Les carboxypeptidases B d’Anopheles gambiae impliquées
dans le développement de Plasmodium falciparum
Catherine Lavazec
Institut Pasteur Paris
Atelier Paludisme 2008
www.msf.fr
Cycle biologique de Plasmodium
14 heures : Formation des ookinètes
24 heures :Pénétration des ookinètes
48 heures : Initiation du développement des oocystes
Développement sporogonique de Plasmodium
D’après Riehle et al, 2003
Stratégies de blocage de la transmission
Moustiques transgéniques Vaccin bloquant la transmission
Homme
Moustique
gamétocytes
gamètes
zygote
ookinète
oocyste
Epitheliumdigestif
Anti-parasite
Anti-moustique
Shin et al, J. Exp. Biol., 2003
Intérêt d’un vaccin bloquant la transmission basé sur un antigène de moustique
- Protéine recombinante plus facile à produire
- Efficace sur différentes souches de parasites, résistantes ou non
- Peut affecter la survie et la fécondité des moustiques
Sélection d’un gèned’Anopheles gambiae
impliqué dans l’interactionavec Plasmodium falciparum
- 1 -
Differential display
1 : sang non parasité2 : sang + formes asexuées3 : sang + gamétocytes
1 2 3
Gene A
Gene B
Gene C
Gene D
Actine
Identification de gènes d’An. gambiae
RT-PCR semi-quantitative
Bonnet et al, 2001
+ argCPB
S arg S
Carboxypeptidase B (CPB)
48,2 kDa
CPBAg1(CarboxyPeptidase B Anopheles gambiae 1)
423 aa
35,9 kDa
Lavazec et al, Insect Mol. Biol., 2005
Protéine recombinante CPBAg1
10080604020
Activité(%
)
0 0 0,1 100 1000 µM
10080604020
Activité(%
)
00 0,1 10 1000 µM
1,10-Phenantroline GEMSA
1
0,8
0,6
0,4
0,2
HipArg HipLys HipPhe
Activité(unités/mg)
0
HipArg :Km = 2,6 mM
kcat = 79,2 sec-1
ACTIVITE CPB
Lavazec et al, Insect Mol. Biol., 2005
Les carboxypeptidases Bd’Anopheles gambiae
- 2 -
5 CPB
5 CPA
13 séquencesFonction?
5 CPB putatives chez An. gambiae
Famille de carboxypeptidases
cpbAg1 VFMDGGIHAREWAGV--WRKNRSPGNVLCYGVDLNRNFP--YLAVHTYGEMIL--NSADILYTASGATDDYAYS-LGVPYSYTLELTGGGSQG--FDL--QTFELLKVFGQHAGTLSVTS
cpbAg2 VFVDAGIHAREWAAP--WRKTRRPAGRNCVGVDGNRNYD--YLSLHTYGQYLL--SSTNVLYAAAGGSDDYAYAVADVPISMTMELPGGGSQG--FNP--ETFVGVRAMALEVARNYS--
cpbAg3 VFIDGGIHAREWAGV--WRKNRFPATILCTGIDLNRNWD--YLAVHTYGDMIL--NSAEILYTANGCSDDYVAGVIGARYAYTLELTGGGRNG--FDL--QTFQIYRTMANNA-------
cpbAg4 IWMDGGIHAREWISP--WRKNRGGLQYGCAGVDLNRNYG--FLTFHSYGQYIL--PSGSTLYPAAGGSDDWARGALNIKYAYTVELRDTGRYG--FVL--EAVAFVDIIAQEV-------
cpbAg5 VFIDGGIHAREWAGV--WRKNRSPGNVLCYGVDLNRNFP--YLAVHTYGEMIL--NSADILYTASGATDDYAYS-LGVPYSYTLELTGGGSQG--FDL--QT------------------
cpaAg1 VFLEGGIHAREWISP--WRKTRKAYGPFCYGADPNRNWD--YIAFHSYSQLLL--NVYDAIYPASGSSVDWSYGAQDVKIAYTYELRPDGDAWNGFVL--ETLDSLITLLEESSARGYYDEKH
cpaAg2 IFIEANIHAREWISS--WRKTRQPVNALCVGADPNRNFD--QFSFHSYGQYLL--NSASVLYTTSGSTVDYFVGVHGTKLGFTFEFRDTGAT--GFVL--ETLNGIIAFVAEAKTLGYV----
cpaAg3 IFIESNIHAREWITS--WRKNRYPHNVLCYGVDMNRNFP--YLSFHSYGQYIL--TTADVLYIASGSSPDWAHGTHGTPVAATFEFRDNGYH--GFIL--EVLDGLVAFCRKGKELGHLTV--
cpaAg4 IVVEGGIHAREWISP--WRKNRKPYG-LCRGVDLNRNFD--YIALHSYSQLLM--SKYETIYPSSGGSIDWAYRPGGVPVSLTFELRGPPDSTDMFIL--ETLAAFVAIVQEAARLGYYDS--
cpaAg5 VFVVANMHAREWAAM--WRKNRAPQQDNALGVDLNRNFG--FVDLHTYGEYIL--TPPQLLYAVSGSSLDYCYSV-GVKACIAIEL---TGD--GFEI--EALAAVQAM--------------
cp-like1 VLVDAGVHAREWASH--WRKNRFAGNVMCVGTDVNRNFP--YLSLHSCGEYIL--ASGLL-YLATGSD-DFIYGAYGVQYAYTLELSCGNR-GYGFII--ETFEMMKVFGVHAGSLKISKRP
cp-like2 VFMEGTIHAREWISA--WRKTRSRQNVLCYGADPNRNWD--YLDFHASGQLLM--IAEII-YVASGSSLDWVKGTLQTPLTFAYELRDTG--EYGFLL--ETLDSVIVILEEGKAMGYH
cp-like3 VFVECGIHAREWISP--WRKNMQPYGVCRGVDL-NRNFA--YFSVHSFSQLVM--MIETI-YPSSGDSVDWVYSALGVPVAYTFELRGPPDSTNMFVL--ELLAAFIAMLGEATRLSYYDGERQEL
cp-like4 IIVVANLHAREWAAT--WRKNR----NSPLGIDLNRNFG--YVDLHTFGETIL--PAERS-FKESGSSIDYCFSLNIKACIAV-EL-TAGSYELQNNT--AVLTMAVYANAGNSPL
cp-like5 ILIDAGIHAREWITV--WRKTRRPLGPRHRRS--NRNFN--YLSLHSYAKAIL--ASTVLNRPVGGSSIDYAHDIEKVPVALVMEVASK-----GFHP--ESWIGIGAMVNCLASSFRSVLKGSGTLHLRZ
cp-like6 VFVVANMHAREWAAM--WRKNRAPQQDNATGVDLNRNFA--YVDLQTFGEYIL--GTLSD-LAHPVSGSSMDYCYFVG--
cp-like7 VFVEAGAHGHEWIGP--WSKNRSNHTQAHPAG--NRNWA--YLSLQAYGQLLA--YALEPVTGPATYGTATGYARYGAGIRYSYTLRLPDRGTHGFLL--DTLELL
cp-like8 IFVVANLNAREWAAM--WRKNRYPQTETEFGTDLNRNFD--YVDLQAYGEYLM--YLVGSAAELTKPAPGSSIDYCLSVGVKACIAMKL-TNRSYEIR--ALAAVQAMADKADEG
cp-like9 IFVVANLNAREWAAM--WRKNRAPQTVIDFGTDLNRNFD--YVDLQAFGEYLM--YLVGSAAE-IMKEASGSSIDYCLSVGVKACIAMKL-TSQGYE--QQALAAVQAMAVKADGG
cp-like10 VLVEAGLRAREWISP--WLKSRSVNGNGCFGVDLNRNFG--YPFSHSATTNPA--SIDFVAGTVQPDLVFTL------------ETGAGGN--YGYD--SETTYGFLTMAEYVANNK
cp-like11 VILVANLHAREWAAM--WSKNRSPQPNSRTFGVDNGNFG--YADMHTFGNHIF--GTSAHLFERTYGSSLDYCHSVGINVCLWFEL-----TNVGFQI--EAWAAITAMAVRANQIVDVFYPE
cp-like12 IFIESNIHAREWITS------
cp-like13 IIVIGNLQAREWVGM--WNKNRSPQSNANFGV--NFNNQ--VDLQGFGQLILM--DVGIASDYFPFAYGVCHDYCNAIGVKTCLTLRQ-TMQEYEIS--AFVAIHAMAEKSNLSNI
H RE R R H Y Y D E F
Expression des CPB chez An. gambiae
cpbAg1 et cpbAg2 sont les seuls gènes de CPB exprimés dans le tube digestif des Anopheles femelles
cpbAg1
cpbAg2
cpbAg3
cpbAg4
cpbAg5
Exprimé
Exprimé
Non Exprimé
Non Exprimé
Non Exprimé
ADNgNG NI Pf H20
Expression en présence de P. falciparum
Sang non parasité
Gamétocytes
Stades asexués14h
Ra tio d
’expre ssio n (%)
300
100
500
700
900
cpbAg1
300
100
500
700
900
24h
500
300
100
700
900
48h
cpbAg1 et cpbAg2 sont surexprimés spécifiquement en présence de gamétocytes
cpbAg2
14h
Ra tio d
’expre ssio n (%)
24h 48h
300
100
200
300
100
200
300
100
200
Lavazec et al, Infection and Immunity, 2007
Activité CPB in vivo
Activité CPB induitepar le repas de sang
ActivitéCPB
(mU/ TD)
Activité CPB modifiéeen présence de gamétocytesde P. falciparum
0 14h 24h 48h
5
4
3
2
1
0
- Corrélation entre l’expression des gènes et l’activité CPB
- Rôle dans le développement de Plasmodium falciparum?
Lavazec et al, Infection and Immunity, 2007
Le rôle de l’activité CPB dans le développement de Plasmodium
- 3 -
+ aaCPB
Anticorpsanti-CPBAg11
S aa S
2 S + aa+ Substratssynthétiques
CPB
3 + Arg / Lys
Activité CPB : - limite le developpement du parasite?- facilite le developpement du parasite?
Infections de moustiques sur le terrain
Technique de gorgement sur membrane
+ aaCPB
Anticorpsanti-CPBAg1
1
SS aa
% Inhibition activité CPB
14h PBM 54% +/- 924h PBM 36% +/- 848h PBM 33% +/- 11
M
Lavazec et al, Infection and Immunity, 2007
+ aaCPB
Anticorpsanti-CPBAg1
1
SS aa
Sérumpréimmun
Sérum anti-CPBAg1
Moustiques infectés (%)
100
80
60
40
20
0
95 % réduction de la prévalence d’infection
Lavazec et al, Infection and Immunity, 2007
Anticorpsanti-CPBAg1
activité CPB facilitele développementdu parasite?
1
Substrat clivé? Acides aminés libérés?
Le rôle est joué par :
+ aaCPB
SS aa
Hip + aa+ Hip-Arg+ Hip-Lys
2 Substratssynthétiques
+ aaCPB
SS aa
50
40
30
20
10
T - 0,01 mM 0,1 mM 1 mM
Prévalence d’infection(%
) Hippuryl - Arginine
Prévalence d’infection(%
)
50
40
30
20
10
T - 0,1 mM 1 mM 10 mM
Hippuryl - Lysine
L’activité CPB facilite le développement du parasite
aa+ aa
CPBSS aa
3 Acides aminés
+ Arginine
50
40
30
20
10
T - 0,1 mM 1 mM 10 mMPrévalence d’infection(%
) L - Arginine60
L’Arginine serait impliquée dans le développement parasitaire
Voies de synthèse de l’Arginine
Ornithine
Glutamate
Citrulline Argininosuccinate
Arginine
Anopheles gambiae
Plasmodium falciparum
Proline
Pyrroline-5-carboxylate
Apport exogène d’arginine indispensable pour Plasmodium
Le rôle de l’Arginine chez Plasmodium et Anopheles
L-Arginine
urée
Ornithine PolyaminesNO
citrulline
Arginine-phosphate
Défenses immunitaires
Réserves énergétiques
VitellogénèseMoustique
ADN polyméraseplasmodiale
Parasite
Régulation cycle cellulaire
Compétition entre le moustique et le parasite?
ArgArg PROTEINE
CPB
Le rôle des CPB dans l’interaction Plasmodium - Anopheles
-
Arg
ArgArg
+++
Arg
CPBAg1: une nouvelle cible pour un vaccin
bloquant la transmission ?
- 4 -
Immunogénicité de CPBAg1modèle : souris immunisées infectées
par Plasmodium berghei
(Ig)
2
1,5
1
0,5
Concentration (mg/ml)
G1 G2a G2b G3 M0
Total Ig
1/500
1/1000
1/2000
1/4000
1/8000
1/16000
1/32000
1,5
1
0,5
0
O.D.
Anti-CPBAg1 IgG
Control mice
CPBAg1 immunized mice
- CPBAg1 induit une réponse spécifique
-Isotypes G1 / G2b majoritaires
- Anticorps reconnaissent specifiquementCPBAg1 dans des extraits de tube digestifs
Lavazec et al, Infection and Immunity, 2007
Effet de l’immunisation anti-CPBAg1 sur le développement de P. berghei
Souris nonimmunisées
Souris immunisées
63 % de réduction de la prévalence d’infection
Prévalence d’infection (%
) 100
80
60
40
20
0
CPBAg1 peut induire des anticorps bloquant la transmission chez la souris
Lavazec et al, Infection and Immunity, 2007
Effet des anticorps anti-CPBAg1 sur la fécondité des moustiques
Anticorps anti-CPBAg1 réduisent la fécondite des moustiques
Lavazec et al, Infection and Immunity, 2007
Conclusions
1) CPBAg1 : 1ère CPB caractérisée chez An. gambiae
CPB: nouvelles cibles pour un vaccin anti-transmission de Plasmodium
2) Activité CPB dans le tube digestif : CPBAg1 et CPBAg2
3) En libérant de l’arginine, l’activité CPB facilite le développement de P.falciparum
4) Anticorps anti-CPBAg1 inhibent le développement de Plasmodium et réduisent la fécondité des anophèles
Unité de Biologie et Génétique du Paludisme
Bertrand BoissonIsabelle ThieryRachida TaharSabine Thiberge
Catherine BourgouinRobert Ménard
Paludologie AfrotropicaleUnité 77, IRD, Dakar
Christian Boudin
Unité d’immunologie moléculaire des parasites
Sarah Bonnet
PT5 - Production de protéinesrecombinantes et d’anticorps
Stéphane Petres
Unité d’immuno-physiopathologie infectieuse
Alain Cosson
CEPIA
Francois LacosteFondations des Treilles
CANAM, VIH/PAL