Mise au point de la technique High Resolution melt (HRM) pour
le génotypage des polymorphismes génétiques ponctuels
(SNPs) et la détection des mutations
BEN SALAH Hamza
Laboratoire de Parasitologie Médicale, Biotechnologies
et Biomolecules, Institut Pasteur de Tunis, LR 11-IPT-06
Colloque Jeunes Chercheursde l’Institut Pasteur de Tunis8-9 Décembre 2016
Les polymorphisms génétiques ponctuels (SNPs)
représente la forme de variation la plus abondante dans
l’ADN humain.
Parmi les objectifs de l’analyse des SNPs est l’étude de la
susceptibilité génétique des maladies humaines complexes.
Les polymorphismes génétiques ponctuels (SNPs)
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Génotypage des SNPs
Couteûses
Lourdes
Manipulations post-PCR
Séquençage, PCR-
RFLP, Essais TaqMan,
Spectrométrie de
masse, puces à ADN…
Efficacité, cependant,…
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La technique High resolution melt (HRM)
Technique rapide: 90-120 minutes
Faible risque de contamination:
’closed tube technique’
Technique non destructive
Excellent Rapport coût/efficacité
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Historique
L’analyse HRM est une extension de l’analyse classique des
courbes de fusion.
Une méthode relativement nouvelle mise en place en 2003.
Collaboration entre le laboratoire d’analyse d’ADN de l'Université de
l'Utah (Pr. Carl wittwer) et Idaho Technology, Inc (Salt Lake City, UT).
Appliquée avec succès au Génotypage des SNPs, détection de
variants, identification des espèces, étude de la méthylation de
l’ADN…
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High Resolution Melt (Fusion à haute résolution)
… C’est quoi ? … en quoi consiste… ?
La méthode HRM caractérise les échantillons d'acides
nucléiques pour leur comportement à la dissociation
("melting") suite a une montée standard en température.
La discrimination se fait en fonction de la température de
fusion (Tm) et l’allure des courbes de fusion.
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Syber green: intercalant non saturant Eva green: intercalant saturant
…Agent intercalant saturant ou non saturant ?
VSRéincorporation de l’intercalant
Pas de changement dans le signal de fluorescence Diminution du signal de fluorescence
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Gène Polymorphisme
USP03 rs17765311A/C
APH rs2131109 A/G
USP40 rs12472244 A/G
Les gènes étudiés
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L’ Acyl peptide hydrolase (APH)
Le gène APH humain est localisé sur le chromosome
3 (3p21.31).
Les gènes étudiés
Le Polymorphisme rs2131109A/G
Substitution type transition d’une adénine par une
guanine A>G.
Localisation du gène APH sur le chromosome 2
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Les gènes étudiés
La protéase spécifique d’ubiquitine 40 (USP40)
Le gène USP40 humain est localisé sur le
chromosome 2 (2q37.1)
Substitution type transition d’une adénine par une guanine
A>G.
Le Polymorphisme rs12472244A/G
Localisation du gène USP40 sur le chromosome 2
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Les gènes étudiés
La protéase spécifique d’ubiquitine 3 (USP03)
Le gène USP03 est localisé sur le chromosome 15
(q22.31).
Le polymorphisme rs17765311A/C
Localisation du gène USP03 sur le chromosome 15
Mutation type transversion, substitution d’une adénine
par une guanine A>C.
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Objectif
La mise au point de la technique qPCR-HRM pour
le génotypage des polymorphismes
rs17765311A/C, rs12472244A/G, rs2131109A/G
et la détermination de leur distribution génotypique
chez la population générale tunisienne.
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Matériel et Méthodes
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La population d’étude
• 118 sujets « sains ».
• Services de consultants externes de l’Institut Pasteur de Tunis.
Consentement des participants
et éthique
Un accord a été obtenu suite a une
demande déposée, pour une
évaluation complète d’éthique,
auprès de comité d’éthique
médicale de l’Institut Pasteur à
l’entame de ce projet.
Matériel
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Conception d’amorces
Outils de conception
Logiciel Primer 3: présélection de trois
couples d’amorces pour chaque
polymorphisme.
Logiciel Netprimer: choix du couple
d’amorce le plus stable: faible possibilité de
formation de dimères et de structures
secondaires.
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Design des couples d’amorces
Gène SNP Taille Tm (°C)
USP03 rs17765311 132 pb 58.8
APEH rs2131109 133 pb 60.0
USP40 rs1247224 112 pb 56.8
Les trois couples conçus répondent au mieux aux exigences de l’analyse HRM: Tm
comprise entre 55°C et 60°C, taille de l’amplicon comprise entre 100 et 150pb,
pourcentage important en GC supérieur a 50%, très faible possibilité
d’autohybridation.
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Montée standard en T° 0,2°/s
Dénaturation
Courbe de fusion
High Resolution Melt
Analyse des courbes de
fusion
Courbes d’amplification
Contrôles positifs
Attribution des
génotypes
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Résultats
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50 pb
100 pb
MT 1 2 3 4 5 6 ND
97 pb97 pb97 pb + 106pb132 pb
Identification du polymorphisme rs17765311A/C (USP03)
Profil de migration des produits digérés
106 pb 106 pb106 pb
A/A A/A A/A
Amplification par
PCR classique
Digestion
enzymatique
(Alu1)
Profil de migration la séquence amplifiée du
gène USP03
132 pb
M 1 2 3 4 T(-)
200 pb
100 pb
C/C C/CA/C
Détection des contrôles positifs
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QPCR-HRM
Coubes d’amplification de la séquence cible du gène USP03
Amplification
Identification du polymorphisme rs17765311A/C (USP03)
Courbes de fusion normalisées de la séquence
amplifiée du gène USP03
A/A
A/C C/C
Courbes de différences de la séquence amplifiée
du gène USP03
A/C
A/A
C/C
Analyse HRM
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Gène polymorphisme Génotype/ Allèle N % HW
USP03
Génotype
0.51
A/A 48 41.73
A/C 55 47.82
C/C 12 10.43
Allèle
A 151 65.6
C 79 34.4
Distribution allélique et génotypique du polymorphisme rs17765311A/C
chez la population générale tunisienne
Identification du polymorphisme rs17765311A/C (USP03)
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100 pb
200 pb
Profil de migration de la séquence cible du gène APH
MT 1 2 3 4 5 T(-)
133 pb
Identification du polymorphisme rs2131109 A/G (APH)
rs2131109
Chromatogramme de la séquence cible d’un échantillon à
génotype A/G
Amplification par
PCR classique
Séquençage des
produits PCR
Détection des contrôles positifs par séquençage
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Identification du polymorphisme rs2131109 A/G (APH)
QPCR-HRM
Coubes d’amplification de la séquence cible du gène APH
Courbes de fusion normalisées de la séquence
amplifiée du gène APH
A/A
A/G G/G
Courbes de différences de la séquence
amplifiée du gène APH
G/G
A/A
A/G
Amplification
Analyse HRM
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Gène polymorphisme Génotype/Allèle N % HW
APH rs2131109 A/G
Génotype
0.89
A/A 46 40
A/G 54 47
G/G 15 13
Allèle
A 146 63.5
G 84 36.5
Distribution allélique et génotypique du polymorphisme rs17765311A/G
chez la population générale tunisienne
Identification du polymorphisme rs2131109 A/G (APH)
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Identification du polymorphisme rs12472244 A/G (USP40)
Chromatogramme de la séquence cible d’un échantillon à
génotype A/A
rs12472244
200 pb
100 pb
MT 1 2 3 4 5 T(-)
Profil de migration de la séquence cible du gène
USP40
112 pb
Amplification par
PCR classique
Séquençage des
produits PCR
Détection des contrôles positifs
Colloque Jeunes Chercheursde l’Institut Pasteur de Tunis8-9 Décembre 2016
Identification du polymorphisme rs12472244 A/G (USP40)
Coubes d’amplification de la séquence cible du gène USP03
QPCR-HRM
Analyse HRM
Courbes de fusion normalisées de la séquence
amplifiée du gène USP40
G/G
A/A
A/G
Courbes de différences de la séquence
amplifiée du gène USP40
A/A
G/G
A/G
Amplification
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Gène polymorphisme Génotype/Allèle N % HW
USP40 rs1247244A/G
Génotype
0,14
A/A 44 38.26
A/G 48 41.74
G/G 23 20
Allèle
A 136 59
G 94 41
Distribution allélique et génotypique du polymorphisme rs17765311A/C chez
la population générale tunisienne
Identification du polymorphisme rs17765311A/C (USP40)
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rs12472244
Chromatogramme révélant une deuxième mutation au niveau de la
séquence amplifiée du gène USP40
Détection d’une mutation supplémentaire
A/T
Lors de l’identification de contrôles positifs du polymorphisme du gène USP40
(rs12472244), un SNP supplémentaire a été détecté dans l’un échantillon.
L’analyse HRM a révélé une courbe différente des trois génotypes qui forme
un cluster séparément.
Cluster isolé
Coubes de différences
Identification du polymorphisme rs12472244 A/G (USP40)
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Discussion
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Ce travail est le premier a avoir identifié ces SNPs par
qPCR-HRM.
Cette approche se distingue des autres techniques de
génotypage par sa simplicité, son efficacité et son
cout réduit.
Colloque Jeunes Chercheursde l’Institut Pasteur de Tunis8-9 Décembre 2016
L’échantillon présentant un SNP secondaire
(détecté par séquençage) a généré une courbe
différente de celle des trois génotypes et a formé un
cluster séparément lors de l’analyse HRM .
Possibilité d’appliquer la technique
pour la recherche des mutations
Technique très sensible
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…Limite
Les formes homozygotes (C/C, G/G et A/A, T/T) Difficiles à
distinguer compte tenu de la faible différence de Tm
Niveau d’amplification
SNP de classe III (C/G) et IV (A/T)
Trois échantillons n’ont pu être discriminés par HRM due à leur
faible niveau d’amplification. L’analyse HRM est limitée par un
niveau d’amplification faible.
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Conclusions et perspectives
Colloque Jeunes Chercheursde l’Institut Pasteur de Tunis8-9 Décembre 2016
La mise en place d’une technique de génotypage efficace
et rapide: la qPCR-HRM.
Détermination pour la première fois de la distribution
génotypiques et alléliques des trois polymorphismes étudiés
dans la population générale tunisienne.
Intérêt de la technique qPCR-HRM dans la découverte de
nouveaux polymorphismes.
Colloque Jeunes Chercheursde l’Institut Pasteur de Tunis8-9 Décembre 2016
En perspectives,
Etude cas témoins pour analyser l’association des trois
polymorphismes génétiques à la rectocolite
hémorragique en Tunisie.
Mise au point de qPCR-HRM triplexe pour l’amplification
et le génotypage des trois SNPs étudiés simultanément.
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• Ce travail s’inscrit dans le cadre d’un projet
collaboratif interne (PCI06): <<Etude des facteurs
de risques génétiques et microbiologiques
associés à la rectocolite hémorragique en
Tunisie 2014-2016>>.
• PIA Dr. CHELBI Hanen
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