Université des Sciences et de la Technologie Houari BoumedieneFaculté des Sciences Biologiques
Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire Groupe : 2
Master enGénie-Biologique & Innovation Technologique
Réaliser par:BENTALEB KawtherBOULAHBEL HouriaBELATACHE AMINA
Proposé par :
Contrôle microbiologiques des médicaments
Madame : OUSSEDIK
Le plan:1/Introduction2/Les techniques microbiologique3/Contrôle microbiologique de l’ environnement 4/ Contrôle microbiologique des médicaments 5/ Application sur le contrôle microbiologique des médicaments 6/Conclusion
Le médicament est l’un des produits de consommations le plus délicat
C’est pourquoi la stabilité et la régularité de ce produit est une exigence dans la fabrication pharmaceutique , et pour
l’atteindre il faut une mise en place d’un contrôle de la qualité soigneusement dirigé par un système d’assurance qualité . parmi ces contrôles on a le contrôle microbiologique
INTRODUCTION
• afin d’appliquer le contrôle microbiologique il faut d’abord savoir les différents origines des contaminations accidentelles qui peuvent toucher la santé des patients surtout lors du mélanges des matières premières qui sont résumé ci-dessous
Origine de contamination des produitspharmaceutiques
Contamination par les surfaces et le matérielBiocontamination d’origine humaine
Contamination par l’airContamination par l’eau
Matière premièresConditions de fabrication
Condition de stockage
Dans le but d’identifier toutes causes ou agent nuisibles afin de réduire ou d’éliminer ces
contaminations pour assurer l’innocuité et la stabilité du médicament pendant toute la durée de sa
validation des contrôles de qualité sont réaliser y compris physico-chimique et microbiologique.
Est une série d’épreuves:
qualitatives (contrôle microbiologique ,toxicologique) de dosage (contrôle physico-chimique)
auxquelles doivent être soumis avant sa commercialisation tout produit terminé et produit intermédiaire et matière première, suivant les techniques décrites dans le dossier d’autorisation de mise sur le marché par la pharmacopée afin de répondre aux normes prévues
Contrôle de la qualité:
défini les critères de pureté des matières premières ou des préparation entrant dans la fabrication des médicaments et
les méthodes d’essai et d’analyses à utiliser pour assurer leur contrôle dans
le but d’unifier la composition des médicaments et d’indiquer le mode de préparation de certains médicaments
Pharmacopée européenne
Afin d’apprécier la qualité microbiologique d'un médicament durant le procédé de fabrication des différents étapes sont utiliser dans le but de rechercher et dénombrer dans les différents échantillons prélevés les microorganismes suivant:•Les bactéries aérobies viable totale: concerne tous les microorganismes aptes a se multiplier a des températures moyennes•Les levures et moisissures: sont responsables de nombreux phénomènes d'altération d'enzymes hydrolytiques(amylases, protéases, lipases ,...)•Les germes spécifiques « Staphylococcus aureus , Pseudomonas, E.coli , entérobactéries.
Analyse microbiologique
Techniques de microbiologie
Techniques de microbiologie
Stérilisation
ensemencement
isolement
Techniques de stérilisation
La stérilisation est une opération qui vise à détruire tous les micro-organismes d'un objet de façon durable.
objectif
contrôler les micro-organismes.prévenir une éventuelle contamination
Stérilisation par la
chaleur Stérilisation
par gazStérilisation par
action des
radiations
Stérilisation
par des agents chimiq
ues
Stérilisation par
filtration
A/ Stérilisation par la chaleur
I. Chaleur sèche
On distingue les procédés à chaleur « sèche » ou « humide ».
a/ Flambage
Le passage dans la flamme (bec BUNSEN) de la surface de matériel non inflammable assure une parfaite stérilisation. On stérilise de cette façon les fils de platine et les pipettes Pasteur.
b/ Four PasteurC'est un four - étuve à air chaud et sec. Il est utilisé pour la stérilisation de la verrerie videLa verrerie à stériliser doit être propre et sèche, bouchée avec du coton et emballée dans du papier solide.Elle est alors disposée à l'intérieur du four et subit un chauffage de :- 30 minutes à 1 heure à 170° - 180°C - 2 heures à 160°C.Le matériel ainsi stérilisé sera laissé dans l'étuve jusqu'à son refroidissement, puis stocké à l'abri des poussières.
I. Chaleur humide
La stérilisation par la chaleur humide, reconnaît trois modalités:
la stérilisation à l’autoclave
La Pasteurisation
La Tyndallisation
I. Chaleur humide
la stérilisation à l’autoclave
Autoclave : c’est un appareil indispensable dans un laboratoire de microbiologie. Le chauffage a lieu sous pression de vapeur d’eau, à une T° de 120°C pendant une durée qui varie en fonction du milieu, de la température utilisée et du volume des récipients. Ce procédé tue toutes les cellules végétatives et les endospores.
I. Chaleur humide
La Pasteurisation
la pasteurisation est un traitement à chaud de liquides, tuant des pathogènes mais pas forcément toutes les bactéries. Les températures de la pasteurisation se situent entre 75 à 80°C
Principe de la pasteurisation
I. Chaleur humide
La Tyndallisation
La tyndallisation est une série de 3 chauffages bref à des températures de 70°C à intervalles réguliers, ceci afin de laisser aux formes résistantes la possibilité de germer pour les tuer au chauffage suivant. Par exemple la destruction des pathogènes du lait se fait par un cycle de 63°C pendant 30 minutes suivie de 73°C pendant 15 minutes
B/ Stérilisation par filtration
La filtration est une technique qui consiste à faire passer un liquide à travers un filtre dont les pores ont un diamètre de 0,2 µm. Les micro-organismes sont trop gros et sont donc retenus par le filtre. Cette technique est intéressante lors d'utilisation de produits thermolabiles comme: certains acides aminés aromatiques, vitamines, hormones de croissance, acides nucléiques et une bonne partie des antibiotiques
Principe :C’est une technique de séparation non dénaturante à travers des membranes poreuses
B/ Stérilisation par filtration
La phase traversant la membrane Est appelée « Perméat ».
la phase retenue par la membrane est appelée« Rétentat ».
C/ Action des agents chimiques
I / Antiseptiques-Tuent les cellules vivantes, microorganismes et autres. Leur action est quasi instantannée. Ils agissent à l'intérieur de l'organisme ou à sa surface : teinture d'iode, , permanganate de potassium, eau oxygénée
II / Désinfectants- Empêche les contaminations humaines et animales- vapeurs ( formol, gaz sulfureux, oxyde d'éthylène )- liquides ( phénols, sulfate de cuivre, de fer, eau de Javel, permangante de potassium )-solide ( chaux vive )
III / AntibiotiquesSubstances d'origine naturelle ou obtenues par synthèse chimique. On distingue :- les antibiotiques bactériostatiques qui stoppent la multiplication des bactéries sans les détruire- les antibiotiques bactéricides qui tuent les bactéries
L'emploi d'agents chimiques vise la destruction d'espèces bactériennes déterminées au sein d'une flore poly-microbienne.
C/ Action des radiations
La radio-stérilisation est opérée par exposition du produit à un rayonnement
ionisant , le principe repose sur l’ionisation et l’excitation des atomes des cellules et leur milieu avec formation de radicaux libres ; la
rupture des liaisons protéiques altère les acides nucléiques des bactéries.
E/ sterilisation par gaz
L’évolution des dispositifs médicaux et l’utilisation de plus en plus répandue des
contenants en matière plastique (polymériques), se qui nécessite de technique de stérilisation à basse température efficace, facile à mettre en
œuvre , valable autant pour le petit matériel que des grands volumes (locaux).
Techniques de microbiologie
Stérilisation
ensemencement
isolement
Techniques d’ensemensement
L’ensemencement consiste à déposer dans un milieu neuf des germes prélevés dans un milieu de culture mère. Le transport est en général effectué avec une anse ou une
pipette Pasteur..
A / Ensemencement avec une anse: B/ ensemencement avec la pipette Pasteur
Les milieux de culture
Les milieux d’enrichissement:
permettant de favoriser la croissance d’une espèce en faible
quantité dans un échantillon.
les milieux d’isolement: permettant la
croissance de plusieurs espèces bactériennes
les milieux sélectifs: favorisant la
croissance d’un type bactérien particulier tout en inhibant celle
des autres types bactériens.
Les milieux de cultures les souches Température d’incubation
Tryptocaséine de soja (TSA) Germes totaux 35°C
Sabouraud levures et moisissures 25°CMac Conkey Escherichia coli 35°CVogel –johnson Staphylococcus aureus 35°CCetrimide Pseudomonas aeruginosa 35°C
Gélose agar lactosée ou saccharosée
Salmonella 35°C
On distingue plusieurs types de milieux de culture selon leur fonction
A / Ensemencement avec une anse:
- flamber l’ouverture du tube
- stériliser l’anse en la portant au rouge dans la flamme du bec Bunsen, la laisser refroidir dans la zone stérile.
- prélever et repiquer rapidement dans le tube contenant le milieu de repiquage :
. repiquage sur milieu solide : repiquer en déplaçant en zig zag l’aiguille sur la surface de l’agar, du fond du tube vers l’ouverture, en prenant soin de ne pas érafler la gélose
. repiquage dans un milieu liquide : repiquer ce qui est prélevé à l’intérieur de la boucle
- repasser dans la flamme l’aiguille à ensemencer en la portant au rouge. L’aiguille est prête pour un nouvel ensemencement .
flamber l’ouverture des tubes, flamber légèrement les cotons, boucher
B/ ensemencement avec la pipette Pasteur :
Les manipulations se différencient des précédentes par quelques détails :
- la pipette est passée rapidement dans la flamme.
- l'effilure est cassée à la pince dans la zone stérile.
- on aspire les bouillons de culture
- on souffle pour ensemencer dans le tube stérile.
- la pipette ne sert qu'une fois.
Techniques de microbiologie
Stérilisation
ensemencement
isolement
Techniques d’isolement
Pour étudier les microorganismes, il est indispensable de les isoler et d'en faire une culture pure. Deux techniques sont alors utilisées :
1/ La méthode des stries 2/ La méthode des dilutions
1/ La méthode des stries
- porter l'anse au rouge dans la flamme du bec, la laisser refroidir dans la zone stérile et avec l'autre main entrouvrir la boite de culture ( solide ) ou le tube ( liquide )
prélever une colonie ou une goutte de suspension avec l'anse, refermer la boite ou le tube et prendre la boite vierge
. Flamber l'anse, la laisser refroidir et repartir perpendiculairement à la direction
- les boites de Pétri sont mises en position renversée à l'étuve à 30°C. Observer après 24 à 48 heures selon le cas ( la position renversée permet à l'eau de condensation de s'évaporer
2/ La méthode des dilutions
Cas d'un ensemencement en surface par étalement d'un milieu liquide :
- les dilutions sont faites dans de l'eau distillée ou dans un
liquide physiologique de type Ringer
- numéroter des tubes à essai de 1 à 10,
chaque tube contient 1 ml de liquide de
dilution
- homogénéiser par aspirations
successives et souffler la dilution 1, en
prélever 0.1 ml et verser dans le tube 2.
- dans le tube 1, à l'aide d'une pipette stérile, ajouter 0.1 ml de la suspension fournie, rincer la pipette trois
fois.
Ainsi de suite jusqu'à l'obtention de la dilution n°10.
I/Contrôle microbiologique environnemental
le contrôle d’environnement est un domaine qui prend de plus en plus d’importance du fait de son lien avec une éventuelle contamination des produits pharmaceutiques
OBJECTIF
Identifier les voies de contamination possibles
mettre en place des actions correctives avant que le produit ne soit contaminé
Contrôle microbiologique environnemental
PersonnelAir et Eau
Locaux
Air et Eau
1/ Air : Vue sa richesse en microorganismes, il doit être filtré rigoureusement
dans des zones à atmosphères contrôlées . Un contrôle est aussi exercé sur les paramètres physiques du système de
traitement d’air : pression, débit, température, hygrométrie But : Estimer la charge microbienne de l’air, à des différents lieux définis du
local. Principe: La méthode utilisée est dite la méthode statique ou de sédimentation Mode opératoire :
l’exposition des boites de Pétri ouvertes renfermant un milieu de culture standard (gélose nutritive) pendant 4 heures
incuber à 37°C pendant 48 heures
dénombrement des particules donnant naissance à des colonies sédimentées
Air et Eau
1/ Air : Vue sa richesse en microorganismes, il doit être filtré rigoureusement
dans des zones à atmosphères contrôlées . Un contrôle est aussi exercé sur les paramètres physiques du système de
traitement d’air : pression, débit, température, hygrométrie
2/ Eau (concernant surtout les médicaments obligatoirement stériles):
Le niveau de qualité attendu nécessite la mise en œuvre de traitements capables d’éliminer les sels minéraux (déminéralisation), les micro-organismes, et de supprimer toute activité pyrogène (provocant de la fièvre) par l’absence d’endotoxines . Parmi ces traitements, on connait l’osmose inverse qui est un système de filtration qui, sous l’effet de la pression, permet de retenir les minéraux, les particules, les micro-organismes, en fonction de leur taille.
2/ Eau (concernant surtout les médicaments obligatoirement stériles):
Le niveau de qualité attendu nécessite la mise en œuvre de traitements capables d’éliminer les sels minéraux (déminéralisation), les micro-organismes, et de supprimer toute activité pyrogène (provocant de la fièvre) par l’absence d’endotoxines . Parmi ces traitements, on connait l’osmose inverse qui est un système de filtration qui, sous l’effet de la pression, permet de retenir les minéraux, les particules, les micro-organismes, en fonction de leur taille.
Personnel
Les tenues doivent être stériles, donc conçues pour ne libérer ni fibres ni particules et doivent retenir les particules émises par l’opérateur
Tenue
Cagoule qui renferme
totalement les cheveux
Masque couvre le
bas du visage
Lunette qui raccorde la cagoule et le masque
Combinaison Serrée
complétées par des bottes
But : estimer la charge microbienne retrouvée sur les mains gantées des opérateurs.
Principe : méthode des empreintes digitales.
faire une empreinte des cinq doigts pour les deux mains (droite, gauche et, chacune dans une boite), sur un milieu gélosé nutritif coulé sur boite de Pétri.
Incuber à 37°C pendant 48 heures.
Expression des résultats : en UFC/ 5 doigts.
Locaux
situés dans un environnement qui représente un risque minimum de contamination
Dans les zones à atmosphère contrôlé (ZAC) , les surfaces doivent être
Lisse
imperméable
sans fissures
Réduire l’accumulation des microorganismes
Utilisation des produits de nettoyage et désinfectant stériles pour éviter même le développement des souches résistantes
But : révéler les types de microorganismes présents sur les surfaces planes ou bombées.
But : révéler les types de microorganismes présents sur les surfaces planes ou bombées. Principe: technique de l’écouvillonnage qui réside à des prélèvements à l’aide d’un
écouvillon.
Humidification de l’extrémité de l’écouvillon par l’eau distillée,•Rouler doucement l’écouvillon sur la surface à contrôler soit 25 cm2. ,•Réaliser des suspensions bactériennes de 5 ml,•Ensemencer un inoculum de 1 ml dans deux boites de Pétri pour chaque écouvillon,•Incuber à 32°C pendant 5 jours.
Mode opératoire :
Lecture des résultats : en UFC par boite.
On distingue 2 catégories d'enceinte stérile :1.Les enceintes physiquement fermées dénommées isolateurs2.Les enceintes physiquement ouvertes à flux d'air laminaire dénommées hottes à flux d'air laminaire
prélèvements à l’aide d’un écouvillon : une petite brosse cylindrique qui sert à nettoyer l'intérieur des récipients à col étroit
Les hottes à flux d'air laminaireLes hottes à flux d'air laminaire sont des enceintes qui sont traversées par un flux d'air qui se déplace à une vitesse uniforme suivant des lignes parallèles.Le principeLe principe des hottes à flux d'air laminaire consiste à absorber de l'air et à le filtrer avec un filtre HEPA avant de le projeter sur la paillasse de travail. Ce flux d'air entraîne un effet piston qui repousse les micro-organismes.
Le rôle de la filtration est double : - apporter de l'air propre dans la zone de travail. - éviter l'élimination de produits dangereux dans l'environnement
L’isotechnie Elle consiste à créer une barrière physique entre l’opérateur, qui se trouve dans une zone non-stérile, et les équipements dans lesquels se déroulent les étapes critiques du remplissage et du bouchage des médicaments (injectables surtout.) Les manipulations s’effectuent de l’extérieur, à travers :
gants étanches fixés à la paroidemi-scaphandre.
L’isotéchnie a été conçue pour réduire sensiblement les risques de contamination de l’environnement des
produits fabriqués de façon aseptique.
1 / La filtration sur membrane
une méthode efficace d’analyse de la contamination microbienne ou particulaire des solutions aqueuses. Elle est largement utilisée pour :
Le comptage des bactéries hétérotrophes
Le comptage des
champignons (levures et
moisissures)
L’isolation de E. coli,
Pseudomonas sp., Lactobacillus sp.
etautres
Principe :C’est une technique de séparation non dénaturante à travers des membranes poreuses
La phase traversant la membrane Est appelée « Perméat ».
la phase retenue par la membrane est appelée« Rétentat ».
Produits obligatoirement stériles :consiste à vérifier l’absence de contamination bactérienne dans les substances ,les préparations et les produits qui doivent être stériles selon la pharmacopée.
Produits non obligatoirement stériles :il s’agit du dénombrement des germes aérobies viables totaux (les bactéries ,levures et moisissures ) et de rechercher des micro-organismes spécifiés :Escherichia coli,Pseudomonas
On a deux types de contrôles:
Médicaments obligatoirement stérile
Procédure :A/ Filtrez 100 mL de l’échantillon avec une membrane Pall à l’aide d’un entonnoir de filtration et d’un système à vide.Tous les organismes présents dans le prélèvement se concentrent à la surface de la membrane.
Membranes
Entonnoirs a usage unique
B / L’échantillon est versé dans l’entonnoir et si nécessaire, la membrane est rincée une fois ou plusieurs fois pour éliminer les substances inhibitrices qui étaient présents dans l'échantillon
C/ Placez le filtre à membrane dansla boîte de Pétri préparée. Procédez àl’incubation à la température appropriéependant le délai prévu.
D /Comptez les colonies sous ungrossissement 10-15x et identifiezle type de contamination.
Avantages
Isoler et de dénombrer les micro-organismes, tout en indiquant s’ils sont présents ou absents en à peine
24 heures.
Permet de concentrer de
grands volumes d’échantillons.
Autorise l’isolation et le comptage de
colonies discrètes.
Réduit le délai de préparation par rapport aux autres
méthodes traditionnelles
2 / Ensemencement par inclusion :
Rappel: L’ensemencement est une opération qui
consiste à déposer dans un milieu de culture stérile des germes prélevés à partir d’une culture
mère (milieu naturel) ou culture pure , le transfert est généralement effectué avec :
• Un fil à ensemencer.
• L’anse de platine.
• Une pipette Pasteur.
Milieu gélosé fondu
solidificationEchantillon dilué
Incubation
Lecture des UFC
3/ Ensemencement en stries :
C’est une méthode classique d’isolement par dissémination des germes microbiens aérobies (bactéries et levures) à la surface des milieux de culture solides.
Le mélange microbien est transféré au bord d’une boite de Pétri gélosée à l’aide d’une boucle d’inoculation ou d’un écouvillon et étalé à la surface d’une boite en suivant un motif défini
4/ Méthode NPP du nombre le plus probable:
But : estimation du nombre de bactéries dans des échantillons solides ou liquides contaminés
difficilement analysé par la filtration sur membrane
Principe :
Témoin Echantillon dilué en série + milieu de culture
Incubation 24h à 44,5°C(Croissance des bactéries )
Noter le nombre de tubes positifs selon les tables du NPP basées sur la loi du Poisson.
Après ces différentes techniques effectuées
sur les matières premières et les produits
semi-fini , on procède pour une deuxième
fois à une filtration sur membrane mais
réalisée sur le produit fini et qu’elle est suivie
d’un ensemencement direct
5 / Ensemencement direct
Inoculum S’il ya des troubles
Repiquage sur milieu frais
Incubation au moins 4 jours
24 jours
6/ Test de recherche des microorganismes
Les germes totaux :Concerne tous les micro-organismes capable de se multiplier à des températures
moyennes
les germes fongiquesConcerne tous les micro-organismes capables de secréter des enzymes hydrolytiques provoquant plusieurs phénomènes d’altération.
Entérobactéries
Escherichia coliStaphylococcus
aureus
Les salmonelles
LES MICROORGANISMES SPECIFIQUES :
Dans le but de rechercher ces différents microorganismes , on effectue des repiquages c’est-à-dire des transplantations des cultures pures sur des milieux de
culture neufs spécifiques pour chaque microorganisme:
Les milieux de cultures les souches
Tryptocaséine de soja (TSA) Germes totaux
Sabouraud levures et moisissures
Bouillon Mac Conkey Agar Mac Conkey
Escherichia coli
Vogel –johnson Mannitol Salt Agar
Staphylococcus aureus
Agar Cetrimide Pseudomonas aeruginosa
Gélose agar lactosée ou saccharoséebouillon soja RVS
Salmonella spp
7 /Lecture des colonies :
Type de germes dénombrés
Observation des coloniesAvant utilisation Après utilisation
Germe fongique
(Gélose Sabouraud)
E. Coli (Gélose Mac Conkey)
Pseudomonas aeruginosa
(Gélose au Cétrimide)
Salmonella spp(Gélose SS)
Staphylococcus aureus
(Gélose Vogel-johnson)
Les repiquages effectués sont suivis d’un dénombrement par la technique du nombre le plus probable
7/ Recherche de pyrogènes :
C’est un test obligatoire pour tous les solutés injectables dont le volume de conditionnement est supérieur ou égal à 15 ml,
Des microorganismes susceptibles de provoquer des réactions
d’hyperthermie à l’injection le plus souvent par les endotoxines
bactériennes des bactéries Gram négatif
Les pyrogènes sont recherchés dans l’eau , les produits intermédiaires et les produits finis en effectuant deux tests :
Essai in vivo
Essai in vitro
1. Injection d’une solution de NaCl 0.9% apyrogène 1 à 3 jours afin d’exclure les animaux ayant une variation de température trop importante.
2. Injection durant 4 minutes dans la veine marginale de l’oreille du liquide préchauffé à 38.5°C.
Utilise un lysat de cellules sanguines du crabe limulus (arthropode), qui a la propriété de floculer (coaguler) en présence d’endotoxines de bactéries à Gram négatif.
Les symptômes de pyrogénicité
Frissons intenses Cyanose,
Un pouls rapide accompagné de dyspnée
Des douleurs lombaires
Donc : l’apyrogénicité définie comme l’absence respective de micro-organismes viables et de substances pyrogènes, constitue un critère de qualité microbiologique et de sécurité pour l’administration des médicaments ou l’utilisation des dispositifs médicaux chez l’homme. Le contrôle de ce paramètre, en terme d’objectif, de conditions opératoires et d’interprétation des résultats, est fixé par la Pharmacopée pour les médicaments et normes pour les dispositifs médicaux.
Application sur le contrôle microbiologique de médicament
Application N°1
Contrôle microbiologique,
d’une suspension buvable pour enfant,
obligatoirement stérile,
anti-inflammatoire non stéroïdien
« ALGIFEN® » durant sa production
et son conditionnement.
Forme et présentation ALGIFEN® est une
suspension buvable réservée aux nourrissons
et à l’enfant de 3 à 12 ans dosée à 20 mg/ml dans
des flacons de 125ml avec un bouchon doseur gradué
en ml ou pipette pour administration orale graduée en Kg .La
posologie usuelle est de 20 à 30 mg/kg 3 à 4 fois
par jour.
Antalgique
Antipyrétique
Anti-inflammat
oire
Pharmacothérapie du médicament :
Traitement symptomatique des affections
douloureuses et/ou fébriles
ALGIFENE
IbuprofènePolysorbate 80
Acide citrique anhydre
Sorbitol 70%
Eau purifiée
Gomme xanthane
SaccharoseGlycérol
Benzoate de sodium
Acésulfame potassique
Rouge de cochenille A
Edétate disodique
Arôme banane
Arôme Fraise vanille
Composition chimique du médicament :
Contrôle microbiologique de l’eau purifiée
Dénombrement des bactéries viables totales
Dénombrement des levures et moisissur
es
Résultats du contrôle microbiologique de l’eau purifiée
Bactéries viables totales.
Levures et moisissures
Contrôle microbiologique d’ALGIFEN®
2 lots au début du conditionnement 2 lots au milieu du conditionnement 1 lot à la fin du conditionnement
Un mélange de 10ml
Dilution dans 90mL d’une solution tampon peptonée au chlorure de sodium
Solution A
Dénombrement des bactéries viables
totales.Recherche de germes
spécifiques Escherichia coli
Dénombrement des germes
aérobies viables totaux.
Milieu TSAIncubation à 30-35°C pdt
5jrs
Milieu SabouraudIncubation à 20-25°C
pdt 5jrs
Pré-enrichissement sur 90 mL
de bouillon peptoné à la caséine de Soja.
Incubation à 37°C pdt 48hUn enrichissement sur bouillon
MacConkey à44°C pdt 24h puis un isolement sur gélose de
MacConkey.
le médicament ALGIFEN® est de bonne qualité tout au long de son processus de fabrication, et est définis comme étant prêt à la
consommation pour le plus grand bonheur des parents,
ALGIFEN® présente l’avantage d’être commercialisé à moindre cout, de fait qu’il soit localement produit, ce qui
diminue les charges.
Conclusion2:
Application N°2
Présentation de médicament :
Classe thérapeutique:le Maalox® appartient à la classe des antiacides et pansements gasto-intestinaux.
Nom commercial: Maalox®.
Principes actifs : Hydroxyde de magnésium (E527), Hydroxyde d'aluminium.
Laboratoire : Sanofi-Aventis France.
DCI: Hydroxyde d’aluminium et hydroxyde de magnésium.
le MAALOX est un médicament qui traite les manifestations douloureuses de l'hyperacidité des voies digestives supérieures, la gastrite, l'ulcère
gastroduodénal, l'hernie hiatale et l' oesophagite. La production de la suspension MAALOX s'effectue à
partir d'une dilution à l'eau purifiée de sa forme primaire le « PREMIX » auquel on rajoute aussi de
l'eau déminéralisée.
Présentation de médicament :
Ce médicament existe sous 4 formes :
comprimé
suspension buvable (flacon de 250ml)
Suspension buvable en flacon de 250ml goût menthe.
Suspension buvable en sachets-dose de 20 x 4 ,3 ml goût citron
Comprimés à croquer goût menthe.
Comprimés à croquer sans sucre goût citron.
Composition de Maalox®:
PA-hydroxyde de magnésium (10g/flacon) -hydroxyde d'aluminium (8.75 g/f)
Excipients
l'acide chlorhydrique concentré-une huile essentielle de menthe poivrée-sorbitol concentré à 70%-D- mannitol-Saccharine sodique
Conservateurs parahydroxybenzoate de méthyle (Nipagine)-parahydroxybenzoate de propyle (Nipazol)
Analyse microbiologique de Maalox®:
Analyse microbiologique de Maalox®:
La recherche et le
dénombrement:
des germes totaux
Concerne tous les micro-organismes aptes
à se multiplier à des températures moyennes
des germes fongiques
Sont responsables de nombreux phénomènes d’altération dus à leur pouvoir de sécrétion
d’enzymes hydrolytiques (amylases, protéases,
lipases, etc.)
Analyse microbiologique de Maalox®:
Escherichia coliElle représente l'une des causes majeures des diarrhées
aigues et des infections intestinales.
Entérobactéries Constituent un grand groupe de bactéries ayant une forte similitude, certaines sont dangereuses et provoquent des
problèmes sanitaires d'où l'importance de leur recherche
Staphylococcus aureus
Recherchée systématiquement dans le produit fini du fait de l'excrétion de nombreuses substances toxiques (enterotoxines, hémolysine) provoquant des infections
graves
Les salmonelles Sont des agents de Gastro-entérites, elles sont parmi les
principales bactéries responsables de toxi-infection.
La recherche de 4 types de germes spécifiés suivants:
AirPréparation des boites de pétri
TSA Sabouraud Tergitol
Germes totaux Germes fongiques
Germes pathogènes
30-35° C pendant 5 J 22-25° C pendant 24h à 48h 30-35° C pendant 24h à 48h
Ramener les boites à la T° du labo et vérifier l’absence de croissance microbienne
Exposition des boitesPendant 4 h
Incubation à 37° pdt 3jrs
+ 15 ml de milieu sabouraud à 45°C, laisser refroidir à 25°C pendant 5 J
+ 15 ml de milieu TSA à 45°C, laisser refroidir et incuber à 37°C pendant 3 J
1 ml dans chaque boite de pétri
10 ml de la suspension à analyser (prémix)
90 ml Tampon peptoné
e au NaCl
Dénombrement des germes totaux
Dénombrement des germes fongiques
Ensemencement en masse
Prémix
10 ml de l’eau à analyser
90 ml Tampon peptonée au NaCl
Dénombrement des germes totaux
Dénombrement de P.aeruginosa
Déposer la membrane sur milieu TSA
37°C, 48h
Bouillon BCS
Gélose au cétrimide
entonnoir
Mb filtrante0,45µm
30°c, 5 jrs
Étalement de 1ml
10ml
Eau purifiée
Introduire 200ml d’une solution tampon pH 7,2 et boucher à l’aide d’un bouchon cardé
Flacons à tester
Dénombrement des germes totaux
Recherche des germes pathogène
Déposer la mb sur milieu Mac Conkey Déposer la mb sur milieu TSA
Laisser en contact 1 à 2 h
Flacons
10 ml de la suspension à analyser (Maalox)
90ml Tampon
phosphater
1 ml dans chaque boite
Dénombrement des germes totaux
Dénombrement des germes fongiques
Dénombrement de Staph.aureus
+ 15 ml de milieu TSA à 45°C, laisser refroidir et incuber à 37°C pendant 3 J
+ 15 ml de milieu sabouraud incuber à
25°C pendant 5 J
+ Vogel Jonhson incuber à 37°C
pendant 3 J
Maalox® et eaux de rinçage
10 ml de la suspension à analyser (Maalox)
1 ml
Gélose Mac-Conkey. incuber à 37°C pendant
48 h
Gélose au cétrimide. incuber à 37°C pendant
48 h
Gélose SS. incuber à 37°C pendant 48 h
Pour la recherche de E.Coli
Pour la recherche de Salmonella sp
Pour la recherche de P.aeruginosa
10 ml de la suspension à analyser (Maalox)
1 ml
Gélose Mac-Conkey. incuber à 37°C pendant
48 h
Gélose au cétrimide. incuber à 37°C pendant
48 h
Gélose SS. incuber à 37°C pendant 48 h
Pour la recherche de E.Coli
Pour la recherche de Salmonella sp
Pour la recherche de P.aeruginosa
Dénombrement de Pseudomonas aeruginosa sur Gélose au Cétrimide
Avant utilisation Après utilisation
Les colonies sont verdâtres et fluorescentes.
Dénombrement de Salmonella sur Gélose SS
les colonies sont transparentes avec centre noir.
Avant utilisation Après utilisation
Dénombrement de Staphylococcus aureus sur Gélose Vogel-johnson
les colonies sont noires avec un halo jaune.
Les résultats sont exprimés en Unités Formant Colonie par millilitre ou par gramme (UFC/ml ou /g). le comptage peut s’effectuer soit par comparaison visuelle à un abaque fourni par le fabricant, soit par compteur laser (ceci nécessitant un milieu non opaque).
Le contrôle Les normesL’air Germes totaux ≤ 10 2 UFC/cm2
Germes fongiques ≤ 10 2 UFC/cm2
(pharmacopée Européenne 2002)
Le prémix « PA + excipients » Germes totaux ≤ 10 2 UFC/gGermes fongiques ≤ 10 2 UFC/gGermes pathogènes : S.aureus: Abs P.aeruginosa: Abs E.coli: Abs Salmonella.sp: Abs
L’eau purifiée Germes totaux ≤ 10 2 UFC/mlP.aeruginosa : Abs/10ml(pharmacopée Européenne 2002)
Les flacons Germes totaux ≤ 10 3UFC/mlGermes pathogènes : Abs/10ml(pharmacopée Européenne 1997)
Maalox® et eaux de rinçage Germes totaux ≤ 10 2 UFC/mlGermes fongiques ≤ 10 2 UFC/mlGermes pathogènes : Abs
Résultats:
une très bonne qualité microbiologique révélée par l’absence même de la flore fongique mais étant donné que le Maalox® est regroupé dans la catégorie des préparations pharmaceutiques non obligatoirement stériles, on peut noter la présence de quelques germes totaux et fongiques a condition que cela reste toujours dans les normes exigées par le partenaire.
Si Maalox® reste conforme aux normes tout au long de son processus de fabrication, à partir des matières premières (prémix, eau purifiée et eau oxygénée) et articles de conditionnement jusqu’au produit fini, défini comme étant prêt à la consommation.
Application N° 3
Notre choix s’est porté sur un médicament non obligatoirement stérile « Mycocide®», qui est
une pommade dermique hydrophobe présentée sous forme d’un tube de 15g. ce médicament est une association de trois
principes actifs et de deux excipients (tableau).
Vu sa composition, « Mycocide ®» est indiquée pour le traitement des dermatoses corticosensibles sur infectées par un germe
sensible à la néomycine et/ou par un Candida.
Forme et présentation
composants formule définition RôlePrincipes
actifsTriamcinolone acétonide (0,1g)
C24H31FO6Glucocorticoïde synthétique présente sous forme d’acétonide
Anti-inflammatoire stéroïdien à activité modérée.
Néomycine sulfate (0,25)
C23H46N6O13
XH2SO4
Mélange de sulfate et d’aminoside produits par Streptomyces fradiae
Antibactérien à effet bactéricide (inhibition de la synthèse protéique bactérienne).
Nystatine(10 MUI)
C47H75NO17 Substance chimique très complexe produite par Streptomyces noursei
Antifongique à activité fongistatique (augmentation de la perméabilité des champignons). Elle est efficace essentiellement sur les Candida
Excipients (100g)
Huile de vaseline épaisse
Entre C22 et C35 Mélange d’hydrocarbures saturés liquides, obtenus à partir de pétrole.
Excipient de surface pour les pommades hydrophobes.
Cire de polyéthylène
Dérivé pétrolier Conférer une consistance à la pommade.
Composition du médicament
Méthodes d’analyses microbiologiques du produit fini A partir de chaque lot, cinq échantillons sont prélevés et destinés à être examinés. L’évaluation de la propreté microbiologique passe par deux étapes principales à savoir la préparation des solutions, et l’isolement dans les milieux de cultures sélectifs.
1. Préparation de solutions (solution A)
Dissolvez 10g de Mycocide
®
90ml d’une solution peptonée au chlorure de sodium additionnée au
Tween (pH =7)
deux dilutions décimales.
2. Recherche de germes spécifiques
• Milieu d’enrichissement pour les Entérobactéries
(solution B) :Dissolvez 10 g de Mycocide
®
100ml de bouillon lactosé
incuber à 37°C pdt 2-5 heures.
• Milieu d’enrichissement pour S.aureus et
P.aeruginosa (solutionC) 10ml solution A
100ml de bouillon peptoné de caseine de soja
incubez à 37°C pdt 24h
3. Isolement des germes sur milieux sélectifsGermes recherchés
Milieu de culture Ensemencement Incubation Dénombrement
Germes aérobies viables totaux
gélose peptoné à la caséine soja pour les bactéries, et gélose Saboureaud pour les levures et moisissures
Ensemencer en profondeur 1ml de la solution A et de chaque dilution dans aux moins deux boites de pétri.
32 à 35°C pendant 2 à 5 jours pour les bactéries et à 25°C pendant 2 à 5 jours pour les levures et moisissures.
Comptage des colonies apparues à la surface des géloses en UFC/G
Entérobactéries et certaines autres
bactéries gram-
Bouillon Mossel Ensemencer 1ml de la solution B dans le bouillon Mossel à 3 dilutions décimales dans un milieu liquide
35 à 37°C pendant 18 à 24 heures
Méthode du nombre le plus probable (NPP)
Pseudomonas aeruginosa
Gélose Cetrimide Ensemencer en surface quelque goutte de la solution C
37°C pendant 72 heures
Comptage des colonies apparues à la surface de gélose en UFC/g
Staphylococcus aureus
Gélose Vogel Johnson Ensemencer en surface quelque goutte de la solution C
37°C pendant 24 heures
Peptone de viande 10gExtrait de viande 1g
NaCl 10gMannitol 10g
Rouge de phenol 0,025gSulfate de polymixine B 0,010g
Agar agar 12-14g
Tryptone 10g/lEtrait de levure 5g/lMannitol 10 g/lPhosphate dipotassique 5g/lChlorure de lithium 5g/lGlycine 10g/lTellurite de photassium à 10g/l 20mlRouge de phenol 0,0 25 g/lThiosulfate de sodium 0,60 g/lLecithine de soja 0,30 g/lTween R 80 2,5 g/lHistidine,Hcl 0,10 g/lAgar 17 g/l
Résultat des analyses microbiologiques du produit fini
N° de lot des germes
Recherchés1 2 3 4 5 NORMES (Pharmacopée
Européenne 2005)
Germes aérobies viables totaux 0 0 15 0 5 ≤ 500 UFC/g
Entérobactéries et certaines autres bactéries Gram-
<10 <10 <10 <10 <10 ≤ 50 UFC/g
Pseudomonas aeruginosa Absence Absence Absence Absence Absence Absence
Staphylococcus aureus Absence Absence Absence Absence Absence Absence
Une révélation d’une flore mycélienne appartenant au genre Penicillium et Mucor qui sont des germes saprophytes de l’environnement.
Résultats des tests d’identifications des germes trouvés dans l’air :
COLONIE ASPECT MACROSCOPIQUE
Aspect microscopique Le genre
Colonie 1 Colonie blanche, ronde, cotonneuse.
Thalle ramifié cloison. Penicillium
Colonie 2 Colonie marron, rhizoïde.
Thalle non cloisonné non ramifié avec tête
sphérique.
Mucor
1. Résultats d’identification macroscopique et microscopique des moisissures trouvés dans l’air.
Points de prélèvement
Germes identifiés UFC/boite %
Au dessus de la cuve de pesage des
huiles
S.SaprophyticusS.epidermidis
S.simulansStaphylococcus sp
Mucor
2017421
3731
16.663.71.85
Au dessus de la cuve de stockage
S.epidermidisS.Saprophyticus
S.simulansMucor
5243
31.2512.5
16.6618.75
Au dessus des remplisseuses des
tubes
S.epidermidisS.Saprophyticus
S.simulansS.intermedius
Staphylococcus sp
9210881
76.038.266.616.61
1
2. Répartition des germes trouvés dans l’air
Résultats des tests d’identification des germes trouvés chez le personnel
Zone de prélèvement
Opérateur UFC/5 doigts
Mains droite Mains gauche
Zone de production
Opérateur1 8 5
Opérateur2 6 16
Zone de conditionnement
Opérateur3 92 167
Résultats de dénombrement des germes trouvés chez le personnel
Les résultats révèlent la présence d’une charge microbienne importante chez l’opérateur n°3 du conditionnement qui peut être due à diverse manipulations effectuées par cet opérateur avec non respect des règles des BPF.
Les germes identifiés appartiennent aux genres Staphylococcus et Penicillium.
Conclusion:
D’après les résultats des analyses microbiologiques de produit fini, nous constatant l’absence totale de germes pathogènes (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus), et la présence non significative des germes aérobies viables totaux (bactéries, levures et moisissures), ce qui explique la bonne qualité microbiologique du produit, ce ci est due : - Au respect des bonnes pratiques de la fabrication. - A la composition de la pommade (présence d’antibiotiques). - L’efficacité du processus du nettoyage et de désinfection.
Le médicament est sensé guérir un mal et non pas l’engendrer, pour cela il doit satisfaire a l’attente légitime du consommateur concernant en particulier sa composition, sa teneur en substance actives, son identité, sa quantité, sa date de fabrication et de péremption, son mode d’utilisation Le contrôle microbiologique permet :
de garantir une bonne qualité hygiéniqueminimiser les pertes dues à des mauvaises
conditions de stockage et donc avoir le moins possible de produits non conformes.
garantir un bon rendement
Conclusion