Profa. Dra. Ana Luísa Palhares de MirandaLASSBio – Faculdade de Farmácia - UFRJ
Propriedades Farmacológicas de Diferentes Séries de N-acilidrazonas Planejadas e
Sintetizadas como Protótipos de Fármacos Antitrombóticos e Antinflamatórios.
UFRJ
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Medicinal Medicinal ChemistryChemistry is a chemistry-based discipline, also involvingaspects of biological, medical and pharmaceutical sciences. It is concernedwith the invention, discovery, design, identification and preparation of biologically active compounds, the study of their metabolism, theinterpretation of their mode of action at the molecular level and theconstruction of structure-activity relationships.
C.G. Wermuth, C.R. Ganellin, P. Lindberg and L.A. Mitscher(1998) Glossary of Terms Used in Medicinal Chemistry
DESIGN AND SYNTHESIS
PHARMACOLOGY
MOLECULAR MODELLINGNEW PROTOTYPES
NEW DRUGS
MEDICINAL CHEMISTRY LASSBio
PHARMACOLOGY
Rational Planning Validation
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ArachidonicArachidonic AcidAcid CascadeCascade, , MediatorsMediators of of InflammationInflammation, , PainPain
andand ThrombiThrombi FormationFormation..
p38 MAPK
Trombina,ADP
Fraga, C. A. M.; Barreiro, E. J. (2006) Curr. Med. Chem. 13, 167.
Freitas, A.C.C.; Barreiro, E.J.(1993) Rev. Bras. Farm. 74, 57.Freitas, A. C. C. et al. (1995) Quimica Nova 18, 138.
Silveira, I.A.F.B. et al. (1991) Braz. J. Biol. Med. Res. 24, 947.Silveira, I.A.F.B. et al. (1993) J. Pharm. Pharmacol. 45, 646.Todeschini, A. R. et al. (1998) Eur. J. Med. Chem. 33, 189.
TheThe BegningBegning: Design of : Design of PyrazolicPyrazolic ArylhydrazonesArylhydrazones
AntiAnti--inflammatoryinflammatory andand AnalgesicAnalgesic
PlateletPlatelet AggregationAggregation InhibitorsInhibitors
TheThe EvolutionEvolution: : PyrazolicPyrazolicAcylArylhydrazonesAcylArylhydrazones
Matheus, M. E. et al. (1998) Braz. J. Biol. Med. Res. 24, 1219.Miranda, A. L. P. et al. (1994) Can.J. Physiol. Pharmacol. 72 (S1), 210.
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IC50= 2.2 μM (AA) NAHNAH--1,2,41,2,4--OxadiazolicOxadiazolic, NAHNAH--1,2,31,2,3--TryazolicTryazolic, , NAHNAH--ImidazoImidazo[1,2[1,2--a]a]pyridinicpyridinic, , NAHNAH--PyrazoloPyrazolo[3,4[3,4--b]b]pyridinicpyridinic, , NAHNAH--tienotieno[2,3[2,3--c]c]pyrazolicpyrazolic, , NAHNAH--
PyrazoloPyrazolo[3,4[3,4--b]b]tienotieno[2,3[2,3--d]d]pyridinicpyridinic, , NAHNAH--ImidazolicImidazolic
Ribeiro, I. G. et al. (1998) Eur. J. Med. Chem. 33, 225.Figueiredo, J. M. et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. 8, 2243.Cunha, A. C. et al. (2002) Il Farmaco 57, 999.Cunha, A. C. et al. (2003) Bioorg. Med. Chem. 11, 2051.
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DIARYLHETEROCYCLE CLASS
Molecular frameworksMinimal structural subunit
Ligand points – 1 or + receptor
Duarte, C.M.; Fraga, C.A.M.; Barreiro, E.J. (2007) Mini Rev. Med. Chem. 7, 1.
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“Privileged Structures”
DUAL DRUGSSYMBIOTIC DRUGS
MULTIPLE MECHANISM OF ACTION
PGHS-2 / 5-LOXPGHS-2 / TNF-αPDE4 / TNF-α
PGHS-2 / MAPK p38PDEs: PDE4 PDE3 PDE5 PDE2
CB2 / CB1
Barreiro E. J. et al Quim Nova, 2002, 25: 129Fraga C.A. M. & Barreiro E. J. Curr Med Chem, 2006, 13: 167.
PAIN
INFLAMMATIONARTHRITIS
ATHEROSCLEROSIS
ISCHEMIA
CANCERTHROMBOSIS
≠ TargetsSame Physiopathologic
Process
AA cascadeDual inhibitors (COX/LOX)
NSAIs + SafeChronic Inflammation
• Enzyme Inhibition• Receptors: agonist/antagonist• Cell signalling: AMPc, GMPc, Ca++, NO ...
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EICOSANOIDS BIOLOGICAL ACTIVITIES
Vasodilatação
Hemostasia
Dor
Agregação plaquetária
BroncoconstriçãoEICOSANÓIDES
QuimiotaxiaPGE2
TXA2
LTC4
PGD2
Inflamação
PGE2
PGI2 / TXA2
LTB4
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Hinz & Brune, JPET 300: 367-375,2002.
INFLAMMATION THROMBOSIS
AA METABOLITES
INFLAMMATIONPAIN
FEVER
PHYSIOLOGIC STIMULICONSTITUENT COX-1
FUNÇÕES PLAQUETÁRIASFLUXO SANGUÍNEOFUNÇÕES RENAIS
PROTEÇÃO TGI
COX
INFLAMMATORY STIMULIINDUCIBLE COX-2
PGE2 PGI2 TXA2
PGE2PGI2TXA2
other mediators
Non-selectives COX Inhibitors
--
COX-2 SelectivesInhibitors
PAIN
PGI2 TXB2
TXB2
PGI2
Células Endoteliais
ParedeVascular Plaqueta
Trombose
Inibidores de COX-1AAS
Antitrombóticos
Inibidores de COX-1AAS
Antitrombóticos
Inibidores Seletivos COX-2
Riscos Cardiovasculares
Inibidores Seletivos COX-2
Riscos Cardiovasculares
PGI2 TXB2
TXB2
PGI2
Células Endoteliais
ParedeVascular Plaqueta
Trombose
PGI2 TXB2PGI2 TXB2
TXB2
PGI2
TXB2
PGI2
Células Endoteliais
Células Endoteliais
ParedeVascular Plaqueta
Trombose
Inibidores de COX-1AAS
Antitrombóticos
Inibidores de COX-1AAS
Antitrombóticos
Inibidores Seletivos COX-2
Riscos Cardiovasculares
Inibidores Seletivos COX-2
Riscos Cardiovasculares
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Calor Rubor Edema DorPerda daFunção
• cytokines expression• COX-2 expression – PGs synthesis• adhesion molecules expression• chemokines expression• inflammatories cells recruitment
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Dray A. et al 1994, TiPS 15: 190.
Dor patológica (crônica)
Dano tecidual, inflamação, patologia
Injúria do nervo
Estímulo de baixa intensidade
hiperalgesia
alodínia
fibras C, Aδ
fibras Cfibras C
fibras Αβ
Dor causada por um estímulo que normalmente não induz dor
resposta exagerada àum estímulo doloroso
Dor Fisiológica (aguda)
Estímulo de alta intensidade(térmico, mecânico, químico)
Estímulo de baixa intensidade(táctil, pressão)
dor aguda (proteção)
sensação inócua
fibras C, Aδ
fibras Aα,β
Inflammatory Painor Hyperalgesia
©©ALPM2008ALPM2008 Jackson S. P. & Schoenwaelder S. M. Nat Rev Drug Discovery, 2003, 2: 1-15.
Molecular Targets of Current Antithrombotic Drugs
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Ensaio de Contorção Abdominal induzida por Ácido Acético em
Camundongo
Ensaio de Edema de Pata de Rato induzido por
Carragenina
Ensaio de Agregação Plaquetária
METHODOLOGIES
Orgão isolado: aorta, traqueia
Adm. Oral
t=0 h t=1h t=1:10 h t=1:30h
intrap.
20 min10 min
Início contagem Término contagemAdm. Oral
t=0 h t=1h t=1:10 h t=1:30h
intrap.
20 min10 min
Início contagem Término contagemAdm. Oral
t=0 h t=1h t=1:10 h t=1:30h
intrap.intrap.
20 min10 min
Início contagem Término contagem
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NN
OH
ArR
NAH
N-acylhydrazone
2
a
2H-pyridazinone
NN
OH
R
aa--bondbondrupturerupture
pyridazinone (1H)-pyridinone
NN
OH
ArR'
CN
OH
ArR
R' PDEPDE’’s s inhibitorsinhibitors
PatentPatent literatureliterature
O
O
N
ON
HS
LASSBio 294
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-- ThienylacylhydrazoneThienylacylhydrazone CompoundsCompounds --LASSBio 294 LASSBio 294 AnaloguesAnalogues
O
O
NN
O
S
LASSBio 785
O
O
NN
O
S
LASSBio 786
O
O
N
ON
HS
LASSBio 294
O
O
NN
O
SH
LASSBio 787
O
O
NN
O
S
LASSBio 788
O
O
NN
O
SH
Br
LASSBio 789
Kummerle A. , 2005, Tese de Mestrado, IQ, UFRJ.Silva, A.G. et al. (2005) Bioorg. Med. Chem., 13, 3431.
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Methode Optique
ESTÍMULO
PLATELET AGGREGATION ASSAY (Turbidmetric Method - BORN & CROSS, 1963):
Rabit and Human PRP and Washed Platelets
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AAAA ColColáágenogeno
CICI5050 ((μμM)M) CICI50 50 ((μμM)M)
LASSBio 294LASSBio 294 15,3 15,3 ±± 0,20,2 18,3 18,3 ±± 8,78,7
LASSBio 785LASSBio 785 0,3 0,3 ±± 0,080,08 0,9 0,9 ±± 0,60,6
LASSBio 786LASSBio 786 0,02 0,02 ±± 0,60,6 7,9 7,9 ±± 2,42,4
LASSBio 787LASSBio 787 20,9 20,9 ±± 0,40,4 21,1 21,1 ±± 0,20,2
LASSBio 788LASSBio 788 0,2 0,2 ±± 0,30,3 1,5 1,5 ±± 0,20,2
LASSBio 789LASSBio 789 3,1 3,1 ±± 0,30,3 3,4 3,4 ±± 0,20,2
COMPOSTOSCOMPOSTOS
Platelet Aggregation induced by AA and ColágenoRabit PRP
-- IC50 of ThienylacylhydrazoneThienylacylhydrazone CompoundsCompounds --
cardiac muscle contractionVasodilatory – rat aorta –endotheliun independent
(IC50= 10,2 μM)
Positive Inotropic
Positive InotropicVasodilatory IC50 = 74 μM
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Potency Order of ThienylacylhydrazoneThienylacylhydrazone CompoundsCompoundsPlateletPlatelet AggregationAggregation InducedInduced byby AA 200 AA 200 μμM M andand ColCol 55μμg/g/mLmL
AAAA 786> 786> 788788> > 785785> 789> 294> 787> 789> 294> 787
ColColáágenogeno 785785> > 788788> 789> 786> 294> 787> 789> 786> 294> 787
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0
25
50
75
ADP 5 μMDMSO
LASSBio 294 100μMLASSBio 294 300μM
% A
greg
ação
LASSBio 294 LASSBio 294 ≈≈ 1414--17 % inibi17 % inibiççãoão
PlateletPlatelet AgregationAgregationInducedInduced byby ADP ADP
(5 (5 μμM M –– RabitRabit PRP)PRP)
0
25
50
75ADP 5 μMDMSO
LASSBio 785 100 μM
LASSBio 786 100 μMLASSBio 787 100 μMLASSBio 788 100 μMLASSBio 789 100 μMLASSBio 785 300 μMLASSBio 786 300 μMLASSBio 787 300 μMLASSBio 788 300 μM
LASSBio 789 300 μM
Compostos
% d
e Ag
rega
ção
**
* *
LASSBio 785 LASSBio 785 ≈≈ 3030--40 % inibi40 % inibiççãoão
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0
50
100
150
ADPDMSOLASSBio 294 100LASSBio 294 300LASSBio 785 100LASSBio 785 300
LASSBio 786 100LASSBio 786 300LASSBio 787 100LASSBio 787 300LASSBio 788 100LASSBio 788 300LASSBio 789 100
LASSBio 789 300
Compostos μM
% d
e A
greg
ação
0
10
20
30
40
Compostos μM
% d
e A
greg
ação
2nd wave
Platelet Aggregation induced by ADP (3 3 μμM)M)Human PRP
-- ThienylacylhydrazoneThienylacylhydrazone CompoundsCompounds --
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EFFECT ON THE BLEEDING TIME
-- ThienylacylhydrazoneThienylacylhydrazone CompoundsCompounds --
0
500
1000
1500VEÍCULOAASLASSBio 294LASSBio 785LASSBio 786LASSBio 787LASSBio 788LASSBio 789
Compostos (300 μmol/ kg)
Tem
po d
e Sa
ngra
men
to(s
)
*
*
*
*
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0
5
10
15
ColágenoDMSOLASSBio 294 100LASSBio 294 300LASSBio 785 100LASSBio 785 300
LASSBio 786 100LASSBio 786 300LASSBio 787 100LASSBio 787 300LASSBio 788 100LASSBio 788 300
LASSBio 789 100LASSBio 789 300
AAS 1000
Compostos μM
Impe
dânc
ia (o
hms/
min
)
*
* **
*
** * *
*
EFFECT ON THE HUMAN WHOLE BLOOD AGGREGATION INDUCED BY COL (20 μg/ml)
-- ThienylacylhydrazoneThienylacylhydrazone CompoundsCompounds --
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O
O
NN
O
S
O
O
NN
O
S
O
O
NN
O
SH
BrLASSBio 785 LASSBio 788 LASSBio 789
•100% AA Inhibition•90% Col Inhibition (rabit PRP)•30- 40% ADP (human PRP)•20- 30% Trombin WP•Collagen Human PRP:
50%: LASSBio 29470%: LASSBio 785, 786, 788, 789
TXA2Cyclic
Nucleotides
PlateletPlatelet AntiAnti--AggregatingAggregating ProfileProfile• ADP Rabit 35%• LASSBio 294 – Different Profile
AP + KT5720 (Inib. PKA)AP + ODQ (Inib. GC/NO)
No effect
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• U-46619 e PAF induced aggregation - no activity
• Human whole blood : ⇓ Impedence (30% - 60%)Exception LASSBio 789
• Release reaction ≈ 90% of inhibition
• Bleeding Time: LASSBio 294: 53,3%LASSBio 785: 29,4%LASSBio 789: 88,9%
ANTITHROMBOTIC ANTITHROMBOTIC POTENTIALPOTENTIAL
PlateletPlatelet AntiAnti--AggregatingAggregating ProfileProfile
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ThienylacylhydrazoneThienylacylhydrazone CompoundsCompoundsPlatelet Aggregation induced by Thrombin in the
presence of NO DonnorsDICKINSON et al. (1997) Biochem. J., 323, 371-377.
NO Donnors: Inhibit Platelet Aggregation dose –dep. (↑ AMPc e GMPc - limited)
PDE3 Inhibitors: Inhibit Platelet Aggregation
PDE2 Inhibitors: ↑ NO donnors inhibition
PDE3 Inhibitors + NO: Reverse the inhibition (PDE2 x PDE3)
↑PDE2
AMPc e GMPc
NO Donnors ↑ GMPc intraplatelet PDE3
↑ AMPc >>>GMPc
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ROLE OF SNP, EHNA E MILRINONA ON THE PLATELET AGGREGATION INDUCED BY THROMBIN IN HUMAN WP
100
0
50
100
0
50
Período de Incubação (min)0 1 3
0 1 3
0 1 3
0 1 3
a) b) c) d)
a) b) c) d)
a) Trombinab) Trombina + SNP 10μMc) Trombina + Milrinona 100 μMd) Trombina + SNP + Milrinona
a) Trombina + EHNAb) Trombina + EHNA +SNP 10μMc) Trombina +EHNA +Milrinona 100 μMd) Trombina + EHNA +SNP + Milrinona
% d
e A
greg
ação
PDE2 Activation
PDE3 Inhibition
PDE2 Inhibition
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Effect of LASSBio 785 in the presence of SNP on the platelet aggregation inducedby thrombin in human wp
100
0
500
a) b) d)c)
0 1 3 0 1 3 0 1 3 0 1 3 0 1 3
e)%
de
Agr
egaç
ão
Período de Incubação (min)
a) Trombinab) Trombina + LASSBio 785 300μMc) Trombina + SNPd) Trombina + SNP + LASSBio 785 100μMe) Trombina + SNP + milrinona + LASSBio 785 100μM
PDE2 InhibitionNo reversion
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100
0
500
a) b) d)c)
0 1 3 0 1 3 0 1 3 0 1 3 0 1 3
e)%
de
Agr
egaç
ão
Período de Incubação (min)
a) Trombinab) Trombina + LASSBio 788 300μMc) Trombina + SNP d) Trombina + SNP + LASSBio 788 100μMe) Trombina + SNP + milrinona + LASSBio 788 100μM
Effect of LASSBio 788 in the presence of SNP on the platelet aggregation inducedby thrombin in human wp
PDE2 InhibitionNo reversion
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100
0
50
a) b) d)c)
0 1 3 0 1 3 0 1 3 0 1 3 0 1 3
e)
% d
e A
greg
ação
Período de Incubação (min)
a) Trombinab) Trombina + LASSBio 789 300μMc) Trombina + SNP + LASSBio 789 100μMd) Trombina + SNP + LASSBio 789 10μMe) Trombina + SNP + milrinona + LASSBio 789 100μM
Effect of LASSBio 789 in the presence of SNP on the platelet aggregation inducedby thrombin in human wp
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100
0
500
a) b) d)c)
0 1 3 0 1 3 0 1 3 0 1 3
% d
e A
greg
ação
Período de Incubação (min)
a) Trombinab) Trombina + SNP +LASSBio 294 300 μM c) Trombina + SNP + LASSBio 786 300 μM d) Trombina + SNP + LASSBio 787 300μM
Effect of LASSBio 294, 786 and 787 in the presence of SNP on the plateletaggregation induced by thrombin in human wp
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TXBTXB22 ProductionProduction in in HumanHuman WholeWhole BloodBlood
CompoundsCompounds ICIC5050 TXBTXB2 2 ProductionProduction ((μμM)M)
LASSBio 294 LASSBio 294 63,0 63,0 ±± 3,73,7
LASSBio 785 LASSBio 785 30,4 30,4 ±± 3,43,4
LASSBio 786 LASSBio 786 34,1 34,1 ±± 3,73,7
LASSBio 787 LASSBio 787 211,7 211,7 ±± 1,21,2
LASSBio 788 LASSBio 788 2,6 2,6 ±± 1,61,6
LASSBio 789 LASSBio 789 257,8 257,8 ±± 1,91,9
-- ThienylacylhydrazoneThienylacylhydrazone CompoundsCompounds --
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Non-stimulated Platelets
• AMPc: No alteration
• GMPc: significant increase
control=82.9±7.6; L785=182.4±9.4*; L788=177.6±14* (fmol/well)
Effect of ThienylacylhydrazoneThienylacylhydrazone CompoundsCompounds on on thetheCyclicCyclic NucleotidesNucleotides FormationFormation in human PRP
SNP-stimulated Platelets
• AMPc: No alteration
• GMPc: significant increase
SNP=112.0±2.2; L785=197.6±20*; L788 = 217.3±6.8*; EHNA=205.2±12.4* (fmol/well)
SNP+PGE1-stimulated Platelets
• GMPc: significant increase
SNP+PGE1=125.8±2.4; L785=216.4±16.7*; L788=255.7±16.6*)
• Functional studies in the presence of SNP suggested a PDE2-like effect for LASSBio 785, 788 and 789. • They modulate cyclic nucleotides (mainly cGMP) as PDE inhibitors.
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STRUCTURAL MODIFICATIONS OTIMIZATION OF THE PHARMACOLOGICAL
PROFILE
LASSBio 78510 μM
PDE2 – no effect
PDE4 – no effectPDE3 – no effect
PDE5 – 50.5*
LASSBio 78810 μM
PDE2 – 23.6 ns
PDE4 – 32.7* (IC50 = 72.6 μM)PDE3 – no effect
PDE5 – 57.9*
PDE INHIBITIONDr. Claire Lugnier – ULP Strasbourg
IC50 = 37 μM
IC50 = 10 μM
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ThienylacylhydrazoneThienylacylhydrazone CompoundsCompoundsSuggested Anti-platelet Mechanism of Actiom
COLÁGENO ADPAA
PLC
DAG
PKC
IP3
Ca++
TXA2
Ca++
⇓ AMPc
NO
GUANILATO CICLASE
GMPc
PROTEÍNA QUINASE G
TXA2
Gq
TIENILACILIDRAZÔNICOS
TIENILACILIDRAZÔNICOS
Inibição de PDE 2 ou 5?Ativação da guanilato ciclase?
Inibição da PGHS-1Inibição da TS
STD
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O
O
N
ON
HS
LASSBio 294
(+) Vasodilatator(+) Anti-thrombotic(-) Antinflammatory
And analgesic
Kummerle A. , 2005, Tese de Mestrado, IQ, UFRJ.Brito F C F, 2005, Tese de Doutorado, ICB, UFRJ.Bezerra Neto H J C, Lacerda D I et al, 2006, Bioorg Med Chem 14, 7924.Duarte C M, Tributino J L M et al, 2007, Bioorg Med Chem 15, 2421.
O
O N
O
N
HHNHSO2CH3
LASSBio 930
O
O N
O
N
HHNO2
OH
LASSBio 881
LASSBio 930 LASSBio 883
LASSBio 891
O
O ON
O
NHH
NO2
O
O ON
O
NHH
NO2
N CH3
H3C
AntinflamatórioAnalgésico
Anti-isquêmico
AntinflamatórioAnalgésico
COX-2 / TNF-α
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LASSBio 891
O
O ON
O
NHH
NO2
LASSBio 883
O
O ON
O
NHH
NO2
N CH3
H3C
AIAN
ortoorto--NitroNitro--NAHNAH--1,31,3--BenzodioxolicBenzodioxolic CompoundsCompoundsScreening• 3 séries
≈ 20 derivados
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• Determinação da potência antinociceptiva no ensaio de contorções abdominais induzidas por ácido acético 0,6%
• Determinação da potência antinociceptiva no ensaio de Formalina 2,5% ( Fase inflamatória)
• Determinação da potência antiinflamatória no ensaio de edema de pata de rato induzido por carragenina 1%
Compostos DE50 (µmol/kg) Efeito Máximo (%) LASSBio 883
14,4 ± 1,8
59,8
LASSBio 891
10,8 ± 1,4
57,8
Nimesulido
24,2 ± 2,3
66,3
Compostos
DE50 (µmol/kg) Efeito Maximo (%)
LASSBio 883
77,9 ± 9,0
69,1
LASSBio 891
123,2 ± 10,2
56,2
Nimesulido
52,3 ± 6,4
70,7
Compostos DE50 (µmol/kg) Efeito Maximo (%) LASSBio 883
105,5 ± 7,1
42,2
LASSBio 891
117,6 ± 10,9
45,4
Nimesulido
72,2 ± 4,6
56,3
Os valores são medidos cronometrando o tempo de resposta e volume de edema ± ESM. *P<0,05 os valores médios foram estatisticamente significantes (t-Students)
ortoorto--NitroNitro--NAHNAH--1,31,3--BenzodioxolicBenzodioxolic CompoundsCompounds
©©ALPM2008ALPM2008
0
30
60
90AAAA + DMSO
Nimesulido
LASSBio 883LASSBio 891
Compostos (100μM)
% d
e Ag
rega
ção
*100%
Platelet Aggregation induced by AA (200 μM) - Rabbit PRP
NO EFFECT
ortoorto--NitroNitro--NAHNAH--1,31,3--BenzodioxolicBenzodioxolic CompoundsCompounds
©©ALPM2008ALPM2008
M μN
imes
ulid
o 50
0
M μAs
pirin
a 50
0
M μLA
SSBi
o 88
3 50
0
M μLA
SSBi
o 89
1 50
0 0
20
40
60
80
100
*
*
% d
e in
ibiç
ão d
e TX
B 2
Cel
ecox
ib 0
,01
Cel
ecox
ib 0
,1C
elec
oxib
1C
elec
oxib
10
Cel
ecox
ib 1
00
Nim
esul
ido
0,01
N
imes
ulid
o 0,
1N
imes
ulid
o 1
Nim
esul
ido
10N
imes
ulid
o 10
0
LAS
SB
io 8
83 0
,01
LAS
SB
io 8
83 0
,1LA
SS
Bio
883
1LA
SS
Bio
883
10
LAS
SB
io 8
83 1
00
LAS
SB
io 8
91 0
.01
LAS
SB
io 8
91 0
.1LA
SS
Bio
891
1LA
SS
Bio
891
10
LAS
SB
io 8
91 1
00
0
20
40
60
80
100 ***
** *
** *
*
**
*
* * **
% d
e in
ibiç
ão d
e PG
E 2
• Selectivity COX-1/COX-2 – Human Whole Blood
Sangue humano coletado sem anticoagulante
Alíquotar 1ml de sangue
+ 4µL de DMSO ou Derivados
1 hora
Centrifugação13000
RPM/15min
Soro coletado e
congelado a – 20º C
Dosagem de TXB2
por EIA
Sangue humano coletado sem anticoagulante
Alíquotar 1ml de sangue
+ 4µL de DMSO ou Derivados
1 hora
Centrifugação13000
RPM/15min
Soro coletado e
congelado a – 20º C
Dosagem de TXB2
por EIA
Sangue humano coletado sem anticoagulante
Alíquotar 1ml de sangue
+ 4µL de DMSO ou Derivados
1 hora
Centrifugação13000
RPM/15min
Soro coletado e
congelado a – 20º C
Dosagem de TXB2
por EIA
Sangue humano coletado sem anticoagulante
Alíquotar 1ml de sangue
+ 4µL de DMSO ou Derivados
1 hora
Centrifugação13000
RPM/15min
Soro coletado e
congelado a – 20º C
Dosagem de TXB2
por EIA
Sangue humano coletado
com heparina(10 UI/ml)
Alíquotar 1ml de sangue
+ 4µL de DMSO ou Derivados
15 minutos
Centrifugação13000
RPM/5min
Soro coletado e congelado a – 20º C
Dosagem de PGE2
por EIA
LPS (100 µg/ml)
24 horas
Agitação 37 °C
Sangue humano coletado
com heparina(10 UI/ml)
Alíquotar 1ml de sangue
+ 4µL de DMSO ou Derivados
15 minutos
Centrifugação13000
RPM/5min
Soro coletado e congelado a – 20º C
Dosagem de PGE2
por EIA
LPS (100 µg/ml)
24 horas
Agitação 37 °C
Sangue humano coletado
com heparina(10 UI/ml)
Alíquotar 1ml de sangue
+ 4µL de DMSO ou Derivados
15 minutos
Centrifugação13000
RPM/5min
Soro coletado e congelado a – 20º C
Dosagem de PGE2
por EIA
LPS (100 µg/ml)
24 horas
Agitação 37 °C
Sangue humano coletado
com heparina(10 UI/ml)
Alíquotar 1ml de sangue
+ 4µL de DMSO ou Derivados
15 minutos
Centrifugação13000
RPM/5min
Soro coletado e congelado a – 20º C
Dosagem de PGE2
por EIA
LPS (100 µg/ml)
24 horas
Agitação 37 °C
©©ALPM2008ALPM2008
Os valores são medidos cronometrando o tempo de resposta (s) e volume de edema (µl) ±ESM. *P<0,05 os valores médios foram estatisticamente significantes (t-Students)
• Ensaio de hiperalgesia térmica induzida por carragenina 1% (Teste da placa quente modificado)
0
1
2
3
4
5
6Controle
Talidomida
Nimesulido
Nimesulido + Tal
LASSBio 883
LASSBio 883 + Tal
LASSBio 891
LASSBio 891 + Tal
Tempo (3a Hora)
61,5%
91,1%
68,8%
96,0%
62,0%
88,5%
*
* *
*
*
*
*
Hiperalgesia
Latê
ncia
(s)
0
100
200
300
400
500
600Controle
Talidomida
Nimesulido
Nimesulido + Tal
LASSBio 883
LASSBio 883 + Tal
LASSBio 891
LASSBio 891 + Tal
16,1n.s.29,3%
21,0%
53,0%
* *
* * * *
Edema
Tempo (3a Hora)
Vol
ume
de E
dem
a (μ
L)+
Cg subpl.
Hiperalgesia Mecânica: mediadores em sequência(Cunha TM et al 2005, PNAS 102: 1755)
Thermal Hyperalgesia
LAVICH, T.R., et al. Eur J of Pharmacol, 61039, (2003), p.1-8.
©©ALPM2008ALPM2008
LPS
/DM
SO M μ
Talid
omid
a 10
0
M
μLA
SS
Bio
883
10
M
μLA
SS
Bio
883
50
M
μLA
SS
Bio
883
100
M μLA
SS
Bio
891
10
M μLA
SS
Bio
891
50
M μLA
SS
Bio
891
100
0
20
40
60
80
100
120
65,7%
*
**
41,5%
64,0 %
% P
rodu
ção
de T
NF-α
Os resultados são expressos em valor médio de % de Produção de TNF-a / n= 3, *p<0,05.
• Avaliação da Produção de TNF-a em sobrenadante de macrófagos alveolares de camundongos.
©©ALPM2008ALPM2008
TNF-α
Expressão de COX-2
COX-1
Dosagem (COX-1)
FormalinaHiperalgesia
Contorção
LASSBio 883
Inibição
Inibidor
x
Existe uma Grande Liberação de TNF-α por Macrófagos, Residentes
na região peritoneal
Dosagem (COX-2)Edema Carragenina
SensibilizaçãoLiberação de Prost
COX-2
Levando
Levando
TNF-α
Expressão de COX-2
COX-1
Dosagem (COX-1)
FormalinaHiperalgesia
Contorção
LASSBio 883
Inibição
Inibidor
x
Existe uma Grande Liberação de TNF-α por Macrófagos, Residentes
na região peritoneal
Dosagem (COX-2)Edema Carragenina
SensibilizaçãoLiberação de Prost
COX-2
Levando
Levando
ortoorto--NitroNitro--NAHNAH--1,31,3--BenzodioxolicBenzodioxolic CompoundsCompounds
CLONCLUSIONS
LASSBio 883LASSBio 883
SIMBIOTIC COMPOUNDSIMBIOTIC COMPOUNDTNFTNF--αα / COX/ COX--2 2
©©ALPM2008ALPM2008
ortoorto--NitroNitro--NAHNAH--1,31,3--BenzodioxolicBenzodioxolic CompoundsCompounds
CLONCLUSIONS
COX-2 Dosagem COX-1
FormalinaHiperalgesia
Contorção
LASSBio 891
Diminui Liberação
InibiçãoLiberação de mediadores na região
peritoneal
Mediadores Pró-Algésicose Pró-Inflamatórios
COX-1
ReduzSensibilização
Edema Carragenina
x
Vasodilatação Migração
COX-2 Dosagem COX-1
FormalinaHiperalgesia
Contorção
LASSBio 891
Diminui Liberação
InibiçãoLiberação de mediadores na região
peritoneal
Mediadores Pró-Algésicose Pró-Inflamatórios
COX-1
ReduzSensibilização
Edema Carragenina
x
Vasodilatação Migração
LASSBio 891LASSBio 891
COXCOX--2 SELECTIVE INHIBITOR2 SELECTIVE INHIBITOR
©©ALPM2008ALPM2008
DERIVADOS N-ACILIDRAZÔNICOS QUINOXALÍNICOS
©©ALPM2008ALPM2008
Atividade Analgésicav.o. 100 μmol/kg
AtividadeAntinflamatóriav.o. 100 μmol/kg
Derivados NAHQuinoxalínicos
Mazzeu E F, 38º Congresso SBFTE, 2006.
©©ALPM2008ALPM2008
0 1 2 3 4 5
012345678
Veículo
****
LASSBio 1009LASSBio 1013*
*
Tempo de leitura (h)
Varia
ção
de L
atên
cia
(s)
0 1 2 3 4 5
012345678
Veículo
*** *
LASSBio 1016LASSBio 1017
Tempo de leitura (h)
Varia
ção
de L
atên
cia
(s)
0 1 2 3 4 5
012345678
VeículoLASSBio 1018LASSBio 1024
**
** *
Tempo de leitura (h)
Varia
ção
de L
atên
cia
(s)
0 1 2 3 4 5
012345678
Veículo
*
LASSBio 1196LASSBio 1195
Tempo de leitura (h)
Varia
ção
de L
atên
cia
(s)
Efeito Anti-hiperalgésico Temporal dos Derivados Quinoxalínicos
Compostos 100μmol/Kg, v.o, n=5-8* p<0,05 (teste t de Student)
©©ALPM2008ALPM2008
0
5
10
15
20
25VEÍCULOLASSBio 1009LASSBio 1013LASSBio 1016LASSBio 1017LASSBio 1018LASSBio 1024LASSBio 1195LASSBio 1196
54,4%* 61,2%
** 56,2%*
61,7%**
46,4%*
43,7%
4,8%
34,7%
* p< 0,05 , ** p< 0,01 One-way ANOVA, % inibição comparado ao controle veículo
Compostos 100μmol/Kg, v.o
ASC
(0,5
- 4h
)
Efeito Anti-hiperalgésico dos Derivados Quinoxalínicos:Área Sobre a Curva (ASC) do efeito temporal.
©©ALPM2008ALPM2008
0
5
10
15
20
COLCOL + DMSOL.1008L.1009L.1010L.1011L.1012L.1013L.1014L.1015
L.1016L.1017L.1018L.1019L.1020L.1021L.1022L.1023L.1024L.1025
*
*
77,9% 48,8%
Compostos 100 μM
Velo
cida
de d
e A
greg
ação
(incl
inaç
ão)
0
25
50
75
100
L.1011
AA
L.1020
AA + DMSOL.1008L.1009L.1010
L.1012L.1013L.1014L.1015
L.1016L.1017L.1018L.1019
L.1021L.1022L.1023L.1024L.1025
Compostos 100 μM
% A
greg
ação
* *
26,8%
25%
**
39,6% 20,3%
Derivados NAHQuinoxalínicos
Atividade Anti-Agregante Plaquetária
Fumian M M, 38º Congresso SBFTE, 2006.
LASSBio 1013 – 55,5% de inibição nas concentrações de 1μM, 10μM e 100μMLASSBio 1016 – 29,2% de inibição na concentração de 1μM e 39,3% a 100μMLASSBio 1018 – 35,1% de inibição na concentração de 1μM e 54,2% a 100μM
LASSBio 1013 – 50,9% de inibição nas concentrações de 1μM, 10μM e 100μMLASSBio 1016 – 40,1% de inibição nas concentrações de 1μM, 10μM e 100μMLASSBio 1018 – 19,7% de inibição na concentração de 1μM e 75,4% a 100μM
Efeito sobre a produção de TXB2
Efeito sobre a produção de PGE2
Inibição PGs – não seletiva
©©ALPM2008ALPM2008
Anel Imidazolo-Piridina
N
N
CH3
O
NH
N
WN
N Ar
SCH3
O O
A
A
A’
Anel Quinoxalina
Anel Quinoxalina
NAH
NAH
B
B
Grupamentofarmacofórico
O
NH
NN
N R
W
Figura 2 - Gênese da Nova Série de Derivados N-acilidrazônicos (NAH) quinoxalínicos, desenhados como candidatos a protótipos antiinflamatórios e analgésicos
A e A’= bioisosterismoclássico
B+A’
Hibridação Molecular &
Bioisosterismo
W= substituintes elétron retiradores ou doadores
Anéis heteroaromáticos
N
NNH
NOO
LASSBio 1020
LASSBio 1021
N
NNH
NO N
LASSBio 1025
N
NNH
NO
N
Anel Imidazolo-Piridina
N
N
CH3
O
NH
N
WN
N Ar
SCH3
O O
A
A
A’
Anel Quinoxalina
Anel Quinoxalina
NAH
NAH
B
B
Grupamentofarmacofórico
O
NH
NN
N R
W
Figura 2 - Gênese da Nova Série de Derivados N-acilidrazônicos (NAH) quinoxalínicos, desenhados como candidatos a protótipos antiinflamatórios e analgésicos
A e A’= bioisosterismoclássico
B+A’
Hibridação Molecular &
Bioisosterismo
W= substituintes elétron retiradores ou doadores
Anéis heteroaromáticos
N
NNH
NOO
LASSBio 1020
N
NNH
NOO
LASSBio 1020
LASSBio 1021
N
NNH
NO N
LASSBio 1021
N
NNH
NO N
LASSBio 1025
N
NNH
NO
N
LASSBio 1025
N
NNH
NO
N
DERIVADOS N-ACILIDRAZÔNICOS QUINOXALÍNICOS
0 100 200 300
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120 DMSOLASSBio 1020LASSBio 1021LASSBio 1025
*
*
** * *
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
Concentração μM
% C
ontr
ação
1 10 100 1000
-10
10
30
50
70
90
LASSBio 1025
LASSBio 1020LASSBio 1021
[μM]
Rel
axam
ento
(% 1
0 μM
FN
F)
65,4 %119,8 μMLASSBio 1025
74,1 %55,1 μMLASSBio 1021
72,1 %10,9 μMLASSBio 1020
Relaxamento máximoIC50Composto
65,4 %119,8 μMLASSBio 1025
74,1 %55,1 μMLASSBio 1021
72,1 %10,9 μMLASSBio 1020
Relaxamento máximoIC50Composto
prazosina
Louback L S, XXVIII Jornada IC UFRJ, 2006.
©©ALPM2008ALPM2008
Simbióticos
TNF-α
MAPK p38
PGs
PDEs
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Prof. Eliezer J. BarreiroProf. Eliezer J. BarreiroProf. Carlos A. M. Prof. Carlos A. M. FragaFraga
ProfaProfa. Lidia M. Lima. Lidia M. LimaProfaProfa. . FernandaFernanda Carla F Carla F BritoBrito
Dra. Patricia C. LimaDra. Magna Suzana A. Moreira
Ms. Arthur E. KümmerleDra.Carolina Matos Duarte
Ms. Daniel I. LacerdaLeandro Louback
Eduardo F. Mazzeu
Departamento de Farmacologia Básica e Clínica, ICB, UFRJ.
Prof. Claire Lugnier – CNRS, UniversitéLouis Pasteur, Strasbourg, Fr.
©©ALPM2008ALPM2008
Universidade Federal do Rio de JaneiroUniversidade Federal do Rio de Janeiro
PRONEX
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