Objekte mit fester Faltung handelt,
sondern vielmehr um dynamische, flexible und intrinsisch instabile Objekte, die bereits auf
leichte Veränderungen in ihrer Umgebung reagieren. Solch eine „leichte“ Veränderung in der
Umgebung kann z.B. das Anbieten einer organischen Oberfläche darstellen. Als Folge der
Adsorption wird es in der Regel zu Konformationsänderungen in der Proteinstruktur
(Denaturierung) kommen, was durch viele experimentelle Studien belegt ist 5, 16. Diese
adsorptionsinduzierten Konformationsveränderungen werden in der Regel zu einer Zunahme
der Bindungsenergie des Proteins an die Oberfläche führen. Neben rein energetischen
Effekten kommen dabei auch wieder entropische Effekte (Konformationsentropie des
Proteins) zum Tragen. In einigen Fällen wird eine deutliche Zunahme der Entropie als Folge
der Proteinadsorption vermutet 5, 16. Die Gesamtzunahme der Enthalpie als Folge der
Adsorption kann so groß sein, dass die Adsorption an einer Festkörperoberfläche unter
physiologischen Bedingen praktisch irreversibel ist 17, 18.
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
- 13 -
2.2.5 Gesamtbild des Mechanismus der unspezifischen Proteinadsorption an
Oberflächen
Der erste Schritt bei der unspezifischen Adsorption eines Proteins an einer Oberfläche besteht
i.A. im „Einfangen“ des gelösten Proteins durch langreichweitige, von Ionen an der
Oberfläche herrührende, elektrostatische Kräfte. Je näher das Protein an die Oberfläche gerät,
umso stärker werden die attraktiven „schwachen“ Wechselwirkungen. Spätestens jetzt kommt
es zu Geometrieverzerrungen in der Proteinstruktur. Sobald ein direkter Kontakt mit der
Oberfläche hergestellt ist, kommt es zusätzlich zu der polaren Wechselwirkung zu einer
direkten Ankopplung einzelner, an der Proteinoberfläche vorhandener hydrophober
Aminosäurereste an die Substratoberfläche. Spätestens wenn dann auch die „schwachen“
Wechselwirkungen (van-der-Waals-Wechselwirkungen, hydrophobe Wechselwirkungen)
hinzukommen, wird das Protein stark verzerrt. In der Folge dieser Denaturierung reißt die
Proteinstruktur auf und es werden weitere hydrophobe Aminosäuren aus dem Proteinkern
freigelegt, die ebenfalls in Wechselwirkung mit der Oberfläche treten können. Insgesamt kann
der Energiegewinn so groß werden, dass die Proteinadsorption - unter physiologischen
Bedingungen - ein spontaner, irreversibel ablaufender Prozess ist.
2.2.6 Einfluss des umgebenden Mediums auf die Proteinadsorption
Einige Techniken zur Untersuchung biologischer Grenzflächen (z.B. Neutronenstreuung)
werden mit deuteriertem Wasser durchgeführt. Auch bei NMR-Experimenten von
Biomolekülen ist D2O das Lösungsmittel der Wahl. Bisher wurden Experimente, die sich mit
der unspezifischen Adsorption von Proteinen beschäftigen vorwiegend mit normalen
wässerigen Puffern durchgeführt. Aber auch das Adsorptionsverhalten aus deuterierten
Puffern konnte bereits charakterisiert und mit dem Adsorptionsverhalten aus wässrigen
Puffern verglichen werden19. Dabei wurde die Adsorption vier verschiedener Proteine
(Streptavidin, RNase, BSA, GST) untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Substitution
von H2O durch D2O zu einer Verlangsamung der Proteinadsorption führt. Der Austausch von
H2O durch D2O liefert für das Verhältnis kh/kd Werte zwischen 1,7 (BSA) und 2,6 (RNase).
Auch wenn die Ergebnisse dieser Arbeit nicht auf einen allgemeingültigen Einfluss von
schwerem Wasser auf die Proteinadsorption schliessen lassen, so zeigen sie doch, dass
Experimente mit schwerem Wasser wichtige Informationen liefern können, um den
Mechanismus der unspezifischen Adsorption von Proteinen auf Oberflächen besser verstehen
zu können.
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
- 14 -
2.3 „Klassische“ proteinresistente Oberflächen
Seit den frühen 80er Jahren wurden Polyethylenglykole (PEGs) mit großen
Molekulargewichten genutzt, um die Adsorption von Proteinen und Zellen aus gepufferten
wässrigen Lösungen an Oberflächen zu unterbinden 20. Erklärt wurde das proteophobe
Verhalten der PEGs durch „sterische Repulsion“ 21. Mit diesem Begriff wird der Umstand
bezeichnet, dass infolge der Adsorption des Proteins die hohe Bewegungsfreiheit der an der
PEG-Oberfläche in das Wasser ragenden PEG-Polymerketten eingeschränkt wird, was eine
entsprechende Abnahme der Entropie mit sich bringt. Ein tieferes Verständnis der Ursachen
für die proteinabstoßenden Eigenschaften von PEG-Oberflächen wurde durch die Arbeiten
aus der Gruppe um Whitesides möglich. In diesen Arbeiten wurde ein Modellsystem
verwendet, das auf selbst assemblierenden Monoschichten (SAM) aus Oligoethylenglykol-
Alkanthiolen (OEGs) basiert, die auf Gold adsorbiert wurden. Diese SAM-Schichten bieten
den Vorteil, dass der Einsatz oberflächenphysikalischer Messmethoden möglich wird. Durch
Einsatz verschiedener Oligoethylenglykoleinheiten enthaltender Organothiole konnte eine
systematische Untersuchung durchgeführt werden 22, 23. Im Vergleich zum PEG mit hohem
Molekulargewicht bieten die Monoschichten den Vorteil, dass sie monodispers sind und eine
gut definierte Grenzschicht zur Flüssigkeit aufweisen.
Ein wesentliches Ergebnis dieser Untersuchungen war, dass auch die entsprechenden OEG-
SAMs Proteinresistenz zeigten, obwohl die Bewegungsfreiheit der Ethylenglykol-Einheiten
hier von Anfang an erheblich eingeschränkt ist 6. Diese Experimente belegten, dass die
sterische Repulsion zumindest nicht den einzigen Beitrag zur Proteinresistenz von PEG-
Oberflächen liefert.
OOH
HS 6
OOH
HS 3
OOH
HS 2
OOH
HS Abb.2.1: Gezeigt sind OEG-Thiole mit unterschiedlicher Anzahl an Ethylenglykol-Gruppen. Mit
steigender Anzahl an Ethylenglykol-Gruppen nimmt die Proteinresistenz zu. Im Laufe der Zeit kommt
es durch die chemische Instabilität der OEG-Thiole zur Degradation (Abbau von Ethylenglykol-
Einheiten) und die Proteinresistenz geht verloren.
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
- 15 -
2.3.1 Beobachtungen zur „klassischen“ Proteinresistenz und OEG-SAMs
In weiteren Experimenten zeigte es sich, dass es mehrere Parameter gibt, die für die Effizienz
der Proteinresistenz der kurzen, monodispersen Filme kritisch sind 6.
Eine deutliche Proteinresistenz wird nur beobachtet, wenn das ω-Ende des Alkanthiols mehr
als zwei Ethylenglykol-Einheiten aufweist (siehe Bild 1). Bei Untersuchungen, die für
Alkanthiole mit drei Ethylenglykol-Einheiten und einer terminalen Methoxy-Funktion
durchgeführt wurden, zeigte es sich, dass zusätzlich die sich innerhalb der selbst-
assemblierenden Monoschicht ausbildende Konformation der Oligoethylen-Thiole eine
wichtige Rolle spielt. Für auf Gold aufgebrachte SAMs zeigte eine infrarotspektroskopische
Untersuchung eine helikale Konformation, die proteophobe Eigenschaften besitzt. Unter
Verwendung desselben Thiols auf Silber aufgebrachte SAMs zeigen in der
Infrarotspektroskopie eine planare („all trans“) Konformation, die sich überraschender Weise
nicht mehr proteophob verhält, sondern an der nennenswerte Mengen von Proteinen
adsorbieren 24. Der Unterschied der Konformationen der Oligoethylenglykol-Ketten in den
auf die unterschiedlichen Metalloberflächen aufgebrachten SAMs wurde durch Unterschiede
der Packungsdichte erklärt. Auf Silberoberflächen kommt es infolge der hohen
Packungsdichte zu einer lateralen Kompression, unter der die helikalen Konformationen
kollabieren. Auch bei proteinresistenten polydispersen Monoschichten aus PEG konnte man
amorphe und helikale Konformationen nachweisen 25.
Untersuchungen, die mittels eines Rasterkraftmikroskopes (AFM) an methoxy-terminierten
Alkanthiolen mit drei Ethylenglykolgruppen durchgeführt wurden, belegten, dass
elektrostatische Abstoßungskräfte mit Reichweiten von mehreren 10 nm auftreten 26, 27. Bei
diesen Arbeiten wurden Elektrolytlösungen als Medium verwendet. Die bei diesen
Messungen gefundene Abstoßung wurde auf negative Oberflächenladungen zurückgeführt,
die durch die präferentielle Adsorption von Hydroxid-Ionen aus der Lösung (Autoprotolyse)
entstehen. Die Messergebnisse konnten durch entsprechende Rechnungen bestätigt werden 28.
2.3.2 Erklärungsansätze für das Phänomen der „klassischen“ Proteinresistenz
Die zum Thema der Proteinresistenz bisher durchgeführten, recht umfangreichen Arbeiten
ergeben noch kein vollständiges Bild; die „klassische“ Proteinresistenz von PEG und OEG-
Oberflächen ist immer noch Gegenstand aktueller Forschung. Es sind aber, vor allem in den
Gruppen um Grunze 6 in Heidelberg und um Whitesides 29, 30 in Boston, „Richtlinien“
erarbeitet worden, in denen eine Reihe wichtiger Kriterien benannt werden. Die wichtigsten
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
- 16 -
dieser Richtlinien sollen im Folgenden kurz aufgeführt werden.
Im Hinblick auf eine gute Proteinresistenz muss das Innere des SAMs hydrophil sein. Einer
der wesentlichsten Belege für diese Regel ist die Beobachtung, dass beim Übergang vom
hydrophilen Oligoethylenglykol zum hydrophoben Oligopropylenglykol die Proteinresistenz
verloren geht 6. Zusätzlich spielt die laterale Packungsdichte im SAM eine wichtige Rolle für
die Proteinresistenz. Erstaunlicherweise wird gerade für entspannte laterale Packungsdichten
bzw. bei SAMs mit einiger Unordnung oder mit Defektstrukturen eine bessere
Proteinresistenz gefunden 6. Aus diesen beiden Beobachtungen wird gefolgert, dass Wasser in
den SAM eindringen können muss. Durch Monte-Carlo-Simulationen wurde belegt, dass das
Eindringen von Wasser und die laterale Packungsdichte miteinander korrelieren 31, 32.
Außerdem bleibt unter den „entspannten“ Bedingungen die helikale Konformation der OEG-
Einheiten in den SAMs erhalten, wodurch Hydroxid-Ionen durch mehrere
Wasserstoffbrückenbindungen im OEG-Film gefangen und gegen laterale Verschiebung
gesichert werden 28. Da ein sich näherndes negativ geladenes Protein die Hydroxid-Ionen
nicht verdrängen kann, besitzt der Film insgesamt proteinresistente Eigenschaften. Es soll
allerdings nicht unerwähnt bleiben, dass es auch einige negativ geladene Oberflächen gibt
(z.B. Siliziumoberflächen), die nicht proteinresistent sind 5, 33.
2.3.3 Alternative proteinresistente Oberflächen
Wie oben ausgeführt, ist das Phänomen der Proteinresistenz auf molekularer Ebene noch nicht
vollständig verstanden. Die Erklärungsansätze sind - insbesondere im Fall der
Polyethylenglykole - plausibel und können eine Reihe von experimentellen Beobachtungen
erklären. Insgesamt wäre es außerordentlich interessant, organische Oberflächen aus anderen
Materialien im Hinblick auf ihre Proteinresistenz hin zu untersuchen. Außerdem besitzen die
Ethylenglykol-Oberflächen ein Problem im Hinblick auf ihre chemische Stabilität 34, 35. Die
Ethylenglykol-Einheiten sind oxidationsempfindlich, wodurch die Anzahl der terminalen
Ethylenglykol-Einheiten sich mit der Zeit verringert und die Oberflächen mehr und mehr ihre
proteophoben Eigenschaften verlieren. Vor allem wegen dieser intrinsischen
Oxidationsempfindlichkeit der Ethylenglykol-Einheiten wurde und wird intensiv nach
alternativen proteophoben Oberflächen gesucht. Einige alternative proteinresistente SAM-
Oberflächen sind bereits vorgeschlagen worden 22, 36-40. Unter alternativen proteophoben
Oberflächen sollen hierbei solche verstanden werden, in denen keine Ethylenglykol-Einheiten
vorhanden sind. Zu dieser Klasse zählen z.B. Maltose-terminierte SAMs 22,
Tripropylensulfoxid SAMs 36 und zwitterionische SAMs 37-39. Whitesides und Mitarbeiter
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
- 17 -
haben in einer Studie, in der sie nach Molekülen suchten, die für die Bildung proteophober
SAMs taugen, eine allgemeine These zum Phänomen der Proteinresistenz aufgestellt 29, 30.
Demnach ist es erforderlich, dass das Rückgrat eines Organothiols Wasserstoffbrücken-
Akzeptoren besitzen muss, damit der daraus aufgebaute SAM proteinabstoßende
Eigenschaften besitzt. Dagegen führt der Einbau von Wasserstoffbrücken-Donoren zu einem
Verlust der Proteinresistenz. Allerdings existiert auch zu dieser sehr allgemeinen Regel
bereits eine Ausnahme: Mannitol-Gruppen terminierte SAMs 41.
2.4 Herstellung ultradünner organischer Filme mittels Selbstorganisation
Ultradünne organische Filme, die durch Eintauchen von metallischen Substraten in Lösungen
von Organothiolen hergestellt werden können, finden ein immer breiteres Interesse im Hin-
blick auf ein wachsendes Feld von Anwendungen 42, 43. Ausschlaggebend für die vielfältigen
Einsatzmöglichkeiten dieser Filme ist die hohe strukturelle Qualität der organischen
Dünnstschichten, die sogar einen Einsatz als Resist in der Elektronenstrahllithographie
ermöglichen 44.
Abb.2.2: Selbstorganisation von Alkanthiolen. Die Moleküle werden über die Ankergruppe an der
Oberfläche festgehalten. Die funktionelle Gruppe bestimmt die Eigenschaften des SAM’s.
Diese Anwendung ist nur möglich, weil die Defektdichte in den molekular dünnen Filmen im
Hinblick auf den nach der Strukturierung mit dem Elektronenstrahl durchzuführenden
Ätzprozess ausreichend klein ist. Für viele Anwendungen ist eine entsprechende
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
- 18 -
Funktionalisierung der Organothiole erforderlich. Im Hinblick auf eine Anwendung in der
Sensorik muss etwa bei den häufig verwendeten Alkanthiolen die sehr stabile terminierende
Methyleinheit -CH3 durch eine Funktion ersetzt werden, die ein Ankoppeln der
nachzuweisenden Substanz ermöglicht. In diesem Bereich gibt es schon eine Reihe von
Vorarbeiten, die etwa in dem Buch von Ulman 43 und dem Übersichtsartikel von Nuzzo und
Dubois 42 diskutiert werden. Einen guten Überblick über die inzwischen sehr stark
angewachsene Literatur in diesem Bereich geben die Übersichtsartikel von Whitesides 45,
Wöll 46 und Schreiber 47.
2.4.1 Herstellung von selbstassemblierenden Monolagen aus Peptidthiolen
Seit Mitte der 90er Jahre wird in der Literatur von den Problemen und Erfolgen bei der
Erzeugung von Peptidoberflächen auf der Basis von selbstassemblierenden Peptidmolekülen
berichtet 48. Bei den in der Nukleinsäureanalytik häufig verwendeten PNA-Molekülen
(Peptide Nucleic Acid, Nukleinsäure mit Peptidrückgrat) handelt es sich chemisch formal um
Peptide. Diese Peptide sind im Zusammenhang mit dem hier vorgelegten Thema jedoch nicht
von Interesse, da durch die Peptidfunktion nur das geladene Rückgrat einer DNS gegen ein
neutrales substituiert wird. Obwohl chemisch formal ein Peptid vorliegt, lässt sich dieses
Molekül funktional nur als einzelsträngiges modifiziertes DNS-Fängermolekül einsetzen.
Die in der Einleitung angesprochene Biologisierung von künstlichen Oberflächen gelingt am
besten mit Aminosäure-basierten Peptidoberflächen, weil dadurch die Oberfläche
„proteinartig“ gemacht wird. Dementsprechend vielfältig sind die Berührungsflächen dieses
jungen Forschungsfeldes mit verwandten Forschungsfeldern und Anwendungen. Im
Folgenden soll ein grober Überblick über die derzeit verfügbare Literatur gegeben werden.
Neben einigen Arbeiten 49-54, die sich ausschließlich mit präparativen Aspekten, der
Peptidverankerung sowie der Orientierung und Anordnung der Peptid-SAMs beschäftigen,
gibt es eine Vielzahl von Arbeiten 48, 54-64, in denen die Oberflächenchemie und -physik der
resultierenden Filme charakterisiert wurden. Bisher kristallisieren sich bei den Anwendungen
von Peptid-SAMs zwei Hauptanwendungsgebiete heraus: Einerseits versucht man,
verschiedene Zellen dauerhaft und selektiv auf (strukturierten) Peptidfilmen zu verankern 65-
70, andererseits werden neue (bio)sensorische Aspekte auf der Basis von Peptidfilmen
erforscht 71-84. Ein besonders neues Feld (~seit 2000) ist die molekulare Elektronik auf Basis
von Peptidelementen 85-88. Im Hinblick auf das Ausbilden proteophober Oberflächen sind
reine Peptid-SAMs bislang nicht eingesetzt worden.
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
- 19 -
2.5 Streptavidin/Biotin-System
Streptavidin wird von dem Bakterium Streptomyces avidinii gebildet und aus diesem isoliert.
Streptavidin ist ein tetrameres Protein (4 Monomere zu je 13kDa), welches in der Biochemie
viele verschiedene Anwendungen findet. Diese Vielfältigkeit beruht darauf, dass Streptavidin
ein hohe Affinität zu Biotin (Ka~1013M-1) besitzt. Von jedem Monomer kann ein Molekül
Biotin gebunden werden. Die Biotin-bindenden Eigenschaften des Streptavidins sind in der
Literatur etabliert 89-92. Die Bindungstasche ist so aufgebaut, dass sie drei verschiedene
Bindungsarten mit dem Liganden zeigt, wie es von Weber et al., 1989 und Hendrickson et al.,
1989 in ihren Arbeiten zur Struktur des Streptavidin-Biotin-Komplexes gezeigt wird.
Abb.2.3: Schematische Darstellung der Biotin-Bindungstasche des Streptavidins nach der Gruppe
von Freitag 93, 94. Die Pfeile symbolisieren antiparallele β-Faltblattstrukturen, wobei die unter
physiologischen Bedingungen irreversible Biotin-Streptavidin-Komplexbildung ausschließlich durch
nicht kovalente polare (linkes Bild) und unpolare (rechtes Bild) Wechselwirkungen zustande kommt.
Streptavidin bindet mit 1-2 seiner 4 Biotin-Bindungsplätze an eine biotinylierte Thiolschicht.
Die gegenüberliegenden 2 freien Bindungsplätze können als universelle Bindematrix dienen.
Die hohe Affinität dieser Komponenten macht das Biotin-Streptavidin-System zu einem Maß
für die spezifische Bindung von Proteinen an eine Oberfläche, da davon ausgegangen werden
kann, dass jedes zugängliche Biotin an einer Oberfläche durch Streptavidin gebunden wird.
Es ist bekannt, dass Streptavidin unter geeigneten experimentellen Bedingungen an
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
- 20 -
biotinylierten Oberflächen nur eine Monolage ausbildet 35, da Streptavidin keine Di- oder
Multimere bildet, wenn keine Bindungsstellen mehr an der Oberfläche verfügbar sind.
Abb.2.4: Tetramere Struktur des Streptavidins (nach 92) mit vier gebundenen Biotinmolekülen. Es ist
zu erkennen, dass die Bindungstasche des Streptavidins relativ tief ist.
Gegenüber anderen Biotin-bindenden Proteinen (z.B.: Avidin) besitzt Streptavidin einige
Vorteile. Das Gen des Streptavidins ist vollständig aufgeschlüsselt und somit in
Standardexpressionssystemen expremierbar. Dass heißt, dass die Geninformation bekannt ist
und gezielt in bakterien eingebaut werden kann, damit diese dann das Streptavidin
produzieren. Zusätzlich können gezielte Modifikationen an den Geniformationen
vorgenommen werden, um das Strepatvidin spezifisch zu verändern.
Tab. 2.1: Dissoziationseigenschaften des Streptavidin - Biotin - Komplexes 89,95.
pH 1,7 2,0 3,0 5,0 7,0 9,2 10,5
Geschwindigkeitskonstante k (sek-1 x 107)
35,0 - 19,0 8,7 28,0 64,0 100,0
Halbwertszeit t1/2 (in Tagen)
2,3 - 4,2 9,2 2,9 1,25 0,8
Streptavidin besitzt es noch einen weiteren, großen Vorteil. Verwandte Proteine wie z.B. das
Avidine werden aus dem Eiweiß bzw. Eidotter von Vögeln oder Reptilien isoliert. In diesen
werden sie als Glykoproteine exprimiert und besitzen deshalb viele heterogene
Kohlenhydratmodifikationen, die für unspezifische Bindungseffekte verantwortlich gemacht
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
- 21 -
werden89. Streptavidin hingegen wird wie bereits erwähnt in Bakterien exprimiert und besitzt
diese Modifikationen entsprechend nicht.
Die Dissoziation des Streptavidin von Biotin ist von vielen Faktoren abhängig. Die
Freisetzung der Liganden steigt mit zunehmender Nettoladung des Proteins. Am
isoelektrischen Punkt ist die Wechselwirkung zwischen Ligand und Protein am stärksten. Das
Dissoziationsverhalten im pH-Bereich ist in Tabelle 2.1 dargestellt.
Auf Grund der hohen Enthalpie (ΔH) der Bindung von Biotin an Streptavidin, ist die
Dissoziationsgeschwindigkeit auch stark von der Temperatur abhängig. Eine Erhöhung der
Temperatur von gerade einmal 5K führt zu einer Verdoppelung der Dissoziationsrate 89,96.
Auch sperrige Gruppen am Biotin sind für die Bindung hinderlich. Dieser Umstand wird
durch die Verwendung von Abstandshaltergruppen (engl. spacer) verhindert. Diese Spacer
bestehen meist aus einfachen Methylengruppen, die sechsfach oder häufiger hintereinander
aufgereiht sind.
Wie bereits erwähnt wird Strepatvidin in der Natur vom Bakterium Streptomyces avidinii
gebildet. Bis heute konnte allerdings nicht herausgefunden werden, warum das Bakterium
Streptavidin synthesisiert, was die genaue Funktion des Streptavidins im Bakterium ist und
welche Selektionsvorteile sich daraus ergeben. Dies ist ungewöhnlich, da solch starke
(irreversible) Protein-Ligand-Wechselwirkungen, wie sie für das Streptavidin-Biotin-System
beobachtet wurden, in der Natur - auf Grund der erhöhten Schwere des biochemischen
Regulierungsmecnaismus - nicht häufig vorkommen.
2.6 Strepatvidin/Meerrettichperoxidase (HRP) System
Meerrettichperoxidase Isoenzym C ist das meistuntersuchte Protein bei der Charakterisierung
der enzymatischen Aktivität von Peroxidasen. Es ist ebenfalls das meistuntersuchte Protein
aus der Superfamilie der extrazelluären Peroxidasen von Pflanzen. Die Peroxidase wird mit
einem Ankermolekül konjugiert, welches eine Biotingruppe enthält; diese Ankergruppe ist
Biotinamidocaproyl (Abb. 2.3). Dieses Molekül enthält eine -COOH-Gruppe. Diese Gruppe
kann an jede freie Aminogruppe des Proteins konjugiert werden. Bei der HRP stehen hierfür
der N-Terminus und die frei zugänglichen Seitenkette der Aminosäure Lysin (H2N-(CH2)4-
CH(NH2)-COOH) zur Verfügung. Aus Kristallstrukturanalysen können die Maße der
Peroxidase entnommen werden (Abb. 2.3). Aus den Daten der Kristallstrukturanalyse wird
ersichtlich, dass die meisten Lysine auf der langen Seite der Peroxidase lokalisiert sind (4
Lysine auf der langen Seite, kein Lysin auf den beiden kurzen Seiten, ein Lysin in einer Ecke,
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
- 22 -
also für lange und kurze Seite zugänglich, 1 Lysin ist im Inneren der HRP lokalisiert und steht
für eine Interaktion nicht zur Verfügung); der N-Terminus ist ebenfalls an der langen Seite
des Proteins lokalisiert. Das Verhältnis der Bindungsmöglichkeiten für das Aminocaproyl von
langer zu kurzer Seite ist somit 6:1. Es sollte also davon ausgegangen werden, dass die
meisten Aminocaproyle auf der langen Seite konjugiert sind und die Peroxidase über diese
Seite an die Streptavidin-Matrix bindet.
Abb.2.5: Monomere Struktur der HRP (links). Rechts ist der Biotinanker, das Biotinamidocaproyl
dargestellt. Die Biotinfunktion (roter Kreis) ist über eine C-N-Bindung mit dem restlichen Anker
verbunden. Die HRP besitzt die folgenden Maße (RCBS-Proteindatabank): 4,1nm x 4,1nm x 6,2nm.
2.7 Kurzdarstellung anderer verwendeter Proteine
2.7.1 Rinder-Serum-Albumin (BSA)
Rinder-Serum-Albumin (bovine serum albumine, BSA) ist ein globuläres Protein mit einem
Molekulargewicht von etwa 67 kDa. Albumine sind mit ca. 45 g/l das häufigste Protein im
Blutplasma. Die Funktionen des Albumins bestehen der pH-Regulation des Blutes, indem es
als Puffer agiert, sowie in im Aufrechterhalten des kolloidosmotischen Drucks. Neben der
Bindung anorganischer Ionen (Mg2+ und Ca2+), dient das Albumin auch als Trägerprotein für
wasserunlösliche bzw. schwerlösliche Komponenten, da es Bindungsstellen für lipophile
Substanzen besitzt. Albumine sind beispielsweise am Transport von, Fettsäuren,
Steroidhormonen und Pharmaka beteiligt.
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
- 23 -
2.7.2 Fibronectin
Fibronectin ist ein Glycoprotein der extrazellulären Matrix. Fibronectin besteht zu 5% aus
Carbohydraten, welche an membrangebundene Rezeptorproteine (Integrin) binden. Neben
den Integrinen bindet Fibronectin auch an andere Proteine der extrazellulären Matrix
(Collagen, Fibrin, Heparansulfat) 97. In seiner löslichen Form (2 Monomere mit je 230kDA)
findet man Fibronectin auch im Blutplasma. Die unlösliche Form des Fibronectins ist ein
großer Komplex von miteinander vernetzten Untereinheiten. Die Eigenschaft, Zellen mit der
extrazellulären Matrix zu verbinden, brachte Fibronectin anfangs den Namen Zellkleber ein.
2.8 Substrate für die Oberflächenexperimente
Die für die Beobachtung der Adsorption des Streptavidins verwendeten Substrate müssen
über bestimmte Eigenschaften verfügen.
Für die Experimente mit dem Ratsrekraftmikroskop sollte die Oberfläche der Substrate
möglichst glatt sein, da das Streptavidin selber eine Höhe von nur 4 nm besitzt. Bei einer zu
großen Rauhigkeit der Oberfläche wäre eine Unterscheidung zwischen der Rauhigkeit des
Substrates und absorbierten Streptavidinmolekülen nicht mehr möglich.
Zur Generierung eines strukturierten SAM ist es notwendig, eine massive Metallschicht zu
benutzen, da die zur Herstellung des SAM verwendete Mikrokontaktstempelmethode eine
relativ starke mechanische Belastung der Oberfläche darstellt. In der vorliegenden Arbeit
wurden hierfür mit Gold beschichtete Siliziumwafer verwendet. Auf die Verwendung von
Goldeinkristallen wurde wegen der zu hohen Kosten verzichtet.
Das Substrat muss weiterhin resistent gegen Oxidation durch Luftsauerstoff sein, da diese zur
Veränderung und Zerstörung der Adsorbatschicht führen kann 98. Diese Resistenz wird über
das Bedampfen mit Gold erreicht, da dieses von den Edelmetallen am unempfindlichsten
gegenüber Luftsauerstoff ist.
Bei der Auswahl geeigneter Substrate konnte einerseits auf in der Literatur beschriebene
Präparate, so wie auf die vorhandene Erfahrung in der Präparation am Lehrstuhl für
Physikalische Chemie I (Ruhr-Universität Bochum) zurückgegriffen werden.
in der vorliegenden Arbeit wurden polierte Siliziumeinkristalle, die durch Oxidation zu SiO2
(an der Oberfläche) passiviert wurden, verwendet. Durch die Härte des Siliziumeinkristalls
lässt sich dieser einfach präparieren. Da Gold zwar auf Silizium haftet, aber schon durch
leichte mechanische Belastungen (z.B.: laminare Strömungen in der Flusszelle) wieder
abblättert, wird zwischen das Silizium (2mm dick) und dem Goldfilm (60-100nm) eine dünne
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
- 24 -
Schicht Titan (~10nm) als Haftvermittler aufgedampft. Soweit nicht anders beschrieben
wurden die Präparate nach folgendem protokol bedampft: Die Wafer wurden mit reinem
Aceton und abs. Ethanol (EtOH) gewaschen und anschließend im Stickstoffstrom getrocknet.
Die Substrate wurden dann in einen Metall-Verdampfer (Leybold Univac) eingebaut. Das
Gerät besitzt eine Drehschieber-Vakuumpumpe (bis etwa 10-3bar) und eine
Turbomolekularpumpe (bis 10-7-10-8bar) über die das benötigte Vakuum (etwa 10-7bar)
erzeugt wird. Weitere wichtige Bestandteile sind zwei Wolframschiffchen. Die beiden
Wolframschiffchen sind mit bis zu 120 Ampere auf 400°C aufheizbar. In ihnen befinden sich
die zwei zu verdampfenden Metalle, in einem das Gold, in dem anderen das Titan. Die
Substrate befinden sich auf einem drehbaren Teller etwa 30cm über den Wolframschiffchen.
Der Teller ist so konstruiert, dass er sich nur bei „niedrigen“ Temperaturen (≤ 50°C) drehen
lässt. Beim Bedampfen können verschiedene Schichtdicken eingestellt werden, mit denen die
Substrate bedeckt werden sollen. Die Bestimmung dieser Schichtdicke erfolgt über eine
Quarzwaage. In Abhängigkeit von den aufgedampften Schichtdicken verändert hierbei ein
schwingender Quarzkristall seine Schwingfrequenz. Aus dieser Veränderung kann dann die
Schichtdicke bestimmt werden. Die Aufdampfrate (Å/Sekunde) wird über den Heizstrom, der
an den Wolframschiffchen angelegt wird, eingestellt. Zuerst wurde eine Schicht von 100Å
Titan mit einer Rate von 2Ås-1 aufgedampft, um die Adhäsion des anschließend
aufgedampften Goldfilms zu erhöhen. Der Goldfilm wurde mit einer Rate von 15Ås-1
aufgedampft, bis die endgültige Schichtdicke von 1200Å (Silizium Wafer) bzw. 600Å (Glas-
Wafer) erreicht worden war.
Für die durchgeführten Experimente mit dem Rasterkraftmikroskop wurden dementsprechend
mit Gold/Titan bedampfte Siliziumeinkristall-Wafer verwendet. Zur Charakterisierung im
Oberflächenplasmonenresonanz-Spektrometer, sowie für die AKtivitätstests wurden Glas-
Wafer (T283 Dünnglas) verwendet.
2.9 Messmethoden zur Oberflächenanalytik
2.9.1 Mikrokontaktstempeln
In dieser Arbeit wurden lateral strukturierte Goldsubstrate verwendet. Die Herstellung solcher
Strukturen gelingt über die Mikrokontaktstempeltechnik. Mit dieser Technik können auf sehr
einfache Art und Weise kleinste Strukturen hergestellt werden, wobei als unteres Limit derzeit
überall 30 nm genannt werden 99.
Die Technik beruht auf der Übertragung der gewünschten Strukturen auf die Goldsubstrate
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
- 25 -
mittels eines Polymerstempels aus Polydimethylsiloxan (PDMS, z.B.: Dow Corning,
Poly(dimethylsiloxan) Sylgard 184) und der Fähigkeit von Alkanthiolen, selbstordnende,
monomolekulare Dünnfilme auszubilden. Hierzu wird der Stempel mit dem gewünschten
Alkanthiol beladen und mit dem Goldsubstrat in Kontakt gebracht, wo sich dann die
monomolekulare Alkanthiollage ausbilden kann. Abbildung 2.4 zeigt die Herstellung des
PDMS - Stempels. Zur Herstellung der Maske wird mittels eines Zeichenprogramms
Abb.2.6: Herstellung a) des Masters (Photolithographie) und b) des Stempels (PDMS).
(z.B.: CAD oder COREL DRAW) eine Vorlage erstellt. Diese Vorlage wird dann je nach
Strukturgröße auf Chrom (≤ 20 µm) oder eine Polymerfolie (≥ 20 µm) übertragen99.
Die Herstellung der Polymerfolie ist preisgünstiger und nicht so zeitaufwendig wie die einer
Chrommaske. Von dieser Maske wird wie in Abbildung 2.4.a) dargestellt, über einen
photolithographischen Prozess ein sogenannter „Master“ hergestellt. Hierzu wird ein
Silizium-Wafer mittels Spin Coating mit einem Photolack beschichtet und anschließend durch
die Maske mit UV-Licht belichtet. Der Wafer wird anschließend entwickelt, wodurch je nach
Photolack (Positiv - oder Negativphotoresist) der nicht belichtete bzw. belichtete Bereich als
Struktur zurückbleibt. Der Master wird dann mit dem PDMS übergossen (Abbildung 2.4.b)),
das PDMS polymerisiert und der fertige, strukturierte Stempel kann vom Master getrennt
werden. Der Master wird zuvor silanisiert, um ihn leichter aus dem PDMS lösen zu können.
Der strukturierte Stempel wird anschließend mit dem benötigten Thiol beladen (Abb. 2.5.a).
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
- 26 -
Hierzu muss der Stempel lediglich kurz in die Thiol - Lösung eingelegt oder mit dieser benetzt
werden.
Abb.2.7: Mikrokontakt-Printing eines Thiols auf Gold (schematische Darstellung). Nur an den
Kontaktflächen des Stempels mit der Goldoberfläche kann das Thiol an das Goldsubstrat binden.
Anschließend wird der Stempel auf einen Silizium- bzw. Glas-Wafer gelegt, wodurch die
Struktur auf das Substrat übertragen wird. Zur einfachen Qualitätsprüfung der gestempelten
Strukturen kann nach Übertragung der Thiole das restliche Gold weggeätzt und das Ergebnis
unter dem Lichtmikroskop betrachtet werden.
Die PDMS - Stempel sind sehr langlebig. Ein Stempel kann mehr als hundert Mal zum
Stempeln verwendet werden. Die relativ günstigen Bedingungen zur Herstellung der Stempel
und der gestempelten Strukturen haben die Mikrokontaktstempeltechnik zu einer industriell
interessanten Technik werden lassen. Zu den Vorteilen zählen die relativ günstigen
Materialien (Si-Wafer, PDMS), die Langlebigkeit sowie die Flexibilität der PDMS - Stempel,
wodurch auch unebene Flächen (z.B.: Kugeloberflächen) bestempelt werden können. Auch
das Bestempeln größerer Flächen kann realisiert werden. Hierzu wird ein Stempel mit
zylindrischer Form verwendet, welcher über das Substrat gerollt wird100,101. Es wurde bereits
ein sog. „Stamp-Aligner“ entwickelt, der unter definierten Bedingungen die Muster größerer
Arrays reproduzierbar stempeln kann 102.
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
- 27 -
Die Entwicklung dieser Technik ist schon weit vorangeschritten und wird möglicherweise
schon bald industrielle Anwendung (z.B. Erstellung von Sensorarrays103) finden.
2.9.2 Oberflächenplasmonenresonanz - Spektroskopie
Das Phänomen der Oberflächenplasmonenresonanz wurde bereits 1909 und 1941 von den
Theoretikern Sommerfeld und Fano als Lösung der Maxwell-Gleichungen vorausgesagt.
Dabei wurden stetige Randbedingungenan der Oberfläche vorausgesetzt. Trotz dieser frühen
Voraussagen gelang die experimentelle Umsetzung des Oberflächenplasmonenresonanz-
Konzeptes erst in den 60er Jahren und ist seitdem kontinuierlich weiterentwickelt worden.
Heute gibt es verschiedene kommerzielle Systeme (z. B. Geräte der Firmen Reichert,
BIAcore® und Texas Instruments). Die Bestimmung kinetischer und thermodynamischer
Interaktionseigenschaften zwischen zwei Bindungspartnern ist dabei das vorherrschende Ziel
der Untersuchungen.
Im Folgenden werden die wichtigsten Aspekte dieser Technik zusammengefasst. Bei Metallen
sind die äußeren Valenzelektronen aufgrund der abgeschlossenen inneren Schalen vom Kern
abgeschirmt und werden somit von der Kernladung nicht beeinflusst. Wegen dieses
Phänomens können die Valenzelektronen von Metallen (z.B.: Silber, Gold) - unter
Vernachlässigung der positiven Atomrümpfe - als Elektronengas aufgefasst werden
(Plasmakonzept). In diesem Plasma können sich Verschiebungen der Ladungsdichte in Form
elektromagnetischer Wellen (EM) ausbreiten. Diese EM werden als Plasmonen bezeichnet;
man unterscheidet dabei zwischen Volumenplasmonen und Oberflächenplasmonen.
Volumenplasmonen (VP) sind longitudinale Wellen und im inneren des Metalls lokalisiert,
während Oberflächenplasmonen (SP) transversale Wellen sind und parallel zur Grenzfläche
des Metalls und dem angrenzendem Dielektrikum verlaufen. Die beiden Plasmawellen
interagieren nicht miteinander. Eine Besonderheit der SP ist die Abnahme der Amplitude im
Volumen senkrecht zur Ausbreitungsrichtung, die einem exponentiellen Verlauf folgt. Die
Oberflächenplasmonen können normalerweise optisch nicht angeregt werden. Aufgrund des
Welle-Teilchen-Dualismus können die anregende Lichtwelle und die
Oberflächenplasmonenwelle als jeweils ein Lichtteilchen (Photon) angesehen werden. Wenn
das anregende Photon mit dem Oberflächenplasmon ideal wechselwirken soll, muss es zur
vollständigen Energie- und Impulsübertragung kommen, d.h. anregende Lichtwelle und
Oberflächenplasmon müssen bzgl. Energie, Impuls und Ploarisation übereinstimmen. Eine
solche Übereinstimmung ist normal nicht möglich; dies wird relativ schnell ersichtlich, wenn
man die Disperisonkurven für die Plasmonenwellen und eine Lichtwelle betrachtet (siehe
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
- 28 -
Abb. 2.9). Um nun doch eine Anregung zu ermöglichen muss ein optischer Koppler
eingesetzt werden (Prisma). Der Koppler sorgt dafür, dass - auf Grund der Dämpfung im
dichteren Medium - die Steigung der Lichtgeraden verkleinert wird, so dass sich die beiden
Dispersionsgraphen schneiden und eine Anregung möglich wird. Durch einen speziellen
Aufbau (Kretchmann-Raether-Anordnung, p-Polarisation des anregenden Lichts) und der an
der Grenzfläche Prisma/Probe auftretenden Totalreflektion können so Impuls, Energie und
Polarisation aufeinander abgeglichen werden, so dass es zu einer anregung kommt.
Abb.2.8: Dispersionskurven von Oberflächen- (SP) und Volumenplasmonen (VP) im Vergleich zur
Dispersiongerade des Lichts. Die Lichtgerade und die Dispersionskurve für die SP schneiden sich
nicht, es kann also keine Energie- und Impulsübetragung auftreten.
Eine solche Anregung wird als Oberflächenplasmonenresonanz bezeichnet. Wird die
Intensität des total reflektierten Laserstrahls (R) als Funktion des Einfallswinkels aufgetragen,
so zeigt sich im Falle der resonanten Plasmonenanregung ein scharfes Minimum (Abb.2.10).
Diese sogenannte Abschwächung der Totalreflektion (attenuated total reflection, ATR) bildet
die Grundlage der SPR-Spektroskopie. Bei einem bestimmten Winkel α stimmt die
Komponente des Lichtwellenvektors entlang der Grenzfläche mit dem Wellenvektor des
Oberflächenplasmons überein. Der Resonanzwinkel ist dabei von mehreren Faktoren
abhängig, wie z.B. dem Brechungsindex des Systems. Die zwei wichtigsten Faktoren sind die
Belegung der Grenzschicht Gold/Luft und das den Goldfilm umgebende Medium, da beide
Faktoren den Brechungsindex des Systems beeinflussen. Wird nun auf den Metallfilm eine
dielektrische Schicht aufgetragen, so führt dies zu einer Verschiebung der
Plasmonenresonanz. Diese Verschiebung ist durch eine Änderung des Winkels α erkennbar.
Für die Kinetikmessung wird der Winkel α nicht variiert, sondern auf einen bestimmten
Winkel fixiert und die Veränderung der Intensität gemessen. Da bei der Bindung von
Molekülen an die Oberfläche diese optisch dichter wird und sich somit die
Plasmonenresonanz zu höheren Werten verschiebt, verändert sich auch die für den
Beobachtungswinkel gemessene Intensität.
SP
kx
VPω Licht: ω=c*k
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
- 29 -
Abb. 2.9: Links: Schematische Darstellung der Plasmonenresonanzkurve zu zwei verschiedenen
Zeiten T1 und T2 eines Adsorptionsprozesses. Die Minima beim entsprechenden Resonanzwinkel
α1/α2 und die Verschiebung des Resonanzwinkels sind deutlich zu erkennen. Im rechten Bild ist die
Entstehung der entsprechenden Oberflächenkinetik dargestellt.
In Abbildung 2.11 ist beispielhaft die Aufnahme einer Oberflächenkinetik mittels SPR
gezeigt, bei der ein Thiol einen SAM auf einer sauberen Goldoberfläche bildet.
Abb.2.10: Die Bildung eines SAMs lässt sich in Realzeit mitels SPR verfolgen: nach Kontakt einer
sauberen Goldoberfläche mit reinem Ethanol ist das SPR-Signal erstmal konstant. Nach Zugabe einer
alkoholischen Lösung vom 11-Mercapto-undekanol (linker Pfeil) nimmt das SPR-Signal stark an
Intensität zu. Nach Ende des Kontakts mit der Thiollösung (rechter Pfeil) nimmt die Intensität des
Signals wieder ab, bleibt aber weit über dem Ausgangsniveau. Es hat sich eine organische
Dünnstschicht auf der goldoberfläche gebildet.
Die Hauptvorteile der SPR bei der Charakterisierung von Biomolekül-Interaktionen liegen
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
- 30 -
darin, dass die Verschiebung des Plasmonenresonanzminimums proportional zur molaren
Masse der angelagerten Bindungspartner (Proteine) ist und keine Marker-Moleküle (Tags
oder Labels) an die Bindungspartner (Proteine) angeheftet werden müssen, um ihre
Adsorption in Realzeit verfolgen zu können.
2.9.3 Rastersondenmikroskopie
Rastersondenverfahren sind die Instrumente zum Vorstoß in die Nanotechnik, dem Terrain
einzelner Moleküle104.
Ein wichtiges Ereignis in dem Bereich der Rastersondenmikroskopie war die Entwicklung des
Rastertunnelmikroskops (Scanning Tunneling Microscope, STM) durch Binnig und Rohrer 105
(1981). Auf Grund des sehr guten Auflösungsvermögens bis in den atomaren Bereich und der
spektroskopischen Eigenschaften war dies das erste Rastersondenmikroskop, welches auf ein
breites Interesse in der Wissenschaft stieß 106.
2.9.3.1 Rastertunnelmikroskopie
Bei der Rastertunnelmikroskopie wird eine feine Metallspitze („Sonde“) mit Hilfe
piezokeramischer Stellglieder in sehr geringem Abstand (≤ 1 nm) über die Oberfläche
gerastert. Legt man an diese Sonde einen elektrischen Strom an, entsteht ein sogenannter
Tunnelstrom. Dieser Strom beruht auf dem quantenmechanischen Tunneleffekt und ist
exponentiell vom Abstand der Spitze zur Probe abhängig. Dieser Tunnelstrom kann detektiert
werden. Wird nun die Probe relativ zur Spitze bewegt, erfolgt eine Veränderung des
Tunnelstroms entsprechend der Oberflächentopographie. Da sich der Tunnelstrom
exponentiell zum Abstand der Spitze zur Probe verändert, tragen nur die vordersten Atome
der Spitze zum gemessenen Signal bei. Aus diesem Grund beträgt das vertikale
Auflösungsvermögen dieser Technik weniger als 10-3 nm, ein Wert, der von keiner anderen
mikroskopischen Methode erreicht wird 107.
Da das Prinzip des Rastertunnelmikroskops auf dem quantenmechanischen Tunneleffekt
beruht, ist die Anwendung auf leitende und halbleitende Proben beschränkt. Biologische
Proben können daher nur untersucht werden, wenn sie vorher mit einer leitenden Schicht
(z.B.: Kohlenstoff /Platin) überzogen wurden Dies führt normalerweise zum Verlust
sämtlicher biomolekularen Eigenschaften der zu untersuchenden Probe.
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
- 31 -
2.9.3.2 Rasterkraftmikroskopie
Binnig, Gerber und Calvin gelang es 1986 das Prinzip der Rastertunnelmikroskopie auf nicht
leitende (isolierende) Oberflächen zu übertragen. Bei dieser sogenannten
Rasterkraftmikroskopie (engl. Atomic Force Microscopy, AFM) tastet eine feine Spitze die zu
untersuchende Oberfläche ab. Wie der Name es schon nahe legt, wird also die direkte
Kraftwechselwirkung zwischen der Spitze und der zu untersuchenden Oberfläche gemessen.
Die Spitze ist über einen Federhebel (Cantilever) mit einem piezokeramischen Element
verbunden. Die Auslenkung des Federhebels durch das Profil der Oberfläche wird detektiert.
Für die Detektion der Auslenkung hat sich eine optische Methode durchgesetzt, während
diese früher über eine STM-Spitze verfolgt wurde. Bei der optischen Methode
k
Abb. 2.11: Schematische Darstellung des optischen Detektionsverfahrens für die Auslenkung des
Cantilevers (aus 108).
Methode wird der Lichtstrahl eines Lasers von der Rückseite des Hebelarms reflektiert. Der
reflektierte Strahl wird von einer meist viergeteilten Photodiode detektiert. Prinzipiell gibt es
zwei Möglichkeiten, die Auslenkung des Cantilevers zu erfassen (siehe Abb. 2.12). Der
Reflexionswinkel α wird in Abhängigkeit von der Auslenkung des Cantilevers variiert,
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
- 32 -
wodurch der Laser auf der Photodiode wandert. Die oberen und unteren zwei Felder der
Photodiode liefern durch diese Wanderung unterschiedliche Spannungswerte. Aus diesen
Werten wird ein Differenzsignal gebildet. Dieses Signal kann dann entweder direkt in ein
Höhenprofil umgerechnet werden oder eine Rückkopplungsschleife regelt das
piezokeramische Element so nach, dass die Aufdruckkraft des Cantilevers konstant bleibt. In
diesem Fall wird die Oberflächentopographie aus dem Steuerungssignal des
piezokeramischen Elements berechnet. Mit dieser Technik ist ein Auflösungsvermögen bis
hin zur atomaren Ebene erreichbar. Bei der Rasterkraftmikroskopie ist die Auflösung von
mehreren Faktoren abhängig. Den direktesten Einfluss nehmen die verwendeten
Spitzen/Federhebel, die aus Silizium, Siliziumoxid oder Siliziumnitrid (Si3N4) hergestellt
werden. Hierbei sind die Morphologie der Spitze und die Härte des Federhebels entscheidend
für die erreichbare Auflösung. Weitere Parameter, die die Auflösung entscheidend
beeinflussen können, sind vor allem Schwingungen, Schall und Temperatur. Störungen durch
Schwingungen werden durch Lagerung des Rasterkraftmikroskops auf speziellen
schwingungsgedämpften Tischen minimiert.
Die Störungseffekte durch Temperatur machen sich als “topographische Drift“ bemerkbar.
Eine solche Drift entsteht, wenn sich die Probe durch Wärme ausdehnt. In diesem Fall kann es
geschehen, dass die Spitze beim Rastern langsamer ist als die Ausdehnungsgeschwindigkeit
der Probe, wodurch eine punktuelle Auflösung nicht mehr möglich ist. Diesem Effekt kann
auf zwei Arten entgegengewirkt werden. Durch Erhöhung der Rastergeschwindigkeit ist es
möglich, die Probe schneller abzurastern, als diese sich ausdehnt.
Abb.2.12: Schematische Darstellung und REM-Aufnahme der für Rasterkraftmikroskopie
verwendeten Spitzen für (Abbildungen links) den Tapping-Modus und (Abbildungen rechts) den
Kontakt-Modus (aus 109).
Die Erhöhung der Rastergeschwindigkeit kann allerdings ebenfalls zu einer schlechteren
Abbildungsqualität führen. Die zweite Möglichkeit ist, zu warten, bis sich im gesamten
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
- 33 -
System (Mikroskop/Probe/Messraum) ein thermisches Gleichgewicht eingestellt hat. Um die
Temperatureffekte der räumlichen Umgebung zu minimieren, besteht zusätzlich die
Möglichkeit das Mikroskop mit einer speziellen Abdeckung zu versehen.
Diese Abdeckung ist ebenfalls geeignet das Mikroskop vor Störungen durch Schall zu
schützen.
Prinzipiell sind in der Rasterkraftmikroskopie drei unterschiedlichen Modi für die Betriebsart
vorhanden, der Kontakt-, der Nicht-Kontakt und der Tapping-Modus. Kontakt- und Tapping-
Modus sollen im Folgenden näher beschrieben werden.
2.9.3.3 Rasterkraftmikroskopie im Kontaktmodus
Im Kontakt-Modus wird die Spitze des Rasterkraftmikroskops direkt auf die Oberfläche der
zu untersuchenden Probe gebracht und dann über diese gerastert. Wie bereits erwähnt, kann
dabei entweder die Höhe des Cantilevers konstant gehalten werden (constant height) oder die
Kraft, mit der dieser auf die Probe gedrückt wird (engl. constant force). Die zur Auswertung
von der Photodiode aufgenommenen Spannungswerte können auf verschiedene Weisen
interpretiert werden. Zum einen kann direkt die Topographie der Oberfläche dargestellt
werden. Zum anderen treten, da die Spitze beim Rastern permanent mit der Oberfläche in
Kontakt ist, Scherkräfte auf, die zu einer Torsion des Cantilevers führen. Die
Reibungskraftmikroskopie (Friction Force Microscopy, FFM) ist ein wichtiges Werkzeug der
Nanotribologie, der Erforschung von Reibungs- und Verschleißeigenschaften von
Kontaktflächen 110. Höhensignal und Reibungssignal können gleichzeitig und unabhängig
voneinander aufgenommen werden. Beim Rasterkraftmikroskop wird jede Linie zweimal
gemessen (Vor- und Zurückbewegung des Cantilevers). Die erste Messung wird als „trace“
und die zweite als „retrace“ bezeichnet. Es kann nun beim trace das Höhensignal und beim
retrace das Reibungssignal aufgenommen werden (oder umgekehrt). Der Reibungsmodus
wird auch als Lateralkraft-Modus (LFM) bezeichnet. Die Torsion des Cantilevers beruht auf
den direkten Wechselwirkungen der Spitze mit der zu untersuchenden Probenoberfläche.
Diese Wechselwirkungen sind materialabhängig und variieren je nach Probenbeschaffenheit.
Auf diese Weise können zwei lateral strukturierte Adsorbate mit gleicher Höhe unterschieden
werden, sofern sich ihre Reibungseigenschaften unterscheiden (z.B. die
Reibungseigenschaften der funktionellen Gruppe eines OH- bzw. CH3-terminierten Thiols).
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
- 34 -
Abb.2.13: Der „Quad-Detektor“ des verwendeten Rasterkraftmikroskops der Firma Digital
Instruments. Verschiedene Segmente der Photodiode sind für die Gewinnung des Höhen- bzw.
Reibungssignals verantwortlich. Zur Gewinnung des Reibungssignals wird das Differenzsignal dCD = D
- C ausgewertet, während das Höhensignal über das Differenzsignal dAB = B - A berechnet wird 111.
Die Bilder der zwei verschiedenen Scanrichtungen (trace/retrace) sind invertiert, da die
Torsion des Cantilevers von der einen Richtung zur anderen umgekehrt wird. Die Qualität der
erhaltenen Reibungssignale ist neben den Materialeigenschaften auch vom Scan-Winkel
zwischen Spitze und Probe abhängig. Optimal ist ein Scan-Winkel, der senkrecht zum
Cantilever verläuft. Hierbei werden Kanten und kleinere Strukturmerkmale besser aufgelöst,
da der Cantilever an solchen Merkmalen eine stärkere seitliche Auslenkung erfährt.
Die Auflösung der Aufnahme eines Reibungssignals ist neben dem Scan-Winkel und den
Materialeigenschaften der Probe noch von weiteren Faktoren abhängig. Hierzu zählt zum
Beispiel die Spitzengeometrie, die Probeneigenschaften (Homogenität, Rauhigkeit) oder auch
Wasserfilme, die sich auf der Oberfläche ausbilden.
2.9.3.4 Rasterkraftmikroskopie im Tapping-Modus
Im so genannten Tapping - Modus (siehe Abbildung 2.10) wird ein besonderer Typ von
Cantilevern verwendet (Tapping Mode Cantilever, TM-Cantilever). Durch ein
piezokeramisches Element wird der Cantilever in Schwingung versetzt. Die Schwingung
erfolgt bei der Eigenfrequenz ω0 (typischerweise zwischen 50-500 kHz) und der
entsprechenden konstanten Amplitude.
Attraktive van-der-Waals-Wechselwirkungen sind in einem Abstand von 2 - 20 nm zur Probe
bestimmend. Im Tapping-Modus wird die Abhängigkeit des Van-der-Waals-Potentials vom
Abstand zur Abbildung der Oberflächentopographie ausgenutzt. Außerhalb des
Wirkungsbereiches des van-der-Waals-Potentials ist die durch Schwingung des Cantilevers
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
- 35 -
erzeugte Amplitude durch die Federkonstante des Cantilevers und die verwendete
Anregungsenergie bestimmt. Wird die Spitze an die Oberfläche angenähert, so überlagert sich
das Van-der-Waals-Potential mit dem Spitzenpotential.
Abb.2.15: Schematischer Aufbau eines Rasterkraftmikroskops im Tapping-Modus. Diese Art der
Mikroskopie ist hochempfindlich und fast vollkommen kontaktfrei, da bei optimaler Einstellung der
Parameter nur eine sehr kurze und leichte Berührung mit der Probe stattfindet 108.
Dies führt zu einer Erniedrigung der Resonanzfrequenz und zur Abnahme der Amplitude der
Schwingung bei ω0. Die Schwingungsamplitude stellt also ein Maß für den Abstand der
Spitze zur Probe dar. Der von dem Cantilever reflektierte Laserstrahl bewegt sich auf der
Photodiode mit der Schwingungsfrequenz des Cantilevers auf und ab. Diese Auslenkung ist
ein Maß für die Schwingungsamplitude. Das erhaltene Signal ist das eigentliche Messsignal,
welches ständig mit einem vorgegebenen Messwert (engl. setpoint) verglichen wird. Die
Software berechnet aus der minimalen und maximalen Auslenkung auf der Photodiode die
RMS-Amplitude (root mean square amplitude) nach folgender Gleichung:
( ) ( )2
22 max,Signalmin,SignalAmplitudeRMS +=− (2.1)
Dieser Wert wird über bestimmte Parameter vor Beginn der Messungen vom Nutzer des
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
- 36 -
Gerätes eingestellt (Sollwert - Setpoint). Ein Rückkopplungsmechanismus hält diesen Wert
während der Messung über Regulierung eines piezokeramischen Elements konstant. Die
hieraus resultierenden Steuersignale des piezokeramischen Elements dienen der Software zur
Abbildung der Oberflächentopographie. Neben dem Höhensignal, welches über die
Schwingungsamplitude definiert ist, kann auch ein Phasensignal ausgewertet werden. Dieses
Signal gibt die Phasenverschiebung von der Schwingungsanregung und der real ausgeführten
Schwingung des Cantilevers wieder. Diese Phasenverschiebung hängt von verschiedenen
Eigenschaften der Probe ab (Zusammensetzung, Reibung, Härte, Adhäsionseigenschaft),
weshalb -wie im Lateralkraft-Modus des Kontakt-Modus- unterschiedliche Materialien bei
gleicher Höhe unterschieden werden können. Wie das Höhen- bzw. Reibungssignal im
Kontakt-Modus können auch Höhen- und Phasensignal zur gleichen Zeit an der gleichen
Probenstelle gemessen werden, in dem z.B. das Höhensignal beim trace und das Phasensignal
beim retrace gemessen wird. Da bei der Rasterkraftmikroskopie im Tapping-Modus
Scherkräfte eliminiert und vertikal wirkende Kräfte minimiert werden, ist diese Methode
besonders für die Untersuchung von empfindlichen Materialien - wie biologische Oberflächen
- oder instabilen Oberflächenstrukturen (z.B.: kleine Partikel) von Interesse 106,112-115. Eine
Veränderung der Probe durch die Messung kann aber auch bei dieser Methode nicht
ausgeschlossen werden 116. In Abbildung 2.16 ist beispielhaft ein AFM Bild dargestellt bei
dem eine strukturierte Proteinschicht in dest. Wasser mit Tapping-AFM gemessen wurde. Das
zugehörige Linienspektrum zeigt sehr schön die zur Strukturierung gehörenden Dimensionen.
Abb.2.15: Darstellung eine strukturierten Proteinfilms mittels Tapping-AFM in dest. Wasser. Im
Topgraphiemoduskann sehr schön die laterale Strukturierung der Oberfläche erkannt werden,
während im Linienspektrum (links) die Höhe der gemessenen Struktur ermittelt werden kann.
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
- 37 -
2.9.4 Infrarot-Spektroskopie
Bei Bestrahlung mit infrarotem Licht gehen Moleküle durch Absorption in einen höheren,
angeregten Zustand über, indem es zu Schwingungen angeregt wird. Diese Absorption findet
nur dann statt, wenn sich das Dipolmoment der betreffenden Molekülgruppe während der
Schwingung ändert. Die Intensität der Absorptionsbande ist dabei proportional zur Änderung
des Dipolmoments relativ zum Gleichgewichtszustand. Bei Deformations- und
Biegeschwingungen geschieht diese Änderung durch Modifizierung der Bindungswinkel, bei
Streckschwingungen hingegen durch Veränderung der Bindungslängen. Die Frequenz, bei der
eine Schwingung absorbiert, hängt von vielen verschiedenen Faktoren ab. Diese sind die
Kopplung mit anderen Molekülschwingungen, die reduzierten Massen der beteiligten Atome,
die Bindung zu Nachbaratomen, die Kopplung mit anderen Molekülschwingungen und
natürlich die Art der Bindung selbst (z.B.Kraftkonstante). Infrarot-Vibrationsspektren sind
daher sehr sensitiv gegenüber der chemischen Umgebung einer Bindung oder eines Moleküls
und daher auch sehr selektiv.
Vibrationspektren selbst-assemblierter Monolagen auf Metalloberflächen unterliegen neben
den schon erwähnten Kriterien noch der Oberflächenauswahlregel. Diese Auswahlregel
besagt, dass in der Nähe elektrisch leitender Oberflächen -wie z. B. einer Goldoberfläche- alle
Feldkomponenten des anregenden elektrischen Feldes, die parallel zur Oberfläche orientiert
sind, unterdrückt werden. Die einfallende anregende p-polarisierte IR-Lichtwelle kann in
einen tangentialen und einen normalen Anteil aufgespalten werden. Tangential zur Oberfläche
wirkende elektrische Felder führen zur Verschiebung von oberflächennahen Ladungsträgern,
bis das äußere tangentiale Feld kompensiert ist. Der normale Anteil des elektrischen Feldes
erzeugt ebenfalls eine Spiegelpolarisation, die sich allerdings zum äußeren Feld konstruktiv
addiert. Vornehmlich werden bei der IR-Spektroskopie an einer leitenden Oberfläche
Molekülschwingungen mit einem zur Oberfläche senkrechten Übergangsdipolmoment
angeregt. Ein Volumenspektrum zeigt daher die vollständige Anzahl an Absorptionsbanden,
während im zugehörigen Oberflächenspektrum aufgrund der zuvor diskutierten Effekte
einzelne oder mehrere Absorptionsbanden fehlen können.
Insgesamt besitzen n-atomige gewinkelte moleküle 3n-6 Freiheitsgerade der Bewegung. Bei
Proteinen 8und anderen komplexeren Biomolekülen) bedeutet dies eine sehr große Anzahl
einzelner Schwingungsbanden. Somit ist eine Unterscheidung einzelner Schwingungen nur
schwer möglich. Es treten trotzdem eine Reihe charakteristischer Banden auf, aus denen man
Informationen über Struktur und Wechselwirkungen des Proteins sammeln kann (Amid-A-
Bande und Amid-I bis Amid-IV Bande). Die bestuntersuchteste Bande ist dabei die Amid-I-
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
- 38 -
Bande (~1650cm-1), der im Wesentlichen die C=O-Streckschwingung zugrunde liegt. Da die
C=O- und N-H-Gruppen der proteine an der Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen
in der α-helikalen und β-Faltblatt-Struktur beteiligt sind, stellt das Peptidrückgrat eine Reihe
gekoppelter Oszillatoren dar. Damit hängen frequenz und Bandenform der IR-Banden stark
von der Sekundeärstruktur des Proteins ab 117.
Die IR-Spektroskopie bietet zudem folgendem Vorteil: Im Gegensatz zu anderen
strukturaufklärenden Methoden kann auf den Einsatz von Sonden (z.B. ESR oder
Fluoreszenz-Mikroskopie) verzichtet werden, was sonst unter Umständen zu unerwünschten
Artefakten führen könnte.
2.9.5 Röntgen-Photoelektronenspektroskopie
Die Röntgen-Photoelektronenspektroskopie (X-ray photo electron spectroscopy, XPS) beruht
auf dem erstmals von Einstein richtig gedeuteten photoelektrischen Effekt. Setzt man eine
Probe elektromagnetischer Strahlung genügend hoher Energie aus, so werden Elektronen
(Photoelektronen) aus dem Material herausgelöst. Bei ultraviolettem Licht (UPS) werden nur
Valenzelektronen herausgelöst, bei Röntgenstrahlung (XPS; Photonenenergien: AlKα=1486,
6eV; MgKα=1253,6eV) ist die Energie hingegen ausreichend, um Kernelektronen ins
Vakuum zu beschleunigen. Das Loch in der inneren Schale wird durch ein Elektron aus einer
äußeren Schale gefüllt. Die bei diesem Prozess frei werdende Energie wird als
Röntgenstrahlung oder durch Emission eines Auger–Elektrons, welches zu charakteristischen
Auger–Peaks führt (AES), abgegeben. Mit einem Analysator wird die kinetische Energie
(Ekin) der Photoelektronen bestimmt, die Auflösung wird dabei von der Passenergie (Epass) des
Analysators beeinflusst. Über Gleichung 2.2 kann dann die Bindungsenergie (EB) der
Elektronen berechnet werden:
Ekin = hν − EB − eφ; mit φ=Austrittsarbeit (2.2)
Da die Bindungsenergien charakteristisch für jedes Element sind, kann man die chemische
Zusammensetzung einer Probe analysieren. Ausserdem können auf Grund der chemischen
Verschiebung der Signale 118 Aussagen über die chemische Umgebung eines Atoms getroffen
werden. Neben der rein qualitativen Analyse ist es auch möglich, die quantitative
Zusammensetzung einer Probe (Stöchiometrie) zu berechnen. Dies kann über die Auswertung
der Intensitäten, dIA, geschehen:
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
- 39 -
dIA∝TA*σA · nA(z) · e− (z/λe·cosΘ)dz. (2.3)
Die Anzahl der Atome in der Matrix ist mit nA bezeichnet; λe ist die mittlere freie Weglänge
der Elektronen 119 im jeweiligen Material. σ ist der Scofield-Faktor40, der den
Absorptionsquerschnitt des jeweiligen Orbitals wiedergibt, und TA ist die Apparatefunktion,
die u.a. von der Passenergie und der Messgeometrie abhängt. Werden Intensitäten ins
Verhältnis gesetzt, so sind die unter Vernachlässigung von TA erhaltenen Werte in der Regel
mit einem Fehler von 10 % – 20 % behaftet 120.
Um den Bedeckungsgrad des Substrats mit einem Adsorbat abzuschätzen, kann man die
Abschwächung eines Substratpeaks durch das Adsorbat untersuchen. Des Weiteren kann die
kann die Schichtdicke bestimmt werden, wenn man die jeweiligen Grenzintensitäten für dicke
Adsorbatschichten und zusätzlich den Bedeckungsgrad kennt.
2.9.6 Röntgenabsorptionsspektroskopie
Auch die Röntgenabsorptionsspektroskopie (Near Edge X-ray Absorption Fine Structure;
NEXAFS). beruht auf dem photoelektrischen Effekt. Bei der Anregung von Rumpfelektronen
eines Atoms durch Photonen mit Energien im Röntgenbereich enstehen die sogenannten
Röntgenkanten (K, L, M, ...). Die Wahrscheinlichkeit für die dafür verantwortliche Anregung
von Elektronen in das Vakuumniveau wird beschrieben durch den photoelektrischen
Röntgenabsorptionskoeffizienten:
µ≈Zx/E3; mit µ=Röntgenabsorptionsquerschnitt, Z=Ordnungszahl, E=Photonenergie (2.4)
Die Abhängigkeit von der Ordnungzahl des angeregten Atoms und der Energie der
anregenden Strahlung ist aus Gleichung (2.4) zu entnehmen. Die Untersuchung dieses
Absorptionskoeffizienten erlaubt Aussagen über die elektronische Struktur des Adsorbat-
Substrat-Systems sowie den Bindungscharakter und die geometrische Orientierung der
adsorbierten Moleküle.
Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole
- 40 -
3 Die biologische Aktivität oberflächengebundener Mehr-
schichtensysteme: das Biotin- Streptavidin-Peroxidase System
Die starke Bindung zwischen Biotin und biotinbindenden Proteinen (z.B. Avidin, Streptavidin
oder anti-Biotin Antikörper) wird zum Aufbau supramolekularer Strukturen89, 90 benutzt. Die
kovalente oder nicht-kovalente Bindung von Biomolekülen (DNA121-124, Proteine/Enzyme 125-
127 wird in vielen Arbeitsgruppen angewandt und gilt als routinemäßiger Prozess für
analytische Anwendungen 128-130. In diesen Assays dient das Strepatvidin als “Andocklage“
für biotinylierte Analyte und/oder als System zur Signalvertärkung (siehe Abb.3.1). Dabei
werden die meisten Assays auch heutzutage noch im Volumen und nicht an der Oberfläche
durchgeführt. Die Herstellung biotinylierter Oberflächen bietet also die Möglichkeit, weitere
biotinylierte Moleküle an die Oberfläche zu binden, um Schritt für Schritt
Mehrschichtensysteme aufzubauen.
Abb.3.1: Schematischer Aufbau eines Mehrschichtsystems auf Basis der Streptavidin/Biotin-Bindung.
In diesem Fall wurde ein weiteres Protein mit einem Biotinanker versehen (biotinylierte
Meerrettichperoxidase) und an die bereits adsorbierte Streptavidinschicht angelagert.
Beim Aufbau solcher Mehrschichtensysteme kommt es neben der Bindung and die jeweilgen
Biotinmotive auch zu unspezifischen Bindungen der Biomoleküle untereinander oder an die
nicht biotinylierten Bereiche der Oberfläche. Die Kontrolle dieser unspezifischen Adsorption
ist ein wichtige Frage in der modernen Medizin, wie z.B. in der Zellkultivierung 131 oder der
Beschichtung von Implataten 132, 133. Oft wird dabei die total adsorbierte Menge an
Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole
- 41 -
unspezifisch adsorbiertem Protein bestimmt (SPR 98, AFM 134, Fluoreszenz 35). Eine wichtige
Frage ist aber auch, ob unspezifisch adsorbierte Proteine ihre biologischen Funktionen
aufrechterhalten können. In den meisten Fällen führt die unspezifische Adsorption der
Proteine zur Denaturierung, wodurch die biologischen Funktionen verloren gehen sollten.
Eine Bestimmung der Aktivität unspezifisch adsorbierter Proteine ist also von großem
Interesse für die heutige Medizin.
Als Modellprotein wurde in dieser Arbeit eine Peroxidase gewählt (horse radish peroxidase,
HRP), da sowohl die Struktur als auch der enzymatische Mechanismus dieses Enzyms gut
bekannt sind 135. Des Weiteren sind Peroxidasen als Indikatorenzyme weit verbreitet (z.B.
ELISA Assays), wodurch alle benötigten Substanzen kommerziell erhältlich sind (z.B.:
SIGMA P9568 und T8665). Die enzymatische Aktivität wird dabei über eine Farbreaktion
nachgewiesen. Das farblose Chromogen 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) wird dabei von
der Peroxidase in ein blaues Zwischenprodukt (TMB Ladungstransfer-Komplex) überführt.
Nach Zugabe einer säureghaltigen (H2SO4) “Stoplösung” wird die enzymatische Reaktion
beendet und der Ladungstransfer-Komplex geht in einen gelben Farbstoff 3,3',5,5'-
Tetramethyl 1,1-4,4 Diimin) über, der im Photometer bei 450nm detektiert werden kann. Der
gesamte Reaktionsmechanismus 136 ist in Abbildung 3.2 dargestellt.
Abb.3.2: Mechanismus der Farbreaktion von TMB, die von der HRP katalysiert wird. Das TMB wird
oxidiert und es wird ein Ladungstransfer-Komplex (im Gleichgewicht zum entsprechenden Radikal-
Kation) erhalten. Die Zugabe von Säure führt zum Farbstoff Tetramethyldiimin 136.
Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole
- 42 -
3.1 Präparation der Substrate
3.1.1 Substrate für die SPR-Messungen
D263T Dünnglas (Schott AG) mit den Dimensionen 10mmx10mmx0,3mm wurden mit abs.
Ethanol (Riedel de Haën) gewaschen und im Stickstoffstrom getrocknet. Anschließend
wurden die Glasscheiben in einen Metallverdampfer (Leybold Inficon XTC/2) eingebaut.
Dann wurde zuerst eine Lage von 12Å Titan mit einer Rate von 1 Ås-1 aufgedampft, damit die
Haftung des anschließend aufgedampften Goldfilms erhöht wird. Der Goldfilm wurde mit
einer Rate von 15Ås-1 aufgedampft, bis eine Schichtdicke von 485Å erreicht war. Die
Bedampfung erfolgte bei Raumtemperatur und einem Druck von 10-7 mbar.
Abb.3.3: Darstellung der in diesem Kapitel verwendeten Thiole. Die OH-Thiole wurden zum
verdünnen des Biotin-Thiols verwendet.
Nach dem Bedampfen wurden die Goldsubstrate zuerst mit Ethanol gewaschen und
anschließend für 48h in eine ethanolische Lösung eingelegt, welche aus einer Mischung OH-
und biotin-terminierten Thiol (s. Abbildung 3.3) bestand. Die Konzentration an Thiol wurde
konstant bei 1mM gehalten, während die relative Konzentration an Biotinthiol von 0 bis
100 Mol-% variiert wurde. Anschließend wurden die so präparierten Substrate mit abs.
Ethanol gewaschen und im Stickstoffstrom getrocknet. Anschließend wurden sie mit
doppelseitigen Klebeband (tape 415, 3M) auf Plastik-Chips (Biacore) fixiert. Auf diese Weise
wurden auch alle weiteren Oberflächenterminierungen (z.B. Oktadekanthiol, Abbildung 3.1)
hergestellt. Die Herstellung der Substrate sowie die Messungen erfolgten in Kooperation mit
Herrn Dr. Ch. Grunwald.
Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole
- 43 -
3.1.2 Substrate für die AFM Messungen
Die Bedampfung und Präparartion der Goldsubstrate erfolgte wie in Kapitel 3.1.1
beschrieben. Anstelle der Glaswafer wurden polierte Siliziumwafer mit einer (100)
Oberflächenterminierung (Prolog Semicor LTD, Ukraine) benutzt. Vor dem Bedampfen
wurden diese mit abs. Aceton (Fluka) and Ethanol (Riedel-de Haën) gewaschen und im
Stickstoffstrom getrocknet. Das Titan wurde bis zu einer Dicke von 80Å mit einer Rate von
2Ås-1 aufgedampft; anschließend wurde eine Lage von 1200Å Gold mit einer Rate von
15Ås-1 aufgedampft. Die goldbeschichteten Siliziumwafer wurden in Stücke von
10mmx10mm geschnitten. Die Funktionalisierung und Herstellung der SAMs erfolgte über
Mikrokontaktstempeln (micro contact-printing, µCP).
3.1.2.1 Mikrokontaktstempeln (µCP)
Die im vorigen Abschnitt hergestellten Goldwafer wurden anschließend mittels µCP 137
lateral strukturiert. Wie im Kapitel 2.9.1 beschrieben, wurde ein Stempel aus
Polydimethylsiloxan (PDMS) hergestellt (siehe Abbildung 3.4). Für die vorliegende Arbeit
wurde ein Siliziumwafer als Master benutzt, dessen periodische Struktur aus Quadraten (3µm
Seitenlänge) besteht. Die Quadrate sind dabei in x- und y-Richtung jeweils 3 µm vom
nächsten Quadrat entfernt.
Abb.3.4: REM-Aufnahmen des verwendeten Stempeltyps. Die Stempelflächen sind“quadratisch“ und
besitzen eine Seitenlänge von 3µm. Die Stempel sind wegen der besseren Stabilität nur 800nm hoch.
Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole
- 44 -
Zum Stempeln wurde der PDMS-Stempel für 30s mit 30µl einer 1mM ethanolischen OEG(6)-
Thiollösung (Struktur siehe Abbildung 3.2) beladen. Der Überstand wurde vorsichtig mit
einem fusselfreien Tuch entfernt und der Stempel im Stickstoffstrom getrocknet.
Anschließend wurde der Stempel vorsichtig auf die Goldoberfläche gedrückt. Nach 90s wurde
der Stempel vorsichtig wieder entfernt und die Goldwafer mit abs. Ethanol gespült und unter
Stickstoff getrocknet. Anschließend wurden die Wafer für 90s in eine 1mM ethanolische
Lösung aus OH- und Biotinthiol (10% in Bezug auf das Biotinthiol) eingelegt.
Nach der Inkubation wurden die lateral strukturierten SAMs mit abs. Ethanol gewaschen und
im Stickstoffstrom getrocknet.
3.1.3 Substrate für die Aktivitätstests
Die Präparation der Substrate erfolgte wie in Abschnitt 3.1.1 beschrieben. Anstelle der D263T
Glasscheiben wurde konventionelles Mikroskopieglas (BK7, Menzel, 76mmx76mmx1mm)
verwendet. Nach dem Bedampfen wurden die Scheiben in Stücke von 2mmx2mmx10mm
geschnitten und wie im Kapitel 3.1.1 beschrieben inkubiert. Nach der Inkubation wurden die
Proben mit abs. Ethanol gewaschen und im Stickstoffstrom getrocknet.
3.2 Oberflächenplasmonenresonanz-Messungen Für die SPR-Messungen wurde ein kommerzielles Spektrometer verwendet (Biacore 3000).
Für die Experimente wurde eine 200nM Lösung von Streptavidin in einem Phosphat-Puffer
verwendet. Der Phosphatpuffer bestand dabei aus 0,1 M K2HPO4 (SIGMA), 0,1 M KH2PO4
(SIGMA), 300 mM NaCl (Baker). Der pH wurde mit NaOH und HCl auf 6,0 eingestellt.
Abb. 3.5: Darstellung des für die Peroxidse verwendeten Biotinankers 6-(6-(5-(hexahydro-2-oxo-1H-
thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanamido)hexanamido)hexanoic acid (Trvialname: Biotinamidocaproyl).
Zur Herstellung der Lösungen wurde hochreines Wasser aus einem MilliQ-System
verwendet. Der Puffer wurde zudem nach Fertigstellung nochmal durch sterile Filter
(Porengröße: 0,2µm) gefiltert, anschließend entgast und bis zur Verwendung bei 4°C gelagert.
Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole
- 45 -
Die SPR Experimente wurden bei Rauntemperatur durchgeführt. Das zum Einsatz
gekommene Streptavidin ist kommerziell erhältlich (Invitrogen) und enthält einen
Fluoreszenzmarker (Alexa-fluor-488). Die verwendete biotinylierte Meerrettichperoxidase ist
ebenfalls kommerziell erhältlich (SIGMA; P-9568). Der Biotinanker besteht bei dieser
Peroxidase aus einem Biotinamidocaproyl.
3.2.1 Variierung der Biotinthiol-Konzentration
Die Adsorption des Streptavidins erfolgt wie bereits erwähnt an einen SAM, der aus einer
Mischung von Biotinthiol und 11-mercapto-Undekanol (OH-Thiol) besteht. Daher wurde
zuerst untersucht, welches Mischungsverhältnis für die Adsorption des Streptavidins optimal
ist. Hierzu wurden Proben hergestellt, die unterschiedliche Konzentrationen an Biotinthiol
enthielten. Anschließend wurde Streptavidin für 900s inkubiert. Die relative Konzentration an
Biotin wurde dabei von 0 bis 100mol-% variiert. In Abbildung 3.3 sind die Ergebnisse dieser
Messungen zusammengefasst. Eine optimale Mischung ergibt sich somit bei 5% Biotinthiol
0 20 40 60 80 100
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
SA
Ads
orpt
ion
[RU
]
SA A
dsor
ptio
n [n
g/cm
2 ]
Mol% - Biotinthiol
Abb.3.6: Adsorption von Streptavidin (c=200nM) auf unterschiedlich biotinylierte SAMs nach einer
Inkubationszeit von 15min. Die Fehlerbalken zeigen die Streuung von je 4 Messungen. Die
Biotinmenge bezieht sich auf eine binäre Lösung mit dem OH-Thiol.
Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole
- 46 -
und 95% OH-Thiol. Eine weitere Erhöhung der Biotinthiol-Konzentration führt zu einer
verminderten Adsorption an Streptavidin. Umgekehrt führt auch eine Verminderung der
relativen Biotinthiol-Konzentration zu einer Verringerung an adsorbiertem Streptavidin. Der
erste Fall (Biotin-Mol-% >5%), ist in der Literatur bekannt und wird sterischen Effekten
zugeordnet 138. Der zweite Fall (Biotin-Mol-% <5%) führt dazu, dass die Bindungsstellen für
das Streptavidin mehr und mehr verarmen. Dies führt dann zu der verminderten (spezifischen)
Adsorption. Im Bereich der niedrigen Konzentration an Biotinthiol ist die Menge an
unspezifischer Adsorption stark abhängig von den Bedingungen unter denen die Experimente
stattgefunden haben. Dabei spielt sowohl das Handling (Staubpartikel oder andere kleinste
Verunreinigungen der Lösungen oder der verwendeten Geräte), als auch die Inkubationszeit
der SAM-Herstellung eine entscheidende Rolle. Bei geringen Inkubationszeiten ist die
Ordnung im SAM geringer, wodurch die unspezifische Adsorption verstärkt wird (5min:
(24,9±0,8)ng/cm2; 2 Tage: (4,6±1,1)ng/cm2)139.
Die Kontrolle der Streptavidin-Adsorption über die relative Konzentration an Biotinthiol ist
nicht trivial und es müssen unangenehme Nebeneffekte beachtet werden.
Zuerst einmal stehen die Ergebnisse in guter Übereinstimmung mit in der Literatur
veröffentlichten Studien 138, in denen ähnliche Ergebnisse erhalten wurden.
Aus dem in Abbildung 3.3 eingezeichneten linearen Fit (gepunktete Linie; R2=0,975) kann
eine Veränderung der Adsorption von 153ng/cm² pro Mol-% Biotinthiol abgeleitet werden.
Dieser hohe Wert zeigt eindeutig, dass eine genaue Kontrolle der total adsorbierten
Streptavidin-Menge über die Variation der relativen Biotinthiol-Konzentration nicht möglich
ist. Schon kleine Änderungen der gewünschten Biotinthiol-Konzentration durch z.B.
Verdampfen des Lösungsmittels oder Adsorption von Molekülen an die Gefäßwand führen zu
starken Veränderungen der total adsorbierten Menge an Streptavidin. Hier wird ein
allgemeines Problem deutlich, wenn mit stark verdünnten Lösungen gearbeitet wird. Der
Verlust von Molekülen z.B. durch unspezifische Adsorption (z.B. an Gefäßwände),
Staubpartikel und Unreinheiten ist schwer zu quantifizieren.
Vorangegangene Arbeiten 140 zeigten zudem, dass das molare Verhältnis von koadsorbierten
Thiollösungen nicht immer mit den molaren Gleichgewichtsverhältnissen der gebildeten
SAMs übereinstimmmen.
3.2.2 Kontrolle der Streptavidinbelegung
Als Alternative zur Variierung der Biotinthiol-Konzentration wurde versucht, die Adsorption
über Diffusion (konzentration der Lösung bzw Inkubationszeit) zu kontrollieren. Hierzu
Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole
- 47 -
wurde die Konzentration an Biotinthiol konstant gehalten. Die Konzentration der
Streptavidinlösung (25 und 50 nM) sowie die Inkubationszeit wurden variiert. Zur Kontrolle
der Bindung wurden folgende Experimente durchgeführt: Als „Positiv“-Kontrolle wurde die
biotinylierte Peroxidase (bHRP) direkt auf die mit Streptavidin inkubierte Oberflche gegeben;
als „Negativ“-Kontrolle (unspezifische Adsorption der bHRP) wurde die mit Streptavidin
beladene Oberfläche zuerst mit D-Biotin abgesättigt und anschließend die bHRP inkubiert.
Zusätzlich wurde die unspezifische Adsorption von Streptavidin und bHRP auf einem reinen
OH-terminierten SAM charakterisiert.
3.3.2.1 Echt-Zeit Adsorptionskinetik von Streptavidin
Die Bindung von Streptavidin an einen Biotinthiol-SAM ist in Abbildung 3.4 dargestellt. Es
ist schnell ersichtlich, dass die Adsorption ein Prozess mit 2 Phasen ist. Der erste Teil der
Streptavidin-Adsorption ist stark linear. Dieser lineare Teil geht dann in einen exponentiellen
Teil über, indem die Adsorption immer mehr abnimmt, bis die Oberfläche vollständig
abgesättigt ist. In Langzeitexperimenten wurden die mit Streptavidin beladenen Oberflächen
mit Puffer gespült (Laufzeit >1Stunde). Hierbei ging ein kleiner Teil der adsorbierten
Moleküle auf Grund von Dissoziation wieder verloren (Mdis≈2,5%).
Tab.3.1: Vergleich des 1-und 2-fach exponentiellen Fits für die nicht lineare Phase der Streptavidin-
Kinetik. Vor dem Fitten wurde die Kinetik normiert und besitzt daher keine Dimension mehr.
1-fach exponentieller Fit, R2 = 0,873 y = a * (1 – exp(-b*x)) a 0,9350 +/- 0,0028 b/s-1 0,0212 +/- 0,00004 2-fach exponentieller Fit, R2 = 0,997 y = a*(1-exp(-b*x)) + c*(1-exp(-d*x)) a 0,5397 +/- 0,0031 b/s-1 0,0814 +/- 0,0011 c 0,4613 +/- 0,0025 d/s-1 0,0062 +/- 0,0001
Die lineare Phase zeigt ein diffusionslimitiertes Verhalten für die Strepatividin-Adsorption.
Die Bindung des Strepatavidins erfolgt im Vergleich zur Diffusion des Streptavidins in der
Lösung sehr schnell. Dies führt zu einem Bereich, in dem die Streptavidin-Konzentration
verarmt ist. Dies wiederum bedeutet, dass die Adsorption über den Massentransfer
kontrolliert wird. Im nicht linearen Teil der Kinetik liefert erst ein 2-fach exponentieller
Ansatz einen guten Fit. Tabelle 3.1 fasst die 1- und 2-fach exponentiellen Ansätze zusammen.
Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole
- 48 -
Dabei ist zu beachten, dass die Kinetikdaten zuerst normiert wurden und daher dimensionslos
sind.
Abb.3.7: Detaillierte Analyse der 2 Phasen der Adsorptionskinetik von Strepatvidin (5% Biotinthiol,
200nM Streptavidin). Vor dem Fitten wurde die Kinetik normiert. Die lineare Phase macht 80% der
Kinetik aus, während die restlichen 20% ein 2-fach exponentielles Verhalten zeigen.
Als Startpunkt für den exponentiellen Fit wurde der Punkt gewählt, der als erstes vom
linearen Fit abwich. Diese zweite Phase ist entsprechend schwierig zu interpretieren. Es ist
klar, dass sie durch zwei verschiedene Prozesse bestimmt wird, die beide verschiedenen
Zeitkonstanten folgen. Die Prozesse selbst eindeutig zu bestimmen, ist aus den Kinetikdaten
allerdings nicht möglich. Im einfachsten Fall kann man aber annehmen, dass es sich bei den
beiden Prozessen zum einen um die spezifische Adsorption des Streptavidins an die
Biotinthiole und zum anderen die unspezifische Adsorption des Streptavidins an die OH-
terminierten Bereiche der Oberfläche handelt.
Zusammengefasst kann die Adsorption durch das folgende einfache Modell dargestellt
werden: 80% der Streptavidin-Adsorption folgen einem linearen Verlauf mit einer
Diffusionsrate von 0,0049s-1. 20% der Streptavidin-Adsorption folgen einem 2-fach
exponentiellen Verlauf. Während die Amplituden des nicht linearen Fits fast gleich sind (0,54
zu 0,46; Parameter a und c aus Tabelle 3.1 für den 2-fach exponentiellen Fit), unterscheiden
Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole
- 49 -
sich ihre Diffusionsraten sehr stark (0,081s-1 zu 0,006s-1; Parameter b und d aus Tabelle 3.1
für den 2-fach exponentiellen Fit). Nimmt man nun an, dass die spezifische Adsorption
schneller verläuft als die unspezifische, kann der erste Term der spezifischen und der zweite
Term der unspezifischen Adsorption zugeteilt werden.
Dies ist allerdings nur ein sehr einfaches Modell, da es weitere Phänomene gibt, die mit der
unspezifischen Adsorption einhergehen (z.B. Denaturierung oder andere strukturelle
Umordnungen) und ebenfalls sehr schnell verlaufen 5, 141. Eine genaue Erklärung der
-500 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 35000
102030405060708090
100110120130140150
Puffer
Streptavidin
2
1d
1c1b
1a
200 nM Streptavidin 100 nM Peroxidase
Ads
orpt
ion
[RU
]
Zeit [s]
Abb.3.8: Die obere Kurve zeigt die unspezifische Adsorption von Streptavidin auf einem SAM aus
OH-Thiol (1a-1c) und die Bindung von bHRP auf dem unspezifisch adsorbierten Streptavidin (1d). In
der unteren Kurve (2) ist die unspezifische Adsorption von bHRP auf dem OH-Thiol SAM dargestellt.
exponentiellen Terme, die mit den verschiedenen Adsorptionsphänomenen einhergehen, kann
daher nicht dargelegt werden. Das dargestellte Modell liefert eine gute Übereinstimmung mit
den Adsorptionskinetiken für die unspezifische Adsorption (siehe Abb.3.8) und den
Ergebnissen aus den AFM-Experimenten (siehe Kapitel 3.2).
3.3.2.2 Diffusionslimitierte Streptavidinbeladung
Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole
- 50 -
Abbildung 3.9 zeigt die Ergebnisse für die diffusionslimitierte Adsorptionskinetik des
Streptavidins. Die geringen Oberflächenbeladungen von 325-1273RU wurden über Lösungen
0 200 400 600 800
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
m(ads)
Streptavidin 200 nM Streptavidin 50 nM Streptavidin 25 nM
325
641
97412731448
18942072
Ads
orpt
ion
[RU
]
Zeit [s]
2320
Abb.3.9: Diffusionslimitierte Adsorption des Streptavidins auf den biotinylierten SAM. Die
Immobilisierungsdichte kann kontrolliert werden; m(ads) ist dabei die total adsorbierte Menge an
Protein.
erhalten, die eine Konzentration von 25nM Streptavidin enthielten. Die Inkubationszeit wurde
dabei von 34-109sek. variiert. Die höheren Streptavidinbeladungen von 1448-2072RU
wurden mittels 50nM-Lösungen von Streptavidin erhalten. Auch die Inkubationszeiten
wurden auf 102-170sek erhöht. Zum besseren Vergleich wird in Abbildung 3.6 die bereits
besprochene Adsorptionskurve (cStrep=200nM), die zur maximalen Beladung führt, nochmals
gezeigt. Alle Kinetiken zeigen einen unterschiedlichen Verlauf während der Adsorption. Dies
ist auf Instabilitäten der sehr gering konzentrierten Lösungen zurückzuführen. Auch wenn für
jedes Experiment (Zeitskala: 1-2 Stunden) die Proteinlösung frisch angesetzt wurde, kommt
es zur Adsorption der Proteine aus den gering konzentrierten Lösungen an die Gefäßwände
der verwendeten Geräte. Ebenfalls verdampft ein Teil des Lösungsmittels. Obwohl diese
beiden Phänomene gegenteilige Effekte haben, heben sie sich nicht genau gegenseitig auf. Es
konnte beobachtet werden, dass sich die Verarmung der Proteinkonzentration (durch
Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole
- 51 -
Adsorption an Gefäßwände) stärker auswirkt als der Effekt der Aufkonzentrierung durch
Verdampfen des Lösungsmittels. Auch für die beiden Kurven mit der größten Beladung an
Streptavidin kann am Ende der Streptavidin-Injektion eine Abweichung vom linearen
Verhalten beobachtet werden. In beiden Fällen wird die Adsorptionsgeschwindigkeit gesenkt,
da es immer weniger freie Bindungsstellen gibt, die erst noch gefunden“ werden müssen,
während vorher jedes Molekül Streptavidin sofort an die Oberfläche binden konnte.
Effektiv kann bei entsprechend vorsichtigem Handling die Beladungsmenge von Strepavidin
an der Oberfläche durch entsprechende Auswahl der Streptavidin-Konzentration und der
Inkubationszeit mit einer Genauigkeit von weniger als 5% bestimmt werden.
3.2.3 Unspezifische Adsorption der Proteine auf einem OH-terminierten SAM
Die unspezifische Adsorption der verwendeten Proteine auf einem OH-terminierten SAM
wurde bereits dargestellt (Abbildung 3.5; Streptavidin 1a-1c; bHRP 2). Auch die Adsorption
von bHRP auf einem mit nativem d-Biotin gesättigten Streptavidinfilm ist in Abbildung 3.5
(1d) zu sehen. Die Inkubationszeit der einzelnen Schritte betrug dabei immer 5 Minuten. Die
Mehrfachinkubation im Falle des Streptavidins wurde durchgeführt, um auch die
unspezifische Adsorption von Streptavidin auf Streptavidin zu zeigen. Die
Gesamtinkubationszeit ist dabei genauso lang (15min) wie für die Experimente der
spezifischen Adsorption von Streptavidin auf dem 5%-igen Biotinthiol SAM (siehe auch
Abbildung 3.4). Die Peroxidase wurde dann für 4 Minuten injiziert. Die beobachtbare
unspezifische Adsorption der beiden Proteine ist schwach (Mads≤10RU), aber dennoch
deutlich erkennbar.
3.2.4 Das Streptavidin/bHRP-System
Die unspezifische Adsorption der biotinylierten Peroxidase auf die OH-terminierten Bereiche
der Oberfläche kann durch die Stärke der Streptavidinbelegung beeinflusst werden.
Desweiteren kann die biotinylierte Peroxidase auch unspezifisch direkt auf die
Streptavidinschicht adsorbieren. beide Fälle wirken sich auf die Adsorptionskinetik der
biotinylierten peroxidase aus, was im folgendem näher betrachtet werden soll.
3.2.4.1 Adsorption der Peroxidase
Die Kinetik für die Adsorption der Peroxidase auf verschieden starken Streptavidin-
Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole
- 52 -
Adsorbatschichten ist in Abbildung 3.7 gezeigt. Die Adsorption der Peroxidase (c=100nM)
-100 0 100 200 2000 2200 2400
0
200
400
600
800
1000
81175284358430
735740
bHR
P-A
dsor
ptio
n [R
U]
Zeit [s]
896956
800793
480
413320
19696
-6%-8%-7%
-10%-13%-11%-11%-16%
Abb.3.10: Adsorption der bHRP (c=100nM) auf verschieden prä-immobilisierte Mengen an
Streptavidin. Mit steigender Streptavidinmenge an der Oberfläche steigt auch die Menge der
adsorbierten biotinylierten Peroxidase. Ein Teil unspezifisch adsorbierter bHRP kann durch Spülen
wieder von der Oberfläche entfernt werden.
verläuft schnell und ist diffusionslimitiert. Diese Diffusionslimitierung kann am linearen
Verlauf im ersten Teil der Adsorptionskurve erkannt werden (vgl. Abschnitt 3.3.2.1). Der
Sättigungsbereich wird bereits 9-56sek nach der Injektion der biotinylierten Peroxidase-
Lösung erreicht. Im Anschluss an die Sättigung - insbesondere bei den Experimenten mit
hoher Dichte an oberflächengebundenem Streptavidin - geht ein gewisser Teil der
gebundenen biotinylierten Peroxidase wieder in Lösung. Auch noch nach 30 Minuten kann
diese Desorption beobachtet werden.
3.2.4.2 Unspezifische Adsorption der biotinylierten Peroxidase
Um die unspezifische Adsorption der biotinylierten Peroxidase (bHRP) auf Streptavidin zu
charakterisieren wurde bHRP für 4 Minuten auf eine Streptavidinschicht adsorbiert. Die
Streptavidinschicht wurde vorher mit nativem D-Biotin gesättigt (2 Injektionen zu je 1min).
Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole
- 53 -
Das Ergebnis dieser Messungen ist in Abbildung 3.11 dargestellt. Die Säulendiagramme Abb.3.11: Biotinylierte SAMs (5% Biotinthiol) wurden diffusionslimitiert mit vier verschiedenen Mengen
an Streptavidin beladen (Säulendiagramme). Anschließend wurden die Biotinbindungstaschen mit
nativem D-Biotin gesättigt (Daten nicht gezeigt). Zum Schluss wurden die Streptavidinlagen noch mit
100nM Peroxidase-Lösung inkubiert (eingefügtes Liniendiagramm).
zeigen die verschiedenen Mengen an Streptavidin, die an die Oberfläche adsorbiert wurden.
Das eingefügte Liniendiagramm zeigt das Ergebnis für die anschließende Inkubation der
Peroxidase auf die mit D-Biotin geblockte Strepatvidin-Oberfläche. Die Adsorption der bHRP
ist schwach, aber mit bis zu 13RU deutlich messbar.
3.2.4.3 Korrelation zwischen Streptavidin und biotinylierter Peroxidase
Neben den kinetischen Daten kann auch das molekulare Verhältnis zwischen dem
Streptavidin und der bHRP berechnet werden, indem man die maximal adsorbierten Mengen
aus den Adsorptionskurven berechnet und miteinander vergleicht. In Abbildung 3.9 wurde die
bHRP-Adsorption gegen die Streptavidin-Adsorption aufgetragen. Für die kleinsten 5
Wertepaare der bHRP-/Streptavidin-Adsorption ergibt sich ein linearer Fit mit einer Steigung
von dy/dx=0,326. Die höchsten 4 Wertepaare ergeben einen linearen Fit mit einer Steigung
von dy/dx=0,536. Aus den Steigungen kann ein Verhältnis gebildet werden (siehe Abbildung
3.8). Zieht man dann noch die Massen der einzelnen Proteine hinzu (Streptavidin 60 kDa und
-100 0 100 200 300 400-50
0
50
100
150
200
250
300
350
400
1 2 3 4
400
800
1200
1600
2000
2400
2800
Experiment
Imm
obili
sier
tes
Stre
ptav
idin
4321
bHR
P-A
dsor
ptio
n [R
U]
Zeit [sek]
Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole
- 54 -
Peroxidase 44 kDa), kann man die genaue Anzahl und damit das molare Verhältnis der
miteinander interagierenden Protein-Moleküle ausrechnen. Für die geringeren
Konzentrationen ergibt sich ein Wert von 4 Molekülen bHRP zu 9 Molekülen Streptavidin,
was einem Verhältnis von 1:2,25 entspricht. Für die höheren Konzentrationen ergibt sich,
dass 3 Moleküle der bHRP mit 4 Molekülen Streptavidin interagieren,
0 500 1000 1500 2000 2500
0
200
400
600
800
1000
=> n(Perox.) / n(SA) = 4 / 9
dy/dxHIGH = 0,5395
bHR
P-A
dsor
ptio
n [R
U]
Streptavidin-Adsorption [RU]
dy/dxLOW = 0,326
=> n(Perox.) / n(SA) = 3 / 4
Abb.3.12: Die spezifische bHRP/Streptavidin-Adsorption wurde gegen die Menge an
oberflächengebundenem Streptavdin aufgetragen.
was einem Verhältnis von 1:1,3 entspricht. Das Interaktionsverhältnis ändert sich von den
geringen zu den höheren Adsorptionspaaren. Dies weist auf eine Reorientierung der
biotinylierten Peroxidase hin, da die Peroxidase selbst ein asymmetrisches Molekül ist.
3.2.4.4 Diskussion
Die biotinylierte Peroxidase adsorbiert unter den gewählten Inkubationsbedingungen schnell
und sehr selektiv an die bereits an der Oberfläche verankerten Streptavidine. Das SPR-Signal
nimmt nach beendeter Inkubation der Peroxidase geringfügig ab; dies kann von mehreren
Phänomenen herrühren, welche im Folgenden besprochen werden.
Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole
- 55 -
Zuerst einmal könnte die Interaktion zwischen biotinylierter Peroxidase und Streptavidin
teilreversibel sein. Diese Möglichkeit fällt allerdings aus folgenden Gründen nicht ins
Gewicht: Die Biotinbindung besitzt Halbwertszeiten in der Größenordnung mehrerer Tage
(Literatur: 200 Tage in Lösung 89); hierdurch liegt das Gleichgewicht der Kopplungsreaktion
stark auf der Seite der Biotin Bindung. Nur leicht gebundene Proteinteilchen sollten also
innerhalb weniger Sekunden dissoziieren und nicht in einem Zeitkorridor von 30 Minuten.
Des Weiteren muss man beachten, dass die Peroxidase nicht nur an einer Stelle, sondern an
mehreren Stellen mit dem Biotinanker konjugiert ist (im Mittel an 2,25 Stellen). Diese Stellen
sind auf Grund der Natur des Mechanismus, mit dem der Anker an die Peroxidase bindet
- Bindung an alle freien Aminogruppen (wie Seitenketten der Aminosäure Lysin) - rein
statistisch verteilt. Als Ergebnis dieser statistischen Verteilung kann nicht mit einem
einfachen Interaktionsmechanismus gerechnet werden. Die multiplen Botinylierungsstellen
sorgen nicht nur für eine größere Anzahl an Bindungsmöglichkeiten, sondern auch zu
kinetisch langsamen Reorientierungen der bHRP an der Oberfläche. Solche Reorientierungen
können zu kompakteren Strukturen führen, was dazu führen kann, dass sich das SPR-Signal
verkleinert 142. Dieser Mechanismus wird durch die molaren Verhältnisse bestärkt. Hier
findet mit dem Übergang zu höheren Konzentrationen eine Veränderung des Verhältnisses
von 1:2,25 zu 1:13 bezogen auf die Peroxidase statt. Da die unspezifische Adsorption sehr
klein ist, muss die Peroxidase eine strukturelle Veränderung (z.B. in der Packungsdichte)
vollziehen, wenn sie auf den höheren Streptavidinkonzenztrationen adsorbiert.
3.2 Rasterkraftmikroskopie
Abbildung 3.13 zeigt die Ergebnisse für die AFM-Messungen an einem strukturierten SAM.
Das erste Bild (Abb.3.13-A) zeigt die strukturierte SAM-Oberfläche, bevor Proteine inkubiert
wurden. Da im Topographie-Modus kein signifikanter Höhenunterschied zwischen den
verschiedenen Thiolen gemessen werden konnte, wurde das Bild im Phasen-Modus
aufgenommen. Das Phasenbild zeigt deutlich die Bereiche unterschiedlicher
Thiolfunktionalisierungen des OEG(6)-Thiols (Quadrate) und des 10%-igen Biotinthiols
(Stege). Nach der Inkubation mit Streptavidin (Abb.3.13-B1) können die biotinylierten
Bereiche der Oberfläche im Topographie-Modus deutlich erkannt werden. Die Inkubation mit
der bHRP (Abb.3.13-C1) führt zu einer weiteren Änderung der Steghöhe. Die laterale
Struktur, die über das µCP hergestellt wurde, kann also über den Gesamten
Inkubationsmechanismus gut nachvollzogen werden. Es gibt keine unspezifische Adsorption
der Proteine auf den mit OEG(6)-Thiol inkubierten Bereichen. Zusätzlich können auf Grund
Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole
- 56 -
der lateralen Strukturierung die Höhen der absorbierten Proteinmonolagen charakterisert
werden. Die Höhenmessungen (cross section) liefern für das Streptavidin (Abb.3.13-B2) eine
Abb.3.13: A) Phasenbild der Oberfläche nach Inkubation mit dem OEG(6)-Thiol (helle Quadrate) und
dem 10%-Biotinthiol (dunkle Stege). B1) Topographiebild nach Inkubation mit Streptavidin.
C1) Topgraphiebild nach Adsorption der bHRP auf dem Streptavidin. Der Höhenkontrast verbessert
sich mit jedem Schritt der Proteinadsorption, was in den Bildern B2 (Streptavidin) und C2 (bHRP)
dargestellt ist.
Höhe von (42.2±3)Å. Dieses Ergebnis stimmt mit Messungen der Kristallstruktur des
Streptavidins143 (43-45Å) überein. Nach der Peroxidase Inkubation (Abb.3.13-C2) steigt die
Höhe der Gesamtproteinlage auf (75.5±4)Å an. Der Unterschied zur Höhe der
Streptavidinlage beträgt demnach (33.3±3)Å. Dieses Ergebnis stimmt mit der Länge der
kürzeren Seite der Peroxidase (die aus Daten der Kristallstrukturanalyse bekannt ist143 (40-
42 Å)) überein.
Die AFM-Bilder zeigen nur sehr wenige Defekte in den adsorbierten Proteinlagen. Defekte
sind hierbei Stellen, an denen entweder kein Protein adsorbiert ist (Defekt im Biotinthiol-
SAM) oder es haben Proteine an Stellen adsorbiert, wo sie eigentlich nicht hätten adsorbieren
dürfen (Defekt im OEG(6)-Thiol-SAM). Die Adsorption des Streptavidins führt zu einer
Monolage, in der das Protein seine biologische Aktivität beibehält. Dies wird durch die
Adsorption der Peroxidase gezeigt. Auch hier wird eine vollständige Monolage ausgebildet.
Wie erwartet kann auf den Bereichen des OEG(6)-Thiols keine Adsorption festgestellt
werden.
Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole
- 57 -
3.3 Aktivitätstests
Für die Aktivitätstests wurde das farblose Chromogen 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB)
verwendet, welches von der Peroxidase in ein blaues Zwischenprodukt (TMB
Ladungstransfer- Komplex) umgewandelt wird. Der TMB Ladungstransfer- Komplex kann
dann durch Zugabe von Säure in ein stabiles gelbes Endprodukt überführt werden. Dieses
kann photometrisch detektiert werden (λmax=450nm). Als „negative“ Kontrolle wurde eine
Probe vermessen, die wie die Peroxidase-Proben behandelt wurde, ohne aber die bHRP zu
enthalten. Wie zu erwarten, zeigt sich hier kein Maximum bei 450nm (siehe Abb. 3.14). Für
die „positiven“ Messungen wurde die enzymatische Aktivität in Abhängigkeit von der
Inkubationszeit gemessen. Die Ergebnisse dieser Messungen sind in Abbildung 3.14
zusammengefasst. Die oberen drei Spektren zeigen die Ergebnisse für die
300 350 400 450 500 550 600-0,3-0,2-0,10,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,01,1
Basislinie entspricht"negative" Kontrolle
5min Oberfläche 10min Oberfläche 15min Oberfläche 5min Lösung 10min Lösung 15min Lösung
rel.
Inte
nsitä
t
Wellenlänge [nm]
Abb.3.14: Peroxidase katalysiert die Produktion eines gelben Farbstoffs, der dann photometrisch
detektiert wird. Die Höhe der Banden korreliert mit der enzymatischen Aktivität. Es wurde die Aktivität
der Enzyme in Lösung (obere 3 Linien) mit der Aktivität der Enzyme an der Oberfläche verglichen
(untere 3 Linien).
Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole
- 58 -
Messungen in Lösung. Mit steigender Inkubationszeit (5, 10 und 15min) steigt erwartungs-
gemäß auch die Intensität des Maximums bei 452nm von 0,34 (5min) über 0,67 (10min) bis
hin zu 1,0 (15min). Diese Spektren können als Referenz für die maximale Enzymaktivität
gesetzt werden. Vergleicht man die Aktivität der Peroxidase in Lösung mit den Ergebnissen
für die Aktivität des Enzyyms an der Oberfläche, ist eine starke Abnahme der Banden bei
452nm zu erkennen. Mit steigender Inkubationszeit steigt auch für die
oberflächengebundenen
P P P
P
P
P
Abb.3.15: Jedes Peroxidase-Molekül (P) besitzt eine “Diffusionssphäre”. Substrate innerhalb dieser
Sphäre können die aktive Seite der Peroxidase erreichen. In Lösung (linke Darstellung) ist soviel Platz
zwischen den einzelnen Molekülen, dass sich die Sphären nicht überlappen. Bei den
oberflächengebundenen Molekülen (rechte Darstellung) liegen die Moleküle so eng zusammen, dass
es zu einer Überlappung der Sphären kommt. Dadurch konkurrieren die einzelnen Peroxidase-
Moleküle um das Substrat.
oberflächengebundenen Enzyme die Aktivität an (Maxima: 0,14 (5min); 0,20 (10min); 0,24
(15min)). Für die Messungen in Lösung können die Maxima linear gefittet werden
(λmax=0,0699*Inkubationszeit/min; R=0,9998). Für die Messungen an der Oberfläche folgen
die Maxima keinem linearen Verlauf. Dies ist darauf zurückzuführen, dass in Lösung alle
Seiten der Peroxidase frei zugänglich sind; an der Oberfläche sind die Peroxidase-Moleküle
jedoch dicht gepackt, wodurch nur die obere Seite vollständig frei zugänglich ist. Alle
weiteren Seiten werden durch die Nachbarmoleküle (lateral) und die Streptavidinlage
(Unterseite) geblockt. Folgt man der Michaelis-Menten Kinetik, so ist der maximale
enzymatische Umsatz dann erreicht, wenn das Enzym (E) vollständig mit Substrat (S)
gesättigt ist ([S] >> [E]). In Lösung ist diese Bedingung erfüllt, da alle Peroxidase-Moleküle
weit voneinander entfernt sind und imaginäre Diffusionssphären der Moleküle (siehe
Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole
- 59 -
Abbildung 3.15) nicht überlappen. Nimmt man solche Diffusionssphären an, so können nur
die Moleküle umgesetzt werden, die sich innerhalb dieser Sphäre aufhalten. Der lineare Fit,
welcher für die Maxima bestimmt wurde, zeigt, dass die Umsatzrate während der Inkubation
konstant bleibt, was diese Annahme verifiziert.
Für die oberflächengebundenen Peroxidase-Moleküle ergibt sich ein vollständig anderes Bild.
Die Peroxidase-Moleküle sind nun immobilisiert und liegen dicht gepackt nebeneinander und
auf dem Streptavidinfilm. Hierdurch überlappen die Diffusionssphären und es kommt zur
Konkurrenz um einzelne eindringende Substratmoleküle. Dadurch kommt es zu einer
anfänglich sehr hohen Enzymaktivität, wodurch die Substratmoleküle, die sich in der Nähe
zur Oberfläche befinden schnell verarmen. Hierdurch wird die enzymatische Aktivität stark
verlangsamt. Die Umsatzrate der enzymatischen Reaktion ist als nicht konstant; dies erklärt,
warum kein linearer Fit kalkuliert werden konnte.
Die Aktivitätstests zeigen aber eindeutig, dass die Peroxidase auch nach der Adsorption an die
Oberfläche ihre biologische Aktivität beibehält.
350 400 450 500 5500,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
rel.
Inte
nsitä
t
Wellenzahl [nm]
Referenz Test
Abb.3.16: Absorptionskurven für die Referenz-Probe (Kreise) und die Test-Probe (Quadrate). Die
Aktivität der Test-Probe liegt im Vergleich zur Referenzprobe (100% Aktivität) immer noch bei 22%.
Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole
- 60 -
Zur weiteren Bestimmung der Aktivität oberflächengebundener Proteine wurden noch Proben
vermessen, bei denen die Bindungstaschen des Streptavidins vor Inkubation mit der
Peroxidase durch natives D-Biotin abgesättigt wurden (Test-Probe). Das Ergebnis dieser
Messungen ist in Abbildung 3.16 gezeigt. Zum besseren Vergleich wurde die gleiche
Messung ohne das vorherige Absättigen wiederholt (Referenz-Probe). Es ist eindeutig zu
erkennen, dass die Referenz-Probe eine viel stärkere Adsorption zeigt (0,49). Setzt man diese
Aktivität zu 100%, so besitzt die Test-Probe (0,11) immerhin noch eine Aktivität von 22%.
Auf der Test-Probe wurden die Biotinbindungstaschen des Streptavidins mit D-Biotin
abgesättigt. Die enzymatische Peroxidase Reaktion kann hier also nur von solchen Molekülen
durchgeführt werden, die unspezifisch an die Oberfläche gebunden haben. Dies korreliert gut
mit den Beobachtungen aus den SPR-Experimenten.
Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung
- 61 -
4 Click-Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung
Für die hier vorliegende Forschungsarbeit sind die Thio-Funktionalisierungen der Peptide und
die Selbstassemblierung der Peptidthiole auf Goldoberflächen unter Ausbildung
zweidimensionaler Peptidfilme hoher struktureller Qualität von zentraler Bedeutung. Im
Hinblick auf eine spätere Phase des Projekts muss die spezielle Methode der Thiolierung
verträglich mit dem Einsatz einer Peptidbibliothek sein, d.h. sie muss schnell sein und hohe
Ausbeuten besitzen. Zuerst wurde daher daran gedacht die Thiolieung über die gleiche
Synthesestrategie zu verfolgen, wie Aminosäuren untereinander gekoppelt werden, wenn aus
ihnen Peptide synthetisiert werden. Diese Synthesestrategie ist in Abbildung 4.1 dargestellt.
Abb.4.1: Darstellung der Reaktionssequenz zur Festphasen-Synthese von Peptid-Thiol Oligoamiden
Dabei kommen folgende Reagenzien zum Einsatz: a) PyBop, DMF b) Piperidin, DMF
c)Trifluoressigsäure, CH2Cl2.
Der verwendete Thiolanker wird dabei zuerst trityliert. Anschließend wird das gewünschte
Peptid über Festphasensynthese produziert. Im nächsten Schritt werden beide Moleküle
miteinander verknüpft. Zuletzt wird die Schutzgruppe am Thiol, sowie das Harz, an dem das
Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung
- 62 -
Peptid hängt sauer abgespalten. Aus den so synthetisierten Peptidthiolen sollten dann SAMs
präpariert und vermessen werden. Obwohl dieser Zugang zum Erfolg führte , erwies er sich
leider als sehr schwierig, da die Synthese aus vielen Stufen und Aufreinigungsschritten
besteht, bei denen Material verloren ging oder die nicht zum erwünschten Produkt führten.
Einen einfacheren Zugang sollte die Click-Chemie von Aziden mit Alkinen (Huisgen-
Reaktion) liefern: Click-Chemie ist eine sich immer weiter verbreitende Technik, um
selektive Reaktionen durchzuführen. Durch Click-Chemie können unter milden Bedingungen
und mit geringem Aufwand schnell und selektiv Verbindungen synthetisiert werden. Auf
Grund des dabei verwendeten modularen Aufbaus der beteiligten Reaktionspartner kann in
kürzester Zeit eine Vielzahl verschiedener Moleküle aufgebaut werden.
Abb.4.2: Modifizierte 1,3-Cycloaddition nach Huisgen. Im Gegensatz zur thermisch kontrollierten
Huisgen-Reaktion entstehen hier nicht 2 Enantiomere, sondern selektiv das 1,4 Regioisomer.
Die Gruppe um Sharpless hat eine Vielzahl von Reaktionen entwickelt, die den Kriterien
einer Click-Reaktion gerecht werden. Die bekannteste und am weitesten verbreitete ist die
durch Kupfer katalysierte Variante der 1,3-dipolaren Cycloaddition 144 (Huisgen-Reaktion;
siehe Abbildung 4.2). Hierbei werden Alkine mit Aziden zu 1,2,3-Triazolen umgesetzt.
Diese Reaktion soll eingesetzt werden, um Peptide mit einem Thiolanker zu versehen, so dass
die enstandenen Peptidthiole anschließend an eine Oberfläche adsobiert werden können (siehe
Kapitel 5). Click-Chemie an Peptiden ist in der Literatur bekannt 145, 146; insbesondere die
Konjugation von Ferrocen mit Biomaterialien wurde eingehend untersucht 147-150. In diesem
Kapitel der Arbeit wurden insgesamt drei verschiedene Click-Reaktionen durchgeführt und
charakterisiert:
- Ferrocenazid + 11-thioacetyl-undekansäure-propargylamid
- Ethinyl-Ferrocen + Azidoundekanthiol
- Azido-Essigsäure + thioacetyl-undekansäure-propargylamid
Dabei wurden zusätzlich zwei Kopplungsvarianten unterschieden. Im ersten Fall erfolgt die
Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung
- 63 -
Kopplung in Anlehnung an die Literaturvorschrift in Lösung. Anschließend wird auf einem
Goldsubstrat mit dem fertigen Clickprodukt ein SAM hergestellt und dieser dann
charakterisiert (siehe Abbildung 4.5). Im zweiten Fall wird aus einem Thiol ein SAM erstellt.
Die Kopplungsreaktion soll dann an der Oberfläche erfolgen, indem das Goldsubstrat mit dem
fertigen SAM in der Reaktionslösung für mehrere Stunden inkubiert wird). In Abbildung 4.3
sind die in dieser Arbeit verwendeten Moleküle dargestellt. In Abhängigkeit vom Experiment
wurden azid-terminierte (1) oder alkin-terminierte (2) SAMs und die dazu passenden alkin-
terminierten (5) oder azid-terminierten (3, 4) Click-Partner benötigt. Die Abbildungen 4.4
and 4.5 geben einen Überblick über die in dieser Arbeit untersuchten Reaktionen. Die
Synthese von 2, 3 and 4 sind in der Literatur beschrieben (2 151, 3152, 153, 4 153); 1 und 5 sind
hingegen kommerziell erhältlich (1 Asemblon, 5 ACROS).
S
O
HN
O
S
SN3
N3
HO
O
N3
N3
Fe
1
2
3 4 5Fe
Abb.4.3: Darstellung der für das Projekt benutzen Moleküle: Azido-Undekanthiol (1), 11-thioacetyl-
undekansäure-propargylamid (2), Azidoessigsäure (3), Azidoferrocen (4) und Ethinyl Ferrocen (5).
4.1 Addition von Azidoferrocen an 11-thioacetyl-undekansäure-propargyl-
amid in Lösung
4.1.1 Azidoferrocen
Das Azidoferrocen wurde in Kooperation mit Herrn D. Köster am Lehrstuhl für Anorganische
Chemie I synthetisiert. Die Synthese erfolgte nach Literaturvorschrift 153. Das Produkt wurde
mittels ATR-IR charakterisiert.
Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung
- 64 -
Abb.4.4: Click Reaktionen von 2 mit 3 und 4. Es werden N-((1H-1,2,3 triazol-4-yl)acetyl)-11-mercapto-
undekanamid (6) und N-((1H-1,2,3-triazol-4-yl) ferrocenyl)-11-mercapto-undekanamid (7) erhalten.
Abb.4.5: Additionsreaktion von 5 an 1. Als Produkt wird N-((1H-1,2,3-triazol-4-yl) ferrocenyl)-11-
mercapto-undekanthiol (8) erhalten.
4.1.2 11-thioacetyl-undekansäure-propargylamid
Das 11-thioacetyl-undekansäure-propargylamid (im Folgenden: Alkinthiol) wurde am
Lehrstuhl für Anorganische und Angewandte Chemie der Universität Hamburg in
Zusammenarbeit mit Herrn Prof. Dr. A. Terfort synthetisiert und charakterisiert 151. Von dem
Alkinthiol wurden drei verschiedene IR-Messreihen angefertigt.
Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung
- 65 -
Abb.4.6: Schematische Darstellung für die Synthese des Ferrocenthiols in Lösung mit anschließender
Formierung des SAMs.
Zuerst wurde das IR-Spektrum des Thiols über eine Simulation (Gaussian98 Paket 154/
B3LYP/6-31G(d) Basis) generiert. Anschließend wurden KBr-IR-Messungen des Alkinthiols
durchgeführt. Im letzten Schritt wurde aus dem Alkinthiol ein SAM hergestellt und dieser
SAM dann mit IRRAS charakterisiert. Die resultierenden IR-Spektren sind in Abbildung 4.7
zusammengefasst. Die wichtigsten Banden wurden durch Striche gekennzeichnet.
Das IR Spektrum zeigt eindeutig, dass sowohl im KBr als auch im SAM das Alkinthiol sauber
und rein vorliegt.
Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung
- 66 -
Tab.4.1: Vergleich der wichtigsten IR-Banden des Alkinthiols mit Literatur und Simulation.
Literatur[cm-1] Simulation[cm-1] KBr[cm-1] SAM
ν-CH (Alkingruppe) 3300 3470 3304 Auswahlregel
ν-CH (Aliphaten) 3000 3058 2919 2929
ν-CC (Alkingruppe) 2200 2208 - -
ν-CO 1700 - 1691 (Acetat)
1700 1634 1634 (Thiol) 1692
δ-NH 1600 1518 1534 1523
375035003250300027502500225020001750150012501000 750-1
0
1
2
3
(ohne Acetylat)
SAM
Simulation
KBr
norm
. Int
ensi
tät
Wellenzahl [1/cm]
Abb.4.7: Simuliertes IR-Spektrum, KBr-IR-Spektrum und SAM-IR-Spektrum des Alkinthiols im
direkten Vergleich. Die wichtigsten Banden sind mit Strichen gekennzeichnet.
4.1.3 Ferrocenthiol
4.1.3.1 IRRAS-Messungen
Das Alkinthiol wurde mit dem Azido-Ferrocen unter den in Abbildung 4.1 beschriebenen
Reaktionsbedingungen umgesetzt. Einzig die Reaktionszeit wurde von 8 Stunden auf 24
Stunden erhöht. Anschließend wurde ein Goldsubstrat (Si-Wafer) für weitere 24 Stunden in
Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung
- 67 -
der nicht aufgereinigten Ferrocenthiol-Lösung inkubiert. Auf eine Aufreinigung wurde
verzichtet, da die Umsetzung des Thiols zu 100% erfolgt und somit keine anderen Moleküle
außer dem Ferrocenthiol an das Gold adsorbieren sollten.
Von dem Ferrocenthiol-SAM wurden IRRAS-Messungen durchgeführt und das erhaltene IR-
Spektrum mit einem simulierten Spektrum verglichen (Abbildung 4.8). Die wichtigsten
Banden wurden mit Strichen gekennzeichnet. Tabelle 4.2 fasst die wichtigsten,
charakteristischen Banden zusammen.
3500 3000 2500 2000 1500 1000-0,20,00,20,40,60,81,01,21,41,61,82,02,22,42,62,83,03,23,4
x5
Simulation
SAM
norm
. Int
ensi
tät
Wellenzahl [cm-1]
Abb.4.8: Simuliertes IR-Spektrum und SAM-IR-Spektrum des Ferrocenthiol im direkten Vergleich. Die
wichtigsten Banden wurden durch Linien gekennzeichnet.
Die Schwingungen für die Aromaten des Ferrocens und die CC-Doppelbindung im Triazol-
Ring sind eindeutig identifizierbar. Ebenso fehlen die charakteristischen Schwingungen, die
auf reines Alkinthiol hinweisen (CC-Dreifachbindung). Es kann also davon ausgegangen
werden, dass sich ein SAM aus reinem Ferrocenthiol gebildet hat. Zur Bestätigung und
weiteren Charakterisierung wurden XPS-Messungen am Ferrocenthiol-SAM durchgeführt
(siehe Kapitel 4.1.3.2 und 4.1.3.3).
Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung
- 68 -
Tab.4.2: Vergleich der wichtigsten IR-Banden des Ferrocenthiol-SAMs mit Literatur und Simulation.
Literatur [cm-1] Simulation [cm-1] SAM [cm-1]
ν-CH (Aromaten/in plane) 3200-3300 3255 3103
ν-CH (Aliphaten) 3000 3060 2925
Peak durch Adsorption aus dem Probenraum (Gerätepeak) 1731
ν-CO 1700 1646 1678
δ-CC 1620 (Triazol) 1572 1603 (Schulter)
δ-NH 1600 1543 1532 (Schulter)
δ-CH (Aromaten/out of plane) >900 817 821
4.1.3.2 XPS-Messungen
Die Proben aus den IR-Messungen wurden zur weiteren Charakterisierung noch mit XPS
vermessen. In Abbildungen 4.9 sind die charakteristischen Bereiche für Kohlenstoff,
Sauerstoff, Stickstoff und Eisen dargestellt. Die Spektren sind im Vergleich zum reinen
Alkinthiol aufgetragen. Das Fe2p-Spektrum zeigt, dass Cyclopentadienyleisen auf die
Oberfläche gebracht wurde. Die Bande bei 708,1 zeigt, dass Eisen(II) (nicht Eisen(III))
vorliegt (155: Fe(II) 710,9eV; Fe(III) 849,eV). Der zweite Peak bei 720,9eV gehört ebenfalls
zum Esien(II) und beruht auf der Spin Bahn Kopplung.
Während die S2p-Region annähernd unverändert bleibt, zeigt die C1s-Region eine deutliche
Intensitätszunahme, die durch die zusätzlichen Cyclopentadienylringe verursacht wird.
Zusätzlich wird durch die Cyclopentdienylringe der Peak auch noch verbreitert (FHWM
+0,3eV). In der N1s-Region ist ebenfalls eine deutliche Veränderung erkennbar. Neben der
deutlichen Intensitätszunahme (von einem N-Atom auf vier N-Atome im Molekül) ist neben
einer Verschiebung von 0,9eV auch eine Peakverbreiterung (FHWM +0,4eV) erkennbar.
Diese Effekte beruhen auf den neu hinzugekommenen N-Atomen des heterozyklischen,
teilaromatischen Triazolringes.
Die quantitative Auswertung ergibt eine Stöchiometrie von C24N4,18O6S0,98Fe0,92 (Soll:
C24H33N4OSFe). Auffällig ist hier der zu hohe Sauerstoffanteil. Die Spektren belegen aber
wie beschrieben, dass es sich nicht um Eisenoxide oder SO-Spezies handelt, sondern um
sauerstoffhaltige Kohlenwasserstoffe. Es liegt die Vermutung nahe, dass physisorbierte oder
an N/O brückenbindende Moleküle vorliegen. Dies könnte sehr wahrscheinlich die gleiche
Verunreinigung wie bei den IR-Messungen sein, da ja die Proben erst im IR und anschießend
im XPS vermessen wurden.
Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung
- 69 -
292 290 288 286 284 282 2800,0
0,4
0,8
1,2
1,6
2,0
2,4
C1s-XPSK
cou
nts
pro
s
Bindungs Energie / eV
27
730 725 720 715 710 7050,0
0,1
0,2Fe2p XPS
K c
ount
s pr
o s
Bindungs Energie / eV
538 536 534 532 530 528 526 5240,0
0,2
0,4
0,6
0,8
O1s-XPS
K c
ount
s pr
o s
Bindungs Energie / eV
7
2
408 405 402 399 396 393
0,0
0,1
0,2
N1s-XPS
K c
ount
s pr
o s
Bindungs Energie / eV
2
7
Abb.4.9: XPS-Spektren der verwendeten Thiole. Es sind die charakteristischen Bereiche für
Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff und Eisen dargestellt. Die unteren Kurven stellen die Ergebnisse für
das reine Alkinthiol dar, während die oberen Linien das Ferrocenthiol darstellen.
4.1.3.3 NEXAFS-Messungen
Zur weiteren Detailanalyse wurden die Proben noch mit NEXAFS vermessen (in
Kooperation mit Herrn D. Käfer). Abbildung 4.10 zeigt das C1s NEXAFS-Spektrum des
Ferrocenthiols. Im Spektrun sind der π*-Peak bei 284,95eV (aromatischer Kohlenstoff im
Trioazol-/Cp-Ring) und eine Schulter bei 287,06eV sowie die σ*-Peaks bei 288,30 und
292,06eV vom Alkylteil gut identifizierbar; ein Literaturspektrum von reinem Ferrocen ist in
grau dargestellt; besonders die Schulter bei 297,7eV ist im Alkanthiol nicht existent und
gehört zum Ferrocen, auch wenn die π*-Resonanzen nicht ganz übereinstimmen.
Aus dem Dichroismus lässt sich ableiten, dass das Alkanrückgrat des Ferrocenthiols 36°
gegen die Oberflächennormale verkippt ist.
In Abbildung 4.11 ist das Fe2p NEXAFS-Spektrum des Ferrocenthiols dargestellt. Als
deutliche Peaks können die Schulter bei 708,83eV, und die Peaks bei 710,30eV und 722,96eV
dem Ferrocen zugeordnet werden. Man sieht jedoch eine starke Verbreiterung im SAM, die
Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung
- 70 -
270 280 290 300 310 320 330
0
1
2
3
4
5
30° 55° 90° Ferrocen
Inte
nsitä
t
Photonen Energie [eV]
Abb.4.10: C1s NEXAFS-Spektrum von Ferrocenthiol auf einem Gold/Silicium-Wafer.
700 710 720 730 740 750
0
1
55° Ferrocen
Inte
nsitä
t
Photonen Energie [eV]
Abb.4.11: Fe2p NEXAFS-Spektrum von Ferrocenthiol auf einem Gold/Silicium-Wafer.
auf Kopplungen zu Nachbarmolekülen zurückzuführen ist. Die Intensität im Kantensprung ist
relativ gering, d.h. es liegt wenig Fe im Vergleich zum C1s vor (passend zum
stöchiometrischen Verhältnis von C24Fe).
Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung
- 71 -
Ein Dichroismus ist hier nicht vorhanden, d.h., dass eine statistische Orientierung des
Ferrocens vorliegt. Um einen besseren Vergleich zu haben, wurde zusätzlich noch ein
NEXAFS Spektrum des reinen Alkinthiols aufgenommen. Das Alkinthiol gleicht bis auf
etwas höhere π*-Resonanzen einem Alkanthiol-C1s-NEXAFS. Der Dichroismus liefert einen
Verkippungswinkel von 31°.
4.1.4 Zusammenfassung: Click-Chemie in Lösung
IR-, XPS- und NEXAFS-Daten zeigen deutlich, dass die gewünschte Reaktion gezielt, ohne
Nebenprodukte und unter einfachen Bedingungen abläuft. Die NEXAFS Daten liefern neben
der Bestätigung der IR- und XPS Daten zusätzlich die Verkippungswinkel der Moleküle zur
Oberflächennormalen.
4.2 Addition von Azidoferrocen an 11-thioacetyl-undekansäure-propargyl
amid an der Oberfläche
In den vorherigen Experimenten wurde das Ferrocenthiol in Lösung synthetisiert und
anschließend an die Oberfläche gebracht. Ein besserer Zugang wäre, das Alkinthiol an die
Oberfläche zu binden und erst dann das Azidoferrocen durch die Click-Chemie anzubinden.
Hierdurch wäre es möglich, Alkinthiolchips „vorzuproduzieren“. Anschließend könnte das
gewünschte Azid synthetisiert und direkt an die Oberfläche geklickt werden.
4.2.1 Click-Reaktion am vollständigen Alkinthiol-SAM
Im ersten Versuch wurde ein vollständiger SAM aus Alkinthiol präpariert. Die so hergestellte
Probe wurde für 120h in der nach Literaturvorschrift angesetzten Reaktionslösung (siehe Abb.
4.2) inkubiert. Anschließend wurde die Probe zuerst mit abs. Ethanol gespült, dann im
Stickstoffstrom getrocknet und anschließend mittels IRRAS und XPS untersucht.
4.2.1.1 IRRAS-Messungen
Abbildung 4.13 zeigt die IR-Spektren der Proben mit Alkinthiol vor und nach Inkubation mit
Azidoferrocen (Inkubationsbedingungen wie in Abb.4.2 beschrieben). Es ist relativ klar
ersichtlich, dass das Spektrum nach Inkubation keine zusätzlichen Banden enthält, die für eine
Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung
- 72 -
Reaktion des Azidoferrocens mit dem oberflächen-immobiliserten Alkinthiol, wie z.B Banden
bei 3100cm-1 (CH-aromatisch/in plane) oder ~800cm-1 (CH-aromatisch/out of plane)
sprechen.
Abb.4.12: Schematische Darstellung der Synthese des Ferrocenthiols an der Oberfläche nach
Inkubation eines Goldwafers mit Alkinthiol.
4.2.1.2 XPS-Messungen
Das Fe2p Spektrum zeigt nur eine extrem geringe Intensität (Daten nicht gezeigt). Eine
stöchiometrische Auswertung würde zu C24Fe0,18 führen. Die XPS-Spektren bestätigen den
Verdacht, dass so gut wie keine Reaktion des Azido-Ferrocens an den vorinkubierten
Alkinthiol-Wafer stattgefunden hat.
Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung
- 73 -
4000 3500 3000 2500 2000 1500 10000,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
nach Reaktion vor Reaktion
Inte
nsitä
t
Wellenzahl [cm-1]
Abb.4.13: IR-Spektren des Alkinthiols vor (oben) und nach (unten) Reaktion mit dem Azidoferrocen.
4.2.2 Click-Reaktion am gemischt terminierten Alkinthiol-SAM
Im nächsten Schritt wurde eine Koadsorption von zwei verschiedenen Thiolen durchgeführt.
Neben dem Alkinthiol wurde ein -OH terminiertes Thiol (Mercapto-Undekanol; Abbildung
4.14) verwendet (im Folgendem: OH-Thiol). Beide Thiole liegen mit einer Konzentration von
1mM als ethanolische Lösung vor und werden für jeden Versuch frisch in der benötigten
Zusammensetzung gemischt. Die Endkonzentration an Thiol beträgt daher insgesamt 1mM.
SH OH Abb.4.14: Darstellung des für den gemischt terminierten SAM verwendeten Mercapto-Undekanols.
4.2.2.1 50% Alkinthiol-SAM
Zuerst wurden Versuche mit einer 50%-igen Mischung (Angaben in % beziehen sich immer
auf das Alkinthiol) durchgeführt. Hierbei wurde ein Wafer für 24h in der Thiolmischung
inkubiert.
Die so inkubierten Wafer wurden anschließend für 60-72h in der für die Click-Chemie
Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung
- 74 -
notwendige Reaktionslösung inkubiert (Das Schraubdeckelgläschen wurde dabei auf einen
Schüttler gelagert). Es wurden IR- und XPS Spektren gemessen. Ein solches IR-Spektrum ist
in Abbildung 4.15 dargestellt. Die für die Ferrocengruppe charakteristischen Banden sind in
Tabelle 4.3 zusammengefasst und werden mit den experimentellen Daten verglichen.
3750 3500 3250 3000 2750 2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 7500,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
100% Ferrocenthiolaus Lösung
50% Ferrocenthiolan Oberfläche
norm
. Int
ensi
tät
Wellenzahl [cm-1]
Abb.4.15: IR Spektrum eines SAMs aus 50%Alkinthiol, welcher für 72h in der Reaktionslösung für die
Click-Chemie inkubiert wurde. Zum Vergleich ist das Spektrum eines SAM aus Ferrocenthiol gezeigt,
welches in Lösung synthetisiert und dann an die Oberfläche adsorbiert wurde. Die senkrechten Linien
zeigen 2 der charakteristischsten Peaks für die Aromaten des Ferrocenthiols.
Es ist deutlich ersichtlich, dass keiner der auf das Ferrocen hinweisenden Banden im
Spektrum deutlich zu finden ist. Die 50%-Alkinthiolprobe hat also nicht mit dem
Ferrocenazid reagiert.
Tab.4.3: Vergleich der charakteristischen Banden für die Ferrocengruppe aus Literatur, Simulation
und Experiment.
Wellenzahl [cm-1]
Literatur Simulation SAM (aus Lösung) 50%-Alkinthiol
ϖ-CH (in plane) 3200-3300 3250 3103 -
δ-CC (Triazol) 1620 1572 1603 (Schulter) -
δ-CH (out of plane) >900 817 815 (Qualität)
Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung
- 75 -
Die XPS-Messungen zeigen keine Intensität im Bereich des Fe2p und nur geringe Intensität
im Bereich des N1s. Im Bereich des O1s ist im XPS eine große Intensität zu verzeichnen auf
Grund des koadsorbierten OH-Thiols. Die XPS-Messungen bestätigen also den Verdacht,
dass keine Reaktion des Azido-Ferrocens mit dem 50%-Alkinthiollayer erfolgt ist.
4.2.2.2 10% Alkinthiol-SAM
Da die 50%-Alkinthiolprobe keine Reaktion mit dem Ferrocenazid zeigte, wurde die gesamte
Messreihe mit einer 10%-igen Alkinthiollösung wiederholt. Die Ergebnisse sind in den
Abbildungen 4.16 und 4.17 dargestellt.
4000 3800 3600 3400 3200 3000 2800 26002000 1800 1600 1400 1200 1000 800
0,0
0,8
1,6
norm
. Int
ensi
tät
Wellenzahl [cm-1]
. Abb.4.16: IR Spektrum eines SAMs aus 10%Alkinthiol, welcher für 60h in der Reaktionslösung für die
Click-Chemie inkubiert wurde (unteres Spektrum). Zum Vergleich ist das Spektrum eines SAM aus
Ferrocenthiol (oberes Spektrum) gezeigt, welches in Lösung synthetisiert und dann an die Oberfläche
adsorbiert wurde. Die senkrechten Linien zeigen 2 der charakteristischsten Banden für die Aromaten
des Ferrocenthiols.
Abbildung 4.16 zeigt das gesamte Spektrum des SAMs aus 10% Alkinthiol, während in
Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung
- 76 -
Abbildung 4.17 zwei Teilspektren für die Bereiche um 1625 cm-1 und 3100 cm-1 gezeigt sind.
Auch für das 10%-ige Alkinthiol sind keine eindeutigen Banden ersichtlich, die auf
angelagertes Ferrocen hindeuten. Deutlich zu sehen ist hingegen ein Peak bei ca. 3600cm-1,
3500 3000 2500
0,0
0,8
norm
. Int
ensi
tät
Wellenzahl [cm-1]
1800 1600
0,0
0,8
1,6
norm
. Int
ensi
tät
Wellenzahl [cm-1]
Abb.4.17: Vergrößerung der Bereiche um 1625 cm-1 und 3100 cm-1 der Spektren aus Abbildung 11. Im Spektrum des 10%-igen Alkinthiol-SAMs sind keine Peaks des Ferrocens zu erkennen.
der auf die OH-Streckschwingungen des koadsorbierten OH-Thiols hinweist. Zum Vergleich
ist in Abbildung 4.18 das IR-Spektrum eines reinen OH-thiol-SAM dargestellt. Es sind die
drei charakteristischen Banden bei 3600 cm-1 (OH-Streckschwingung), 3000 cm-1
(aliphatisches Rückgrat) und 1500 cm-1 (OH-Deformationsschwingung) für das OH- Thiol zu
erkennen. Die IR-Messungen zeigen auch hier, dass zwar eine koadsorption der beiden Thiole
stattgefunden hat, aber die Reaktion des Azidoferrocens mit dem oberflächen-immobilisierten
Alkinthiol nicht erfolgt ist.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 10000,015
0,020
0,025
Inte
nsitä
t
Wellenzahl [cm-1]
Abb.4.18: IR-Spektrum eines SAMs aus 11-mercapto-Undekanol (OH-Thiol).
Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung
- 77 -
4.2.3 Zusammenfassung
Die IR-Messungen der koadsorbierten SAMs aus Alkinthiol und OH-Thiol zeigen keine
Reaktion mit dem Azidoferrocen. Dies wird durch die XPS-Messungen bestätigt, da auch im
XPS kein Cyclopentadienyl-Eisen gemessen werden konnte.
4.3 Reaktion von Ethinyl-Ferrocen an Azidoundekanthiol an der
Oberfläche
Da auch die Reaktionen an verdünnten SAMs aus 11-thioacetyl-undekansäure-propargyl-
amid keinen Erfolg zeigten, wurde die Strategie umgedreht. Es wurde ein azido terminiertes
Alkanthiol an die Oberfläche gebunden, um anschließend ein Ethinyl-ferrocen über Click-
reaktion zu addieren.
4.3.1 Ethinyl-Ferrocen
Ethinyl-Ferrocen ist kommerziell erhältlich (ACROS). Vom reinen Ethinyl-ferrocen wurden
eine Simulation und ein KBr-Spektrum angefertigt (Siehe Abbildung 4.20) Beide Spektren
stimmen gut überein. Das KBr-Spektrum wird später noch verwendet, um es mit dem IR-
Spektrum des Click-Produktes zu vergleichen.
4.3.2 Azido-terminiertes Undekandisulfid
Zur Herstellung des SAMs wurden Si/Au Wafer für 24h in eine 1mM ethanolische Lösung des
Azidoundekandisulfids (Asemblon) eingelegt. Der so entstandene SAM wurde mit IRRAS
charakterisiert. In Abbildung 4.18 werden die Spektren des reinen Disulfids und des SAMs
miteinander verglichen. Die charakteristischen Peaks sind in Tabelle 4.4 zusammengefasst.
Zusätzlich sind in Tabelle 4.4 noch die Ergebnisse für die charakteristischen Banden eines
simulierten Spektrums gezeigt. Alle drei Spektren stimmen gut überein und zeigen, dass die
charakteristischen Banden deutlich zu erkennen sind.
Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung
- 78 -
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 5000,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
Azidothiol-KBr
Azidothiol-SAM (x100)
no
rm. I
nten
sitä
t
Wellenzahl [cm-1]
Abb.4.19: IR-Spektren des Azidoundekanthiols im Volumen (KBr) und an der Oberfläche (SAM).
Tab.4.4: Vergleich der wichtigsten IR-Banden des Azidothiols im Volumen (KBr), an der Oberfläche
(SAM) und mit der Simulation (Spektrum nicht gezeigt).
Literatur [cm-1] Simulation [cm-1] SAM [cm-1]
ν-CH (Aliphaten) 3000 2997 2925
ν-N3 2100 2087 2106
δ-CN 1000-1500 1416,1359,1264 1463,1346,1256
4.3.3 N-((1H-1,2,3-triazol-4-yl) ferrocenyl)-11-mercapto-undekanthiol
Die wie in Kapitel 4.3.2 hergestellten Proben wurden für 120h in der nach abgewandelter
Literaturvorschrift angesetzten Reaktionslösung (siehe Abb. 4.1) inkubiert, um 8 zu erhalten.
Anschließend wurde die Probe gereinigt und mittels IRRAS charakterisiert. Abbildung 4.19
zeigt das Ergebnis dieser Messungen im Vergleich zu den beiden Ausgangsprodukten. Tabelle
4.5 fasst die wichtigsten Banden im Vergleich zum simulierten Spektrum und zu den Spektren
der Ausgangssubstanzen 1 und 5 zusammen.
Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung
- 79 -
Tab.4.5: Vergleich der wichtigsten IR-Banden des Azidothiols im Volumen (KBr), an der Oberfläche
(SAM) und mit der Simulation (Spektrum nicht gezeigt).
Substanz und Wellenzahl [cm-1]
Gruppe Etyhnyl- Ferrocen
(5)
Azido-undekanthiol
(1)
Click- Produkt
(8)
Simulation des Click-Produktes
(8) ν-CH (Aromaten /in plane) 3098 - 3102 3124 ν−N=N=N - 2104 - - ν-CC (Alkin)/ ν-CH (Alkin) 2103/3279 - - - δ-CH (Aromaten/out of plane) 1105 - 1104 1011 δ-CH (Aromaten /out of plane) 1000 - 1001 979 δ-CH (Aromaten /out of plane) 814 - 810 801
Es ist ersichtlich, dass die Azido-Bande (N=N=N; 2106 cm-1) und die Banden für die Alkin-
Gruppe (C≡C; 2102 cm-1/ 3279cm-1) im IR-Spektrum des Click-produktes nicht mehr
vorhanden sind. Die Banden um 1000 cm-1 und die Bande bei 3102 cm-1(δ-CH aromatisch/in
plane) zeigen die Anwesenheit des Ferrocens an (δ-CH aromatisch/out of plane). Das
experimentell bestimmte Spektrum stimmt außerdem gut mit dem simulierten Spektrum
(siehe Tab.4.5) überein.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
Ferrocenthiol (Simulation)
Ethynyl-Ferrocen (KBr)
Ferrocenthiol (SAM)
Azidothiol
Ethynyl-Ferrocen (Simulation)
norm
. Int
ensi
tät
Wellenzahl [cm-1]
Abb.4.20: IR-Spektrum von 8 (unten) im Vergleich zu den beiden Ausgangsprodukten 1 (Mitte) und 5
(oben).
Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung
- 80 -
4.3.4 Zusammenfassung
Die Versuche konnten zeigen, dass das Azidoundekandisulfid ohne Probleme an die
Oberfläche bindet und dort einen SAM ausbildet. Auch die Reaktion des Ethinyl-Ferrocens
mit dem azido-terminierten SAM läuft unter milden Bedingungen ohne Nebenprodukte ab.
4.4 Addition von Azido-Essigsäure an 11-thioacetyl-undekansäure-
propargyl amid an der Oberfläche
4.4.1 Azido-Essigsäure
Die Azido-Essigsäure wurde in Kooperation mit Herrn D. Köster am Lehrstuhl für
Anorganische Chemie I synthetisiert. Die Synthese erfolgte nach Literaturvorschrift 152. Das
Produkt wurde mittels ATR-IR charakterisiert. Zusätzlich wurde ein IR-Spektrum simuliert
und mit den gemessenen Spektren verglichen. Diese Spektren sind in Abbildung 4.21 gezeigt.
2500 2000 1500 1000 500-0,4-0,20,00,20,40,60,81,01,21,41,61,82,02,2
Simulation ATR-Spektrum
Inte
nsitä
t
Wellenzahl [cm-1]
Abb.4.21: Simuliertes Spektrum der Azidoessigsäure. Die beiden stärksten Banden liegen bei
2105cm-1 (Azid) und 1705cm-1 (Carbonsäure).
Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung
- 81 -
Die Banden für die Azid-Gruppe (2105cm-1) und die Carbonsäure (1709cm-1) sind deutlich zu
erkennen. Das experimentelle Spektrum zeigt diese Banden bei 2104cm-1 (Azid) und
1719cm-1 (Carbonsäure).
4.4.2 11-thioacetyl-undekansäure-propargylamid
Das 11-thioacetyl-undekansäure-propargylamid (Alkinthiol) wurde bereits in den Kapitel
4.1.2 und 4.2.1 ausführlich beschrieben.
4.4.3 N-((1H-1,2,3 triazol-4-yl)acetyl)-11-mercapto-undekanamid
Abbildung 4.22 zeigt das experimentelle IR-Spektrum des N-((1H-1,2,3-triazol-4-yl)acetyl)-
11- mercaptoundekanamid (6) im Vergleich mit einem simulierten Spektrum. Zum besseren
Vergleich wurden die wichtigsten Banden der Spektren in Tabelle 4.6 zusammengefasst.
2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2 SAM Simulation
norm
. Int
ensi
tät
Wellenzahl [cm-1]
Abb.4.22: IR-Spektrum des Click-Produktes (Experiment) im Vergleich zu einem simulierten Spektrum
des Click-Produktes.
Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung
- 82 -
Tab. 4.6: Zusammenfassung der wichtigsten IR-Banden für das Reaktionsprodukt 6 aus 2 und 3 und
der Simulation von 6.
Gruppe Wellenzahl [cm-1]
Literatur Simulation
von 6
Experiment von 6
ν-COOH 1600-1750/ - 1702/1128 1717/1111 ν-C=O (Alkanrückgrat) 1600 1629,45 1624,06 ν-C-N (Alkanrückgrat) 1500 1538,95 - δ-C-N (Alkanrückgrat) 1000-1500 1157,13 1167,89 ν-N-N (Triazolring) - 1215 1210
Die durch die Carboxylgruppe der angelagerten Essigsäure verursachten Banden sind sowohl
in der Sumulation bei 1702 cm-1/1128 cm-1 als auch im experimentellen Spektrum bei
1717cm-1/1111 cm-1 gut erkennbar. Banden bei 1215cm-1 (Simulation) and 1210cm-1
(Schulter/SAM) werden durch N-N-Streckschwingungen im Triazolring verursacht. In der
Simulation finden sich drei Banden bei 1157cm-1, 1538cm-1 und 1629cm-1. Diese werden
durch die C=O-Streckschwingung (1629cm-1), die C-N-Streckschwingung (1538cm-1) und
die C-N-Deformationsschwingung (1157cm-1) der R-CO-NH-R-Gruppe im Alkanrückgrat
verursacht. Im experimentellen Spektrum finden sich hingegen nur 2 Banden bei 1167cm-1
(C-N-Deformationsschwingung) und 1624cm-1 (C=O-Streckschwingung). Die Bande, die zur
C-N-Streckschwingung gehört ist nicht auffindbar, was an der Oberflächenauswahlregel
liegen könnte. Eine eventuelle Dimerisierung freier Essigsäuremoleküle mit bereits an den
SAM addierten Säurefunktionen tritt nicht auf, da man sonst die sehr auffällige Azidbande
(2100cm-1) sehen müsste.
4.4.4. Zusammenfassung
Die Versuche konnten zeigen, dass die Azidoessigsäure (3) selektiv an den SAM aus
11-thioacetyl-undekansäure-propargylamid (2) bindet. Es treten auch keine Säuredimere auf;
der Click-Chemie Ansatz ist also sehr geeignet, um säure-terminierte SAMs zu generieren.
Kapitel 5 Proteinresistente Thiole
- 83 -
5 Synthese und Charakterisierung proteinresistenter Thiole auf
der Basis von Peptiden
In Kapitel 4 wurde die 1,3-dipolare Cycloaddition (Huisgen-Reaktion) eingehend an
verschiedenen Alkin/Azid-Systemen untersucht. In diesem Teil der Arbeit wird diese
Reaktion verwendet, um Thiole mit Peptiden zu verbinden. Von den so synthetisierten
Peptidthiolen werden SAMs hergestellt. Anschließend soll die Proteinresistenz gegen
Streptavidin, Rinder Serum Albumin (bovin serum albumin, BSA) und Fibronectin gemessen
werden. Die Grundlagen und Motivation zu diesem Thema wurden in Kapitel 2 eingehend
erklärt.
Im ersten Schritt wird dafür eine Aminosäure-Sequenz mit einer Länge von 10 Aminosäuren
ausgewählt und zum Aufbau der Peptid-SAMs eingesetzt.
Bei der Auswahl der ersten Aminosäuren-Sequenzen werden die bisher bekannten
Erklärungsansätze zur Proteinresistenz von organischen Oberflächen berücksichtigt. Nach
einer eingehenden Charakterisierung von Struktur und Proteinresistenz dieser ersten
Generation von Peptid-SAMs sollen dann in weiteren Optimierungsschritten die Stabilität und
die Proteinresistenz verbessert werden. Zudem werden die Eigenschaften dieses Peptid-SAMs
mit denen eines Peptid-SAMs verglichen, von dem man auf Grund hoher Hydrophobizität
davon ausgehen kann, dass Proteine stark unspezifisch auf ihnen adsorbieren. Die gewählten
Peptidsequenzen und der verwendete Thiolanker sind in Abbildung 5.1 dargestellt. Das
hydroph
Abb.5.1: Schematische Darstellung der verwendeten Peptide und des Thiolankers (vgl. Kapite 4
Substanz 2). Peptid-1 (A) ist aus hydrophilen Aminosäuren (Serin (Ser), Lysin (Lys), Threonin (Thr))
und Gly aufgebaut. Gly ist nicht hydrophil, aber wichtig für die helikale Struktur des Peptids. Peptid-2
(B) ist eine einfache Kette aus den Aminosäuren mit hydrophoben Seitenketten: Leucin (Leu), Alanin
(Ala) und Prolin (Pro).
Kapitel 5 Proteinresistente Thiole
- 84 -
hydrophile Peptid A wird im Folgenden der Einfachheit halber als Peptid-1 (M=1,2kDa)
bezeichnet, das hydrophobe (B) als Peptid-2 (M=1,2kDa). Die Auswahl der ersten Peptid-
Aminosäuresequenz für die Peptid-SAMs wurde auf der Basis der folgenden Überlegungen
vorgenommen: Auf hydrophobe Seitenketten kann verzichtet werden, da hydrophobe
Wechselwirkungen die unspezifische Proteinadsorption (siehe Kapitel 2) nur verstärken
würden. Beschränkt man sich auf die 20 proteinogenen Aminosäuren, so scheiden durch
dieses Kriterium Phe, Tyr, Trp, Pro, Ile, Leu und Val aus. Die beiden kleinsten Aminosäuren,
Gly und Ala, werden zwar formal auch als hydrophob charakterisiert, trotzdem soll auf diese
beiden Aminosäuren - wegen ihrer hohen Bedeutung für die Flexibilität der Peptidstrukturen -
nicht verzichtet werden. Wenn diese Aminosäuren vereinzelt in das Peptid eingebaut werden,
sollte aber immer, durch Einbau hydrophiler Nachbarn, der polare Charakter überwiegen. Bei
der terminalen Position sollte eine neutrale Aminosäure (z.B. Ser oder Thr) verwendet
werden.
Da die Peptid-SAMs auf Goldoberflächen aufgebracht werden sollen, ist es sinnvoll, in
diesem Projekt auf schwefelhaltige Aminosäuren zu verzichten, da ansonsten der
Filmbildungsprozess gestört werden kann (derartige Aminosäuren können - unter Ausbildung
von Thiolaten - direkt an die Au-Oberfläche binden156, 157). Aus diesem Grund sollen Cys und
Met nicht verwendet werden. Damit verbleiben noch 11 Aminosäuren: Ala, Arg, Asn, Asp,
Gln, Glu, Gly, His, Lys, Ser und Thr.
Die günstigen Eigenschaften, die die helikale Konformation der Oligoethylenglykoleinheiten
im Hinblick auf die Proteinresistenz aufweisen (siehe oben), legen es nahe, auch für die hier
zum Einsatz kommenden Peptide eine α-helikale Struktur anzustreben. Derartige α-helikale
Peptide sind bereits auf Oberflächen aufgebracht und hinsichtlich ihrer Orientierung und ihrer
lateralen Packungsdichte charakterisiert worden 49-56, 59, 60, 64. Bei diesen Experimenten wurde
bei den helikalen Peptiden ein zum Dipolmoment der Ethylenglykole analoges
„Helixdipolmoment“ festgestellt.
Abb.5.2: Schematische Darstellung eines kurzen Peptidthiols bestehend aus wenigen Aminosäuren.
Kapitel 5 Proteinresistente Thiole
- 85 -
Die strukturbildenden Eigenschaften von Aminosäuren sind gut untersucht. Starke α-
Helixbildner sind Ala, Lys, Glu, Leu und Met, darüber hinaus gibt es eine Reihe von
schwachen bzw. „helix-neutralen“ Aminosäuren. Wegen der hydrophoben Eigenschaften der
Helixbildner ist es vorzuziehen, dass diese Aminosäuren sich eher im Inneren des Peptid-
SAMs befinden, um unerwünschte, hydrophobe Wechselwirkungen mit dem Wasser bzw. mit
den Proteinmolekülen zu vermeiden.
Im Hinblick auf den Aufbau der proteophoben Peptid-SAMs soll eine Sequenzlänge von etwa
10 Aminosäuren angestrebt werden, damit innerhalb eines einzelnen Peptids eine komplette
Windung einer Peptid α-Helix realisiert werden kann.
Ein rein kombinatorischer Zugang ergibt damit selbst unter den oben genannten
Einschränkungen noch deutlich zu viele Peptidsequenzen. Aus diesen Gründen wurde
zusätzlich auf den Einsatz geladener Aminosäuren verzichtet. Als Nebeneffekt wird damit
auch eine elektrostatisch vermittelte Proteinadsorption verhindert. An dieser Stelle soll noch
einmal speziell darauf hingewiesen werden, dass nicht nur die letzten 3 bis 4 Aminosäuren,
die dem Protein an der Petid-SAM-Oberfläche direkt zugänglich sind, bei der Adsorption eine
wichtige Rolle spielen. Frühere Untersuchungen (siehe Kapitel 2) haben eindeutig gezeigt,
dass auch die innere Struktur der SAMs relevant ist (z.B. im Zusammenhang mit der
Einlagerung von Wassermolekülen).
5.1 Synthese und Chrakterisierung der Peptide
Die Peptide wurden in einem kommerziellen Mikrowellen Peptid Synthesizer (Firma CEM)
hergestellt. Der Ansatz bestand dabei aus 0,1 mM Leu-Wang-Harz (Beladung 0,69 mmol/g),
0,2 M Aminosäure-lösungen in DMF and 0,5 M Aktivator TBTU/HOBt und 2 M DIPEA
Lösung 158. Die fertigen Peptide wurden anschließend über Electrospray Ionisierungs
Massenspektrometrie (ESI-MS) 159, MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/ Ionization)
und Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (HPLC) charakterisiert. Die Synthese und
Charakterisierung solcher Oligo-Peptide ist in der Literatur weit verbreitet und standardisiert,
weshalb hier nicht weiter darauf eingegangen werden soll.
5.2 Synthese und Charakterisierung der Peptidthiole
Für die Click-Reaktion wurden die Peptide für 72 Stunden in einer Lösung aus CuI
(0,2123mmol), DIPEA (12,735mmol) und 11-thioacetyl-undekansäure-propargyl amid
Kapitel 5 Proteinresistente Thiole
- 86 -
(0,1698 mmol) in DMF (1,1ml) inkubiert. Für die Experimente wurde eine Stammlösung der
Peptide in Ethanol angesetzt (c=36mM). Für die weiteren Experimente wurden je 200µl der
Stammlösung mit 7ml Ethanol verdünnt, um eine 1mM Lösung an Peptidthiol zu erhalten.
5.2.1 Peptid-1-Thiol
Abbildung 5.2 zeigt das Ergebnis der HPLC von Peptid-1. Es ist klar ersichtlich, dass die
Substanz in großer Reinheit vorliegt. Zur Bestätigung, dass es sich um das gewünschte
Produkt handelt wurde zusätzlich ein ESI-MS aufgenommen.
0 5 10 15 20-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0Molekülbande: 6,634
Basislinie
norm
. Int
ensi
tät
Zeit [min]
Abb.5.3: HPLC-Spektrum des Produktes aus der Synthese von Peptid-1.
d
In Abbildung 5.4 ist das Massenspektrum des synthetisierten Peptidthiols dargestellt. Im
Folgenden sind die drei wichtigsten Peaks aufgeführt:
[M+H]+/2 bei m/z= 617,26
[M+H]+ bei m/z= 1233,80
[M+Na]+ bei m/z= 1258,90
Kapitel 5 Proteinresistente Thiole
- 87 -
1000 1200
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1258,90
1233,80
x 7,5
norm
. Int
ensi
tät
Masse [m/z]
600 610 620 630 640 650
617,23
norm
.Inte
nsitä
t
Masse [m/z]
Abb.5.4: ESI-MS-Spektren des Peptid-1-Thiol. Im oberen Spektrum ist der Bereich von m/z = 1000-
1300 gezeigt, indem der Massenpeak deutlich zu erkennen ist. Im unteren Spektrum ist eine
Vergrößerung des Bereichs von m/z = 600-650 gezeigt, indem der „Halbmassen“-Peak von
m/z = 617,23 zu erkennen ist.
Kapitel 5 Proteinresistente Thiole
- 88 -
Sowohl der Massenpeak (1233,8) als auch der „Halbmassen-Peak“ bei 617,26 sind deutlich
und leicht identifizierbar. Weitere Teilfragmente können identifiziert werden. Die drei
stärksten sind im Folgenden exemplarisch dargestellt:
Peak bei 256,15
Peak bei 383,18
Peak bei 532,24
Aus den Massenspektren kann eindeutig auf das gewünschte Peptidthiol geschlossen werden.
Die HPLC zeigt zusätzlich, dass die Substanz in großer Reinheit vorliegt.
Abb.5.5: XPS Spektren des Peptid-1-Thiol SAM und des CH3 terminierten SAM (Oktadekanthiol) im
direkten Vergleich. Es sind die Au4f, die C1s, die S2p, die O1s und die N1s Region gezeigt.
O
S
O
HN
O
S
O
NN
NH2CC
O
HN CH2 C
O
HN CH C
CH2
O
CH2
CH2
CH2
NH2
HN CH2 C
O
HN CH C
CH2
O
OH
HN CH C
CH2
O
OH
HN CH2 C
O
HN CH
CH2
OH
Kapitel 5 Proteinresistente Thiole
- 89 -
Zur weiteren Charakterisierung wurden mit dem Peptid-1-Thiol-SAM XPS Messungen
durchgeführt. Hierzu wurde zusätzlich ein SAM aus Oktadekanthiol hergestellt. Beide Proben
wurden dann zusammen auf denselben Probenhalter aufgebaut. Anschließend wurden sie
zusammen in die XPS-Apparatur eingeschleust und vermessen. Dieser Aufbau erlaubt die
Bestimmung der Höhe des Peptid-1-Thiol-SAMs, indem die Höhe des Oktadekanthiol SAMs
als Referenz genommen wird. Die Berechnung erfolgt über folgende Formel160:
( ) ( ) ⎟⎠⎞
⎜⎝⎛
⎟⎠⎞
⎜⎝⎛ −÷⎟
⎠⎞
⎜⎝⎛∗⎟
⎠⎞
⎜⎝⎛
⎟⎠⎞
⎜⎝⎛÷⎟
⎠⎞
⎜⎝⎛ −=÷
−−−− )()(
)()(
)()(
)()(
11)()( )()(
)()( ads
refdmetrefd
metsampled
adssampled
eeeerefsample metIadsI
metIadsI λλλλ .
Für die Analyse der Daten wurden die Flächen unter den Au4f- und C1s-Banden integriert.
Anschließend wurde oben stehende Gleichung numerisch gelöst. Um die Schichtdicke des
Peptid-1-Thiol SAMs zu bestimmen wurde zudem für das Oktdekanthiol eine Schichtdicke
von 22Å und eine mittlere freie Weglänge von λ(met) = 39,9Å und λ(ads) = 35,5Å
angenommen161.
Mit diesen Werten aus der Literatur ergibt sich die Schichtdicke des Peptid-1-Thiol-SAMs zu
(56,6±6)Å. Dieses Ergebnis korreliert gut mit der Länge, die man für den reinen Thiolanker
(20,8Å) und ein Dekapeptid erwarten würde, welches zu einem β-Faltblatt (~30Å) geordnet
ist (oder eine nur leicht gedrehte α-Helix). Ein starke α-Helix (wie man sie in nativen
Proteinen vorfindet) hätte nur eine Länge von etwa 16Å (zusammen mit dem Thiolanker also
nur etwa 37Å).
Auf Grund der höheren Schichtdicke ist das Au4f-Signal im Peptid-1Thiol-SAM kleiner als
im Oktadekanthiol-SAM. Diese hohe Schichtdicke ist ebenfalls dafür verantwortlich, dass das
Schwefelsignal des Thiolankers nicht mehr detektiert werden kann. Die Anwesenheit der
Aminosäuren -welche Kohlenstoffatome in verschiedenen Oxidationsstufen enthalten- führt
zu einer Verbreiterung der C1s-Bande. Die Anwesenheit der Amninosäuren wird auch in den
N1s- und O1s-Banden sichtbar, da die Banden an typischen Positionen für –NH; -NR2, -OH
und -COOH-Gruppen liegen.
Die stöchiometrische Auswertung führt zu CnO0,37nN0,19n; es ist also fast doppelt soviel
Sauerstoff wie Stickstoff enthalten, was gut mit der Sequenz des Peptid-1-thiols
übereinstimmt.
5.2.2 Peptid-2-Thiol
Abbildung 5.6 zeigt das ESI-MS des Peptid-2-thiols. Gemessen wurde im Negativmodus (An
Kapitel 5 Proteinresistente Thiole
- 90 -
der Kapillare wird eine negative Spannung angelegt, so dass negative Molekülionen [M-H]-
entstehen, die dann zum Detektor hin beschleunigt werden). Der Massenpeak bei
m/z = 1202,46 ist gut sichtbar. Die anderen Peaks können einzelnen Fragmenten zugeordnet
werden. Zur weiteren Bestätigung wurde noch ein MALDI-Spektrum (Positivmodus; es wird
eine positive Spannung angelegt, so dass positive Moleküionen [M-H]+ entstehen)
angefertigt. Dieses ist in Abbildung 5.6 dargestellt.
Das ESI-MS zeigt einen deutlichen Massen-Peak bei [M-H]-=1202,46. Dieser Peak entspricht
der Masse des Peptid-2-thiols (M=1202,5g/mol). Im MALDI-Spektrum ist der Hauptpeak bei
m/z = 1205,8 zu erkennen. Dieser Peak bei m/z = 1205,8 kann [M+H]+ zugeordnet werden.
Die Masse des [M+H]+-Peaks ist 2g/mol daneben, was aber im MALDI nichts
Ungewöhnliches ist.
0 500 1000 15000,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1202,46
norm
. Int
ensi
tät
Masse [m/z]
Abb.5.6: ESI-MS-Spektrum des Peptid-2-Thiols. Der Peak bei m/z = 1202,46 gehört zu [M-H]-
Kapitel 5 Proteinresistente Thiole
- 91 -
600 800 1000 1200 1400
0
50
100
150
200
250
1268,77
1205,77
Inte
nsitä
t
Masse [m/z]
Abb.5.7: MALDI-Spektrum des Peptid-2-Thiols. Der Peak bei m/z = 1205,8 gehört zu [M+H]+. 5.3 Herstellung der Peptid-SAMs
Die Au/Si Wafer wurden wie beschrieben (Siehe Kapitel 3.1) hergestellt und anschließend in
Stücke von 20mm x 30mm geschnitten; dann wurden sie mit abs. Ethanol gesäubert und
letztlich im Stickstoffstrom getrocknet. Die Wafer wurden dann für 24 Stunden in einer 1mM
Lösung der Peptidthiole eingelegt. Anschließend wurden die fertigen Substrate mit abs.
Ethanol gewaschen und bis zum Gebrauch in Ethanol gelagert. Die so präparierten SAMs
wurden mittels IR-Spektroskopie charakterisiert.
Abbildung 5.7 zeigt das KBr-IR-Spektrum des Peptid-1-Thiols im Vergleich zum
IR-Spektrum des Peptid-1-SAMs. Die Peaks sind in Tabelle 5.1 zusammengefasst. Die für
Oliogopeptide (bzw. Proteine) charakteristischen Amid-Banden (-A, -I, -II, -III and -IV) sind
deutlich zu erkennen.
Kapitel 5 Proteinresistente Thiole
- 92 -
Abb.5.8: Vergleich der IR Spektren des Peptid-1-Thiols im Volumen (KBr-Pressling) und im SAM. Tab.5.1: Zusammenfassung der wichtigsten Banden für das Peptid-1-Thiol im Volumen und im SAM.
Wellenzahl [cm-1]
Gruppe KBr SAM
Amid-A 3330 3291
Amid-I 1673 1690
Amid-II 1546 1545
Amid-III 1130 1078
Amid-IV 826 802
C=C (Triazolring) 3069 3073
CH (aliphatisch) 2931 2917
Die gleichen Experimente wurden mit dem Peptid-2-Thiol wiederholt und führten zum selben
Ergebnis; da aus den Daten keine neuen Erkenntnisse gewonnen werden können, kann auf
eine detaillierte Darstellung verzichtet werden.
Kapitel 5 Proteinresistente Thiole
- 93 -
5.4 Oberflächenplasmonenresonanz
Dünne Glasscheiben (D263T) mit den Maßen 10x10x0,9mm (Schott) wurden mit Ethanol
gewaschen und im Stickstoffstrom getrocknet. Anschließend wurden sie, wie in Kapitel 3.1
beschrieben, bedampft. Die endgültige Schichtdicke des Titanfilms betrug dabei 12Å, die des
Goldfilms 500Å. Die beschichteten Glassubstrate wurden dann für 24 Stunden in der
jeweiligen Peptidthiollösung (c=1mM) inkubiert. Die so präparierten Substrate wurden
anschließend mit abs. Ethanol gewaschen, im Stickstoffstrom getrocknet und in ein
kommerzielles Oberflächenplasmonenresonanz-Spektrometer (Reichert SR7000DC, Xantec
bioanalytics) eingebaut.
Als erstes wurde die Adsorption von SA (c=200nM≈0.01mg/ml, Invitrogen) gemessen,
anschließend die Adsorption von BSA (c=2µM≈130mg/ml, SIGMA) und zuletzt die
Adsorption von Fibronectin (c=200nM, SIGMA).
Die Adsorptionsmessungen wurden dabei nach folgendem Protokoll durchgeführt: Zuerst
wurde die Oberfläche mit TRIS-Puffer (pH 7,9, 50mM TRIS, 5mM MgCl2) für 5 min gespült;
dann wurden die Proteinlösungen für 1 min injiziert und die Oberfläche anschließend für
1 Minute mit Puffer gewaschen. Abschließend wurde die Oberfläche für weitere 5 Minuten
mit TRIS-Puffer gespült. Die Flussrate betrug bei allen Experimenten 0,2ml/min.
Zur Kontrolle der Ergebnisse aus der SPR-Technik wurden IR-Experimente mit längeren
Adsorptionszeiten (15, 30 Minuten) durchgeführt.
5.4.1 Adsorption von Streptavidin
Zuerst wurde die Adsorption von Streptavidin auf dem Peptid-1-SAM gemessen. Zum
Vergleich wurden Messungen auf dem Peptid-2-SAM, einem CH3-terminierten SAM und
einem OEG(6)-terminierten SAM vorgenommen. Der CH3-terminierte SAM gilt dabei als
SAM, auf dem sehr leicht und sehr stark unspezifische Adsorption stattfindet, während der
OEG(6)-SAM proteinresistent ist. Die Ergebnisse der Messungen sind in Abbildung 5.8
dargestellt. Tabelle 5.2 fasst die Ergebnisse der Adsorptionsmessungen zusammen. Auf dem
CH3-terminierten SAM und dem Peptid-2-SAM ist die unspezifische Adsorption
erwartungsgemäß stark (CH3: mAds=66,3ng/cm²; Peptid-2: 62,3ng/cm²). Auf dem OEG(6)-
SAM kann keine Adsorption festgestellt werden (mAds= 0ng/cm²). Lediglich ein geringer
Puffersprung kann beobachtet werden, der nach Beendigung der Protein-Injektion aber wieder
vollständig verschwindet. Die Messungen für den Peptid-1-SAM zeigen das gleiche Ergebnis
wie für den OEG(6)-SAM. Es ist keine Adsorption feststellbar, der Puffersprung ist
Kapitel 5 Proteinresistente Thiole
- 94 -
wesentlich geringer. Gegen Streptavidin zeigt der Peptidthiol-SAM also eine 100%-ige
Proteinresistenz. Für einen besseren Vergleich mit der Literatur wurden die Messungen mit
einer Streptavidinkozentration von c(SA)=1mg/ml wiederholt, die Injektionszeit wurde bei
diesen Messungen auf 10min erhöht, um ebenfalls der Literatur besser zu
entsprechen.
0 50 100 150 2000
50100150200250300350400450500550600650700
mAds66,3ng/cm²
EndeBeginn
Peptid-1 SAM
OEG(6) SAM
CH3 SAM
Ads
orpt
ion
[ng/
cm²]
Zeit [sec]
Abb.5.9: Zusammenfassung der Adsorptionskurven für Streptavidin auf den verschieden terminierten
SAMs. Der Beginn und das Ende der Inkubation der Streptavidinlösung sind mit senkrechten Linien
gekennzeichnet. Der Übersicht halber ist die Kurve für den Peptid-2-SAM nicht gezeigt.
Tab.5.2: Zusammenfassung der Streptavidinadsorption.
SAM CH3 Peptid-2 OEG(6) Peptid-1 mAds [ng/cm²] c=0,01 mg/ml 66,3 62,3 ≤0,1 ≤0,1 mAds [ng/cm²] c=1,00 mg/ml 131,02 - ≤0,1 4,06
Die Messungen mit den höheren Konzentrationen bestätigen dabei tendenziell die Ergebnisse,
die mit den niedrigeren Konzentrationen erzielt wurden.
Für die IR-Messungen wurden Wafer, wie in Kapitel 5.3 beschrieben, präpariert.
Kapitel 5 Proteinresistente Thiole
- 95 -
Anschließend wurde ein IR-Spektrum aufgenommen. Danach wurde der Wafer in einer
200nM-Streptavidinlösung inkubiert. Nach 15 Minuten wurde ein weiteres IR-Spektrum
aufgenommen (Abbildung 5.10). Es ist eindeutig zu erkennen, dass sich die Signale auch mit
fortschreitender Inkubationszeit nicht verändern, dass heißt, dass kein Protein auf die
Oberfläche adsorbiert. Die Banden der IR-Messungen sind in Tabelle 5.3 zusammengefasst.
Abb.5.10: IR Spektren des Peptid-1-Thiol-SAMs als Volumenspektrum (KBr, oberes Spektrum) und
an der Oberfläche vor (unteres Spektrum) und nach (mittleres Spektrum) Inkubation des Streptavidins
(15min).
Tab.5.3: Vergleich der IR-Spektren im Volumen und an der Oberfläche vor und nach Adsorption des Streptavidins. Gruppe KBr vor
Inkubationnach
InkubationAmid-A 3330 3291 3303 C=C (Triazol-Ring) 3069 3073 3067 CH (aliphatisch) 2931 2927 2924 Amid-I 1673 1690 1689 Amid-II 1546 1545 1545 Amid-III 1130 1078 1081 Amid-IV 826 802 811
Die charakteristischen Amid-Banden (-A, -I, -II, -III and -IV) sind deutlich zu erkennen. Das
Spektrum des Peptid-1-Thiol-SAMs wird durch die Adsorption des Streptavidins nicht
beeinflusst.
Kapitel 5 Proteinresistente Thiole
- 96 -
5.4.2 Adsorption von BSA
Im nächsten Schritt wurde die Adsorption von BSA auf dem Peptid-1-SAM gemessen und
mit der Adsorption auf einem CH3-terminierten, einem OH-terminierten und einem OEG(6)-
terminierten SAM verglichen. Abbildung 5.9 zeigt die Ergebnisse dieser Messungen.
Tabelle 5.3 fasst die Ergebnisse dieser Messungen zusammen. Es ist sehr gut ersichtlich, dass
keine vollständige Proteinresistenz des Peptid-1-SAMs gegen BSA vorliegt. Die
Größenordnung der Adsorption liegt nahe am Bereich wie für den OEG(6)-SAM (Daten nicht
gezeigt); Dies ist ein gutes Ergebnis, vor allem wenn man berücksichtigt, dass die
Proteinkonzentration mit c(BSA)=2µM sehr hoch ist.
50 100 150600
650
700
750
800
850
- 60,0 ng/cm²- 13,5 ng/cm²- 6,3 ng/cm²
CH3 OH Peptid1
Ads
orpt
ion
[ng/
cm²]
Zeit [sec]
Abb.5.11: Zusammenfassung der Adsorption von BSA auf die verschieden terminierten SAMs. Zur
Veranschaulichung wurde im Falle des Peptid-1-SAMs eine Basislinie (vor der Proteininjektion)
eingefügt. Tab.5.4: Zusammenfassung der Adsorption von BSA.
SAM CH3 OH OEG(6) Peptid-1 mAds [ng/cm²] 60 13,5 ≤0,1 6,3
Auf IR-Messungen wurde hier verzichtet, da schon die vorherigen Experimente gezeigt
Kapitel 5 Proteinresistente Thiole
- 97 -
haben, dass die 1-minütigen Inkubationen vollkommen ausreichend sind. Für BSA erhält man
also keine vollständige Proteinresistenz des Peptid-1-SAM. Die Größenordnung liegt aber
nahe an der auf einem OEG(6)-terminierten SAM und unter der auf einem OH-terminierten
SAM.
5.4.3 Adsorption von Fibronectin
20 40 60 80 100 120700
720
740
760
780
800- 12,6 ng/cm²- 2,3 ng/cm²
OH Peptid1
adso
rptio
n [n
g/cm
²]
time [sec]
Abb.5.12: Adsorptionskurven für Fibronectin auf einem OH- und dem Peptid-1-terminierten SAM.
Als letztes wurde die Adsorption von Fibronectin auf dem Peptid-1-SAM gemessen. Zum
Vergleich wurde zusätzlich die Adsorption auf einem CH3-terminierten und einem OEG(6)-
terminierten SAM gemessen. Abbildung 5.10 fasst die erhaltenen Adsorptionskurven
zusammen. In Tabelle 5.4 sind die adsorbierten Mengen zusammengefasst. Für den Peptid-1-
terminierten SAM ergibt sich eine Adsorption von mAds=2,3ng/cm². Für den OH-terminierten
SAM beträgt die Adsorption bereits mAds= 12,6ng/cm² und für den CH3-terminierten
mAds= 55,3ng/cm². Auf dem OEG-terminierten SAM kann keine Adsorption festgestellt
werden. Auch hier erhält man keine vollständige Proteinresistenz des Peptid-1-SAM, dennoch
Kapitel 5 Proteinresistente Thiole
- 98 -
kann ein starkes proteophobes Verhalten des SAMs charakterisiert werden. Tab.5.5: Zusammenfassung der Adsorption von Fibronectin.
SAM CH3 OH OEG(6) Peptid-1 mAds [ng/cm²] 55,3 12,6 ≤0,1 2,3
Kapitel 6 Zusammenfassung und Ausblick
- 99 -
6 Zusammenfassung und Ausblick
Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Untersuchung der Interaktion von Proteinen mit
verschieden terminierten organischen Oberflächen. Diese Interaktionen wurden differenziert
mittels spektroskopischer Verfahren charakterisiert.
Oberflächenplasmonenresonanz-Spektroskopie (SPR) diente dabei als Methode, um die
biologischen Aspekte/Eigenschaften und das Adsorptionsverhalten der verwendeten Proteine
auf die organischen/bioorganischen SAMs in physiologischer Umgebung zu bestimmen. Die
chemische Identität der verwendeten Substanzen und der hergestellten SAMs wurde an Luft
über Infrarot-Reflexions-Absorptions Spektroskopie (IRRAS) nachgewiesen. Strukturelle
Eigenschaften der verwendeten Substanzen, sowie der hergestellten SAMs wurden im
Ultrahochvakuum über Röntgenphotoelektronen-Spektroskopie (XPS) bzw.
Röntgenabsorptions-Spektroskopie (NEXAFS) charakterisiert.
6.1 Die biologische Aktivität oberflächengebundener Mehrschichten-
systeme: das Biotin- Streptavidin-Peroxidase System
Die Verankerung einer biotinylierten Peroxidase (bHRP) an zweidimensional strukturierte
Streptavidin-Assays wurde untersucht. Die Assays wurden dabei über einen 2-Schritt
Mechanismus hergestellt. Zuerst wurde eine zweidimensional strukturierte Oberfläche über
µCP aufgebaut, die zu einem Teil aus 10%-Biotinthiol und zum anderen Teil aus
OEG(6)-Thiol bestand. An den biotinthiolhaltigen Bereich wurde dann in einem zweiten
Schritt das Streptavidin spezifisch adsorbiert. Durch die Kombination verschiedener
Techniken (SPR, AFM, Photometrie) konnte dann ein konsistentes Bild der Peroxidase-
adsorption erstellt werden.
Die Interaktion von bHRP und Streptavidin ist höchst spezifisch, was über Versuche mit
verschiedenen Mengen an oberflächengebundenen Streptavidin nachgewiesen werden konnte.
Die Orientierung der adsorbierten bHRP hängt dabei mit der Menge an adsorbiertem
Streptavidin zusammen: Das molare Verhältnis zwischen bHRP und Streptavidn ändert sich
von 1:2,25 zu 1:1,13, wenn man zu höheren Streptavidinoberflächenbelegungen übergeht.
Die zweidimensionale Struktur der Proben konnte im AFM eindeutig nachgewiesen werden.
Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass sich echte Monolagen an Protein ausbilden und die
einzelnen Lagen zudem sehr homogen sind und keine großen Defekte aufweisen.
Die biologische Aktivität der adsorbierten bHRP-Moleküle wurde über photometrische
Kapitel 6 Zusammenfassung und Ausblick
- 100 -
Messungen bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass die bHRP ihre katalytische Aktivität
beibehält, selbst wenn sie unspezifisch an die Oberfläche gebunden wird. Nichtsdestotrotz ist
die Aktivität an der Oberfläche bis zu 5mal kleiner als in Lösung, da die dichtgepackten
Moleküle um das Substrat konkurrieren.
Für zukünftige Arbeiten könnte es interessant sein, den Einfluss der Orientierung auf der
Oberfläche auf die Aktivität der adsorbierten bHRP zu untersuchen. dafür könnten
Peroxidase-Moleküle benutzt werden, die mit speziellen Biotinankern versehen sind (z.B. an
Cystein) oder durch gezielte Mutation nur noch bestimmte Bindungsstellen besitzen. Die
Oberflächenaktivität könnte dann eventuell für bessere quantitative Aktivitätsmessungen
kontrolliert werden.
6.2 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung
Die Addition von säure- und ferrocenterminierten Oberflächen wurde über verschiedene
Ansätze -Preformation in Lösung und Click-Chemie am SAM- verfolgt. Beide Strategien
beruhen auf der 1,3-dipolaren Cycloaddition von Aziden und Alkinen. Diese Art der Synthese
von Thiolen und Generierung von SAMs läuft unter sanften Bedingungen, ist billig und
höchst spezifisch.
Sowohl die Präformation der Thiole in Lösung mit anschließender Generierung des SAMs als
auch die Präformation der SAMs mit anschließender Click-Reaktion funktionieren in
Abhängigkeit der verwendeten Moleküle (und Reaktionsbedingungen 151).
Im Falle der Funktionaliserung mit Ferrocen ist die Strategie der Preformation in Lösung der
Reaktion am SAM deutlich überlegen. Erst der Wechsel der funktionellen Gruppe des
präinkubierten SAMs vom Alkin zum Azid und dem entsprechenden Wechsel der
funktionellen Gruppe des Additions-Substrats vom Azid zum Alkin führte zu einer
erfolgreichen Click-Reaktion an der Oberfläche. Dies ist deshalb überraschend, weil man eher
davon ausgehen könnte, dass das Alkin in Lösung vom Cu(I) komplexiert wird und sich
absetzt 151.
Die Kombination aus IR, XPS und NEXAFS-Daten hat sich als Methode zur
Charakteriserung der Ferrocenthiols-SAMs gut bewährt, da insbesondere im XPS/NEXAFS
das Cyclopentadienyleisen sehr gut charakterisiert werden kann.
Kapitel 6 Zusammenfassung und Ausblick
- 101 -
6.3 Proteinresistente Peptidthiole Tab.6.1: Zusammenfassung der Adsorptionsmessungen.
mAds [ng/cm²] (niedrige Konzentrationen) SAM Streptavidin Fibronectin BSA Peptid-1 ≤0,1 2,3 6,3
In diesem Teil der Arbeit wurde ein neuer Ansatz für die Generierung proteinresistenter
SAMs untersucht. Hierzu wurden kurze Petide aus 10 Aminosäuren synthetisiert und
charakterisiert. Nach der Charakterisierung wurden die Peptide über die im vorigen Kapitel
dargestellte 1,3-dipolare Addition mit Thiolankern verbunden, um diese anschließend auf
Goldwafern zu verankern. Die so hergestellten Peptid-SAMs wurden dann mittels IRRAS
charakterisiert. Letztendlich wurde dann die Proteinresistenz gegen drei verschiedene Proteine
gemessen (Streptavidin, BSA und Fibronectin). Die SPR-Messungen konnten zeigen, dass die
hergestellten Peptid-SAMs durchaus proteinresistente Eigenschaften besitzen. In Tabelle 6.1
sind die Ergebnisse der Adsorptionsmessungen nochmals zusammengefasst.
Die Adsorption aller Proteine liegt sehr nah an der Größenordnung der Adsorption auf einem
OEG(6)-terminierten SAM (≤0,1ng/cm²). Für Streptavidin ist der Peptid-1-SAM sogar fast
vollständig proteinresistent (≤4,06ng/cm²). Der Ansatz der Synthese von Dekapeptiden und
den entsprechenden Thiolen führt also zur Generierung stark proteophober SAMs, die im
Weiteren verbessert werden kann (Kombinatorik).
Die Möglivhkeit die Peptidsequenzen frei gestalten zu können bietet ausserdem die
Möglichkeit Oberflächen zu generieren, die spezifisch bestimmte Arten von komplexeren
Biomolekülen (spezielle Proteine, DNA, Thrombozyten oder sogar vollständige Zellen)
spezifisch binden und somit als Biosensoren eingesetzt werden können.
Kapitel 7 Literaturverzeichnis
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Kapitel 7 Literaturverzeichnis
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Anhang A Abkürzungsverzeichnis
- 115 -
Anhang A - Abkürzungsverzeichnis
Abkürzung Bedeutung Übersetzung Abb. Abbildung AFM atomic force microscop(y)e Rasterkraft - Mikoskop(ie) ATR attenuated total reflection Abnahme der Totalreflektion BSA bovine serum albumin Rinderserum-Albumin bHRP biotinylated horse radish peroxidase biotinylierte Meerrettichperoxidase bzw. beziehungsweise ca. circa ungefähr dest. destilliert DNA desoxyribonucleotidacid Desoxyribonukleinsäure EM elektromagnetische Welle(n) et al et alumni und Mitarbeiter etc. et cetera und so weiter EM elctron microscop(y)e Elektronenmikroskop(ie) engl. englisch: FFM friction force microscopy Reibungskraft-Mikroskopie LFM lateral force modus Lateralkraft - Modus Lit. Literatur NEXAFS near edge X-ray fine structure Röntgenabsorptionsspektroskopie OEG Oligoethylenglykol PDMS Polydimethylsiloxan PEG Poly-Ethylenglykol(e) PGMEA Propylenglykolmethyetheracetat PNA peptide nucleic acid Peptid-Nukleinsäure REM Rasterelektronenmikroskop(ie) RMS root mean square Quadratmittel SAM self assembled monolayer(s) selbstordnende Monolage(n) sog. sogenannte(r/s) s.o. siehe oben SP surface plasmon(s) Oberflächenplasmon(en) SPR surface plasmon resonance Oberflächenplasmonenresonanz
(-spectroscopy) (- Spektroskopie) STM scanning tunneling micrsoscop(y)e Rastertunnelmikroskop(ie) TEM Transmissionelektronenmikroskop(ie) u.a. und andere/s UV Ultraviolett VP volume plasmon(s) Volumenplasmon(en) WW Wechselwirkung(en)
XPS X-ray photo electron spectroscopy Röntgen- photoelektronenspektroskopie
Anhang B Abbildungsverzeichnis
- 116 -
Anhang B - Abbildungsverzeichnis Abb.2.1: Gezeigt sind OEG-Thiole mit unterschiedlicher Anzahl an Ethylenglykol-Gruppen. Mit
steigender Anzahl an Ethylenglykol-Gruppen nimmt die Proteinresistenz zu. Im Laufe der Zeit kommt
es durch die chemische Instabilität der OEG-Thiole zur Degradation (Abbau von Ethylenglykol-
Einheiten) und die Proteinresistenz geht verloren.
Abb.2.2: Selbstorganisation von Alkanthiolen. Die Moleküle werden über die Ankergruppe an der
Oberfläche festgehalten. Die funktionelle Gruppe bestimmt die Eigenschaften des SAM’s
Abb.2.3: Schematische Darstellung der Biotin-Bindungstasche des Streptavidins nach der Gruppe
von Freitag 93, 94. Die Pfeile symbolisieren antiparallele β-Faltblattstrukturen, wobei die unter
physiologischen Bedingungen irreversible Biotin-Streptavidin-Komplexbildung ausschließlich durch
nicht kovalente polare (linkes Bild) und unpolare (rechtes Bild) Wechselwirkungen zustande kommt.
Abb.2.4: Tetramere Struktur des Streptavidins (nach 92) mit vier gebundenen Biotinmolekülen. Es ist
zu erkennen, dass die Bindungstasche des Streptavidins relativ tief ist.
Abb.2.5: Monomere Struktur der HRP (links). Rechts ist der Biotinanker, das Biotinamidocaproyl
dargestellt. Die Biotinfunktion (roter Kreis) ist über eine C-N-Bindung mit dem restlichen Anker
verbunden. Die HRP besitzt die folgenden Maße (RCBS-Proteindatabank): 4,1nm x 4,1nm x 6,2nm.
Abb.2.6: Herstellung a) des Masters (Photolithographie) und b) des Stempels (PDMS).
Abb.2.7: Mikrokontakt-Printing eines Thiols auf Gold (schematische Darstellung). Nur an den
Kontaktflächen des Stempels mit der Goldoberfläche kann das Thiol an das Goldsubstrat binden.
Abb.2.8: Dispersionskurven von Oberflächen- (SP) und Volumenplasmonen (VP) im Vergleich zur
Dispersiongerade des Lichts. Die Lichtgerade und die Dispersionskurve für die SP schneiden sich
nicht, es kann also keine Energie- und Impulsübetragung auftreten.
Abb.2.9: Links: Schematische Darstellung der Plasmonenresonanzkurve zu zwei verschiedenen
Zeiten T1 und T2 eines Adsorptionsprozesses. Die Minima beim entsprechenden Resonanzwinkel
α1/α2 und die Verschiebung des Resonanzwinkels sind deutlich zu erkennen. Im rechten Bild ist die
Entstehung der entsprechenden Oberflächenkinetik dargestellt.
Abb.2.10: Die Bildung eines SAMs lässt sich in Realzeit mitels SPR verfolgen: nach Kontakt einer
sauberen Goldoberfläche mit reinem Ethanol ist das SPR-Signal erstmal konstant. Nach Zugabe einer
alkoholischen Lösung vom 11-Mercapto-undekanol (linker Pfeil) nimmt das SPR-Signal stark an
Intensität zu. Nach Ende des Kontakts mit der Thiollösung (rechter Pfeil) nimmt die Intensität des
Signals wieder ab, bleibt aber weit über dem Ausgangsniveau. Es hat sich eine organische
Dünnstschicht auf der goldoberfläche gebildet.
Anhang B Abbildungsverzeichnis
- 117 -
Abb.2.11: Schematische Darstellung des alten (links) und des neuen optischen Detektionsverfahrens
für die Auslenkung des Cantilevers (aus 108).
Abb.2.12: Schematische Darstellung und REM-Aufnahme der für Rasterkraftmikroskopie
verwendeten Spitzen für (Abbildungen links) den Tapping-Modus und (Abbildungen rechts) den
Kontakt-Modus (aus 109).
Abb.2.13: Der „Quad-Detektor“ des verwendeten Rasterkraftmikroskops der Firma Digital
Instruments. Verschiedene Segmente der Photodiode sind für die Gewinnung des Höhen- bzw.
Reibungssignals verantwortlich. Zur Gewinnung des Reibungssignals wird das Differenzsignal dCD = D
- C ausgewertet, während das Höhensignal über das Differenzsignal dAB = B - A berechnet wird 111.
Abb.2.14: Schematischer Aufbau eines Rasterkraftmikroskops im Tapping-Modus. Diese Art der
Mikroskopie ist hochempfindlich und fast vollkommen kontaktfrei, da bei optimaler Einstellung der
Parameter nur eine sehr kurze und leichte Berührung mit der Probe stattfindet 108.
Abb.2.15: Darstellung eine strukturierten Proteinfilms mittels Tapping-AFM in dest. Wasser. Im
Topgraphiemoduskann sehr schön die laterale Strukturierung der Oberfläche erkannt werden,
während im Linienspektrum (links) die Höhe der gemessenen Struktur ermittelt werden kann.
Abb.3.1: Schematischer Aufbau eines Mehrschichtsystems auf Basis der Streptavidin/Biotin-Bindung.
In diesem Fall wurde ein weiteres Protein mit einem Biotinanker versehen (biotinylierte
Meerrettichperoxidase) und an die bereits adsorbierte Streptavidinschicht angelagert.
Abb.3.2: Mechanismus der Farbreaktion von TMB, die von der HRP katalysiert wird. Das TMB wird
oxidiert und es wird ein Ladungstransfer-Komplex (im Gleichgewicht zum entsprechenden Radikal-
Kation) erhalten. Die Zugabe von Säure führt zum Farbstoff Tetramethyldiimin 136.
Abb.3.3: Darstellung der in diesem Kapitel verwendeten Thiole. Die OH-Thiole wurden zum
verdünnen des Biotin-Thiols verwendet.
Abb.3.4: REM-Aufnahmen des verwendeten Stempeltyps. Die Stempelflächen sind“quadratisch“ und
besitzen eine Seitenlänge von 3µm. Die Stempel sind wegen der besseren Stabilität nur 800nm hoch.
Abb. 3.5: Darstellung des für die Peroxidse verwendeten Biotinankers 6-(6-(5-(hexahydro-2-oxo-1H-
thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanamido)hexanamido)hexanoic acid (Trvialname: Biotinamidocaproyl).
Abb.3.6: Adsorption von Streptavidin (c=200nM) auf unterschiedlich biotinylierte SAMs nach einer
Inkubationszeit von 15min. Die Fehlerbalken zeigen die Streuung von je 4 Messungen. Die
Biotinmenge bezieht sich auf eine binäre Lösung mit dem OH-Thiol.
Anhang B Abbildungsverzeichnis
- 118 -
Abb.3.7: Detaillierte Analyse der 2 Phasen der Adsorptionskinetik von Strepatvidin (5% Biotinthiol,
200nM Streptavidin). Vor dem Fitten wurde die Kinetik normiert. Die lineare Phase macht 80% der
Kinetik aus, während die restlichen 20% ein 2-fach exponentielles Verhalten zeigen.
Abb.3.8: Die obere Kurve zeigt die unspezifische Adsorption von Streptavidin auf einem SAM aus
OH-Thiol (1a-1c) und die Bindung von bHRP auf dem unspezifisch adsorbierten Streptavidin (1d). In
der unteren Kurve (2) ist die unspezifische Adsorption von bHRP auf dem OH-Thiol SAM dargestellt.
Abb.3.9: Diffusionslimitierte Adsorption des Streptavidins auf den biotinylierten SAM. Die
Immobilisierungsdichte kann kontrolliert werden; m(ads) ist dabei die total adsorbierte Menge an
Protein.
Abb.3.10: Adsorption der bHRP (c=100nM) auf verschieden prä-immobilisierte Mengen an
Streptavidin. Mit steigender Streptavidinmenge an der Oberfläche steigt auch die Menge der
adsorbierten biotinylierten Peroxidase. Ein Teil unspezifisch adsorbierter bHRP kann durch Spülen
wieder von der Oberfläche entfernt werden.
Abb.3.11: Biotinylierte SAMs (5% Biotinthiol) wurden diffusionslimitiert mit vier verschiedenen Mengen
an Streptavidin beladen (Säulendiagramme). Anschließend wurden die Biotinbindungstaschen mit
nativem D-Biotin gesättigt (Daten nicht gezeigt). Zum Schluss wurden die Streptavidinlagen noch mit
100nM Peroxidase-Lösung inkubiert (eingefügtes Liniendiagramm). Abb.3.12: Die spezifische Peroxidase/Streptavidin-Adsorption wurde gegen die Menge an
oberflächengebundenem Streptavdin aufgetragen. Abb.3.13: A) Phasenbild der Oberfläche nach Inkubation mit dem OEG(6)-Thiol (helle Quadrate) und
dem 10%-Biotinthiol (dunkle Stege). B1) Topographiebild nach Inkubation mit Streptavidin.
C1) Topgraphiebild nach Adsorption der bHRP auf dem Streptavidin. Der Höhenkontrast verbessert
sich mit jedem Schritt der Proteinadsorption, was in den Bildern B2 (Streptavidin) und C2 (bHRP)
dargestellt ist.
Abb.3.14: Peroxidase katalysiert die Produktion eines gelben Farbstoffs, der dann photometrisch
detektiert wird. Die Höhe der Banden korreliert mit der enzymatischen Aktivität. Es wurde die Aktivität
der Enzyme in Lösung (obere 3 Linien) mit der Aktivität der Enzyme an der Oberfläche verglichen
(untere 3 Linien).
Abb.3.15: Jedes Peroxidase-Molekül (P) besitzt eine “Diffusionssphäre”. Substrate innerhalb dieser
Sphäre können die aktive Seite der Peroxidase erreichen. In Lösung (linke Darstellung) ist soviel Platz
zwischen den einzelnen Molekülen, dass sich die Sphären nicht überlappen. Bei den
oberflächengebundenen Molekülen (rechte Darstellung) liegen die Moleküle so eng zusammen, dass
es zu einer Überlappung der Sphären kommt. Dadurch konkurrieren die einzelnen Peroxidase-
Moleküle um das Substrat.
Anhang B Abbildungsverzeichnis
- 119 -
Abb.3.16: Absorptionskurven für die Referenz-Probe (Kreise) und die Test-Probe (Quadrate). Die
Aktivität der Test-Probe liegt im Vergleich zur Referenzprobe (100% Aktivität) immer noch bei 22%. Abb.4.1: Darstellung der Reaktionssequenz zur Festphasen-Synthese von Peptid-Thiol Oligoamiden
Dabei kommen folgende Reagenzien zum Einsatz: a) PyBop, DMF b) Piperidin, DMF
c)Trifluoressigsäure, CH2Cl2.
Abb.4.2: Modifizierte 1,3 Cycloaddition nach Husigen. Im Gegensatz zur thermisch kontrollierten
Huisgen-Reaktion entstehen hier nicht 2 Enantiomere, sondern es wird das 1,4 Regioisomer erreicht.
Abb.4.3: Darstellung der für das Projekt benutzen Moleküle: azido-Undekanthiol (1), 11-thioacetyl-
undekansäure-propargylamid (2), Azidoessigsäure (3), Azidoferrocen (4) und Ethinyl Ferrocen (5).
Abb.4.4: Click Reaktionen von 2 mit 3 und 4. Als Produkte warden dann N-((1H-1,2,3 triazol-4-
yl)acetyl)-11-mercapto-undekanamid (6) und N-((1H-1,2,3-triazol-4-yl) ferrocenyl)-11-mercapto-
undekanamid (7) erhalten.
Abb.4.5: Additionsreaktion von 5 an 1. Als Produkt wird N-((1H-1,2,3-triazol-4-yl) ferrocenyl)-11-
mercapto-undekanthiol (8) erhalten.
Abb.4.6: Schematische Darstellung für die Synthese des Ferrocenthiols in Lösung mit anschließender
Formierung des SAMs. Abb.4.7: Simuliertes IR-Spektrum, KBr-IR-Spektrum und SAM-IR-Spektrum des Alkinthiols im
direkten Vergleich. Die wichtigsten Banden sind mit Strichen gekennzeichnet.
Abb. 4.8: Simuliertes IR-Spektrum und SAM-IR-Spektrum im direkten Vergleich. Die wichtigsten
Banden wurden durch Linien gekennzeichnet.
Abb.4.9: XPS-Spektren der verwendeten Thiole. Es sind die charakteristischen Bereiche für
Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff und Eisen dargestellt. Die unteren Kurven stellen die Ergebnisse für
das reine Alkinthiol dar, während die oberen Linien das Ferrocenthiol darstellen.
Abb.4.10: C1s NEXAFS-Spektrum von Ferrocenthiol auf einem Gold/Silicium-Wafer. Abb.4.11: Fe2p NEXAFS-Spektrum von Ferrocenthiol auf einem Gold/Silicium-Wafer. Abb.4.12: Schematische Darstellung der Synthese des Ferrocenthiols an der Oberfläche nach
Inkubation eines Goldwafers mit Alkinthiol. Abb.4.13: IR-Spektren des Alkinthiols vor (links) und nach (rechts) Reaktion mit dem Azido-Ferrocen.
Anhang B Abbildungsverzeichnis
- 120 -
Abb.4.14: Darstellung des für den gemischt terminierten SAM verwendeten Mercapto-Undekanols.
Abb.4.15: IR Spektrum eines SAMs aus 50%Alkinthiol, welcher für 72h in der Reaktionslösung für die
Click-Chemie inkubiert wurde. Zum Vergleich ist das Spektrum eines SAM aus Ferrocenthiol gezeigt,
welches in Lösung synthetisiert und dann an die Oberfläche adsorbiert wurde. Die senkrechten Linien
zeigen 2 der charakteristischsten Peaks für die Aromaten des Ferrocenthiols.
Abb.4.16: IR Spektrum eines SAMs aus 10%Alkinthiol, welcher für 60h in der Reaktionslösung für die
Click-Chemie inkubiert wurde (unteres Spektrum). Zum Vergleich ist das Spektrum eines SAM aus
Ferrocenthiol (oberes Spektrum) gezeigt, welches in Lösung synthetisiert und dann an die Oberfläche
adsorbiert wurde. Die senkrechten Linien zeigen 2 der charakteristischsten Peaks für die Aromaten
des Ferrocenthiols. Abb.4.17: Vergrößerung der Bereiche um 1625 cm-1 und 3100 cm-1 der Spektren aus Abbildung 11. Im Spektrum des 10%-igen Alkinthiol-SAMs sind keine Peaks des Ferrocens zu erkennen.
Abb.4.18: IR-Spektrum eines SAMs aus 11-mercapto-Undekanol (OH-Thiol).
Abb.4.19: IR-Spektren des Azidoundekanthiols im Volumen (KBr) und an der Oberfläche (SAM).
Abb.4.20: IR-Spektrum von 8 (Kreise) im Vergleich zu den beiden Ausgangsprodukten 1 (Quadrate)
und 5 (Dreiecke). Abb.4.21: Simuliertes Spektrum der Azidoessigsäure. Die beiden stärksten Banden liegen bei
2105cm-1 (Azid) und 1705cm-1 (Carbonsäure).
Abb.4.22: IR-Spektrum des Click-Produktes (Experiment) im Vergleich zu einem simulierten Spektrum
des Click-Produktes.
Abb.5.1: Schematische Darstellung der verwendeten Peptide und des Thiolankers (vgl. Kapitel 4
Substanz 2). Peptid-1 (A) ist aus hydrophilen Aminosäuren (Serin (Ser), Lysin (Lys), Threonin (Thr))
und Gly aufgebaut. Gly ist nicht hydrophil aber wichtig für die helikale Struktur des Peptids. Peptid-2
(B) ist eine einfache Kette aus den Aminosäuren mit hydrophoben Seitenketten: Leucin (Leu), Alanin
(Ala) und Prolin (Pro).
Abb.5.2: Schematische Darstellung eines kurzen Peptidthiols bestehend aus wenigen Aminosäuren.
Abb.5.3: HPLC-Spektrum des Produktes aus der Synthese von Peptid-1.
Anhang B Abbildungsverzeichnis
- 121 -
Abb.5.4: ESI-MS-Spektren des Peptid-1-Thiol. Im oberen Spektrum ist der Bereich von 1000-
1300g/mol gezeigt, indem der Massenpeak deutlich zu erkennen ist. Im unteren Spektrum ist eine
Vergrößerung des Bereichs von 600-650g/mol gezeigt, indem der „Halbmassen“-Peak von
617,23g/mol zu erkennen ist. Abb.5.5: XPS Spektren des Peptid-1-Thiol SAM und des CH3 terminierten SAM (Oktadekanthiol) im
direkten Vergleich. Es sind die Au4f, die C1s, die S2p, die O1s und die N1s Region gezeigt.
Abb.5.6: ESI-MS-Spektrum des Peptid-2-Thiols. Der Peak bei 1202.47g/mol gehört zu [M-H]-. Abb.5.7: MALDI-Spektrum des Peptid-2-Thiols. Der Peak bei 1205.8 gehört zu [M+H]+. Abb.5.8: Vergleich der IR Spektren des Peptid-1-Thiols im Volumen (KBr-Pressling) und im SAM. Abb.5.9: Zusammenfassung der Adsorptionskurven für Streptavidin auf den verschieden terminierten
SAMs. Der Beginn und das Ende der Inkubation der Streptavidinlösung sind mit senkrechten Linien
gekennzeichnet.
Abb.5.10: IR Spektren des Peptid-1-Thiol-SAMs als Volumenspektrum (KBr, oberes Spektrum) und
an der Oberfläche vor (unteres Spektrum) und nach (mittleres Spektrum) Inkubation des Streptavidins
(15min).
Abb.5.11: Zusammenfassung der Adsorption von BSA auf die verschieden terminierten SAMs. Zur
Veranschaulichung wurde im Falle des Peptid-1-SAMs eine Basislinie (vor der Proteininjektion)
eingefügt.
Abb.5.12: Adsorptionskurven für Fibronectin auf einem OH- und dem Peptid-1-terminierten SAM.
Anhang C Tabellenverzeichnis
- 123 -
Anhang C - Tabellenverzeichnis Tab.2.1: Dissoziationseigenschaften des Streptavidin - Biotin - Komplexes (89,95).
Tab.3.1: Vergleich des 1-und 2-fach exponentiellen Fits für die nicht lineare Phase der Streptavidin-
Kinetik. Vor dem Fitten wurde die Kinetik normiert und besitzt daher keine Dimension mehr. Tab.4.1: Vergleich der wichtigsten IR-Banden des Alkinthiols mit Literatur und Simulation.
Tab.4.2: Vergleich der wichtigsten IR-Banden des Ferrocenthiol-SAMs mit Literatur und Simulation.
Tab.4.3: Vergleich der charakteristischen Banden für die Ferrocengruppe aus Literatur, Simulation
und Experiment. Tab.4.4: Vergleich der wichtigsten IR-Banden des Azidothiols im Volumen (KBr), an der Oberfläche
(SAM) und mit der Sumulation (Spektrum nicht gezeigt).
Tab.4.5: Vergleich der wichtigsten IR-Banden des Azidothiols im Volumen (KBr), an der Oberfläche
(SAM) und mit der Sumulation (Spektrum nicht gezeigt).
Tab. 4.6: Zusammenfassung der wichtigsten IR-Banden für das Reaktionsprodukt 6 aus 2 und 3 und
der Simulation von 6.
Tab.5.1: Zusammenfassung der wichtigsten Banden für das Peptid-1-Thiol im Volumen und im SAM.
Tab.5.2: Zusammenfassung der Streptavidinadsorption.
Tab.5.3: Vergleich der IR-Spektren im Volumen und an der Oberfläche vor und nach Adsorption des Streptavidins. Tab.5.4: Zusammenfassung der Adsorption von BSA.
Tab.5.5: Zusammenfassung der Adsorption von Fibronectin.
Tab.6.1: Zusammenfassung der Adsorptionsmessungen.
Anhang D Liste der Publikationen
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Anhang D - Liste der Publikationen
(1) R. Chelmowski, A. Prekelt, Ch. Grunwald und Ch. Wöll, A Case Study on Biological Activity in a Surface-Bound Multicomponent System: TheBiotin-Streptavidin-Peroxidase System, J. Phys. Chem. A, 2007, 111, 12295-12303
(2) R. Chelmowski, D. Köster, A. Kerstan, A. Prekelt, Ch. Grunwald, N. Metzler-Nolte,
A. Terfort und Ch. Wöll, Peptide-based SAMs that resist the adsorption of proteins, JACS, accepted
(3) R. Chelmowski, D. Käfer, D. Köster, T.Klasen, T. Winkler, A. Terfort, N. Metzler-Nolte und Ch. Wöll, Post-synthesis modification of SAMs: Using click-chemistry to functionalize organic surfaces, in progress
(4) S. Hermes, F. Schröder, R. Chelmowski, Ch. Wöll und R. A. Fischer, Selective Nucleation and Growth of Metal-Organic Open Framework Thin Films on Patterned COOH/CF3 Terminated Self-Assembled Monolayers on Au(111), J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 13744-13745
(5) I. Saldan, J. Frenzel, O. Shekhah, R. Chelmowski, A. Birkner, Ch. Wöll, Surface of
Ti–Ni alloys after their preparation, Journal of Alloys and Compounds 2008, in press
Anhang E Lebenslauf
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Anhang E - Lebenslauf Persönliche Daten Name: Chelmowski, Rolf Anschrift: Am Gartenkamp 8 44807 Bochum 0234/2989059 Mail: [email protected] Geburtsdatum: 19.09.1980 in Bochum Familienstand: ledig
Voraussichtlicher Berufsabschluss SS08 Doktor der Naturwissenschaften (Dr. rer.nat.) Hochschulstudium SS05 - SS08 Promotion im Fachbereich Chemie
an der Ruhr-Universität Bochum WS00/01 - SS05 Diplom im Fachbereich Chemie an der Ruhr-Universität Bochum Abschluss: Diplom Biochemiker Studienschwerpunkte: Biophysikalische Chemie Zivildienst 10/1999 – 10/2000: Caritas e.V. Bochum, Kurzzeitpflegestation in Bochum Schulbildung 08/1990 – 05/1999: Gymnasium am Ostring in Bochum, Abitur 08/1986 – 05/1990: Gemeinschaftsgrundschule am Volkspark in Bochum Besondere Kenntnisse und Interessen Fach: Toxikologie und Chemikalienrecht, eingeschränkte
Fachkenntnis EDV: Word, Excel, PowerPoint, Corel Draw, Auto Desk Inventor,
Chem Draw, Isis Draw, Nanoscope IIIa Sprachen: Englisch, Latein Interessen: Lesen, Schreiben, Musik Hören, Judo
Anhang F Danksagung
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Anhang F - Danksagung Ich möchte an dieser Stelle einigen Personen danken, die mir bei der Entstehung dieser Arbeit
in der vorliegenden Form sehr geholfen haben.
Herrn Prof. Dr. Christof Wöll (Lehrstuhl für Physikalische Chemie I an der Ruhr - Universität
Bochum) danke ich für das interessante und aktuelle Arbeitsthema, dem Interesse an diesem
Thema, der Möglichkeit die experimentellen Techniken und die Gestaltung der Experimente
frei wählen zu können, seinem Engagement, seiner Diskussionsbereitschaft und für meine
finanzielle und wissenschaftliche Unterstützung.
Herrn Prof. Dr. Andreas Terfort (Institut für Anorganische und Angewandte Chemie an der
Universität Hamburg) für die Synthese einiger Chemikalien und der PDMS-Stempel, die
Anregungen und Ideen und die Geduld und Diskussionsbereitschaft.
Herrn Prof. Nils Metzler-Nolte und Herrn Dipl.-Chem. David Köster für die Zusammenarbeit
und die Hilfe im Bereich der Cklick-Chemie
Herrn Dr. rer. nat. Christian Grunwald (Lehrstuhl für Biochemie Biocenter, Johann Wolfgang
Goethe - Universität, Frankfurt a.M.) für den Beistand während dieser Arbeit, beinhaltend
Diskussionen, Unterstützung, zur Verfügung stehende Chemikalien und Präparation der
Substrate (Kapitel 3).
Dr. rer. nat. Alexander Birkner, Dr. rer. nat. Asif Bashir (beide: Lehrstuhl für Physikalische
Chemie I an der Ruhr - Universität Bochum) für die Bereitschaft zur Diskussion der AFM
Messungen.
Herrn B.Sc. Tim Klasen für die Untestützung während der Experimente zur Click-Chemie.
Andreas Prekelt, Konstantinos Zacharoupolos, Tatjana Ladnorg, Melanie Thoß, Christopher
Finke, Andreas Kerstan, Tim Klasen und Asif Bashir danke ich für die Freundschaft und
Hilsbereitschaft, die sie mir während meines gesamten Studiums haben zukommen lassen.
Und letztlich auch meinen Freunden und meiner Familie, insbesondere meinen Eltern und
meiner Freundin, die mir durch die finanzielle und moralische Unterstützung das Studium
ermöglicht haben.