Laura Córdoba García Departamento de Estructura de Macromoléculas
CNB-CSIC, Madrid Jueves, 4 de Julio de 2013
Sunday, July 17, 2011 Sunday, July 17, 201
Parte 1: Adenovirus
- Patógeno en animales y humanos
- Virus icosaédricos sin envuelta
- ADN bicatenario lineal
- Fibras o espinas implicadas en la unión celular
Waehler R, et al. Nat Rev Gen, 2007
Fibra
Dominio globular
Dominio fibroso
Base pentona
CAR Integrina
Estudio estructural de las fibras:
- Identificación de receptores celulares
- Estabilidad de las fibras virales y
descubrimiento de nuevos
plegamientos
- Uso como vectores en terapia génica
Las fibras de los adenovirus
PAdV-4 fibre galectin domain bound to tri-N-acetyl-lactosamine
(Mastadenovirus) TAdV-3 fibre head
(Siadenovirus)
Determinación de la estructura del dominio cabeza de fibras de nuevos adenovirus
Dominio globular
Dominio fibroso
Base pentona
Snake adenovirus (SnAd1)
Farka S.L., et al. Virus Res, 2008
- Perteneciente al género Atadenoviridae
- Genoma compuesto por 27kbp
- Proteína de la fibra compuesta por 415 aminoácidos
Clonaje y mutagénesis dirigida
234:HISTAGPSPPSKTSLDIAEELQNDKGVSFAFQAREEELGAFTKRTLFAYSGDGLTGPFKAPASAELSSFLTAHPKGRWLIAFPLGTGIVSVDEGILTLEISRSLPEVGSGSSFYLTEK:345
234:HISTAGPSPPSKTSLDIAEELQNDKGVSFAFQAREEELGAFTKRTLFAYSGDGLTGPFKAPASAELSSFLTAHPKGRWLIAFPLGTGIVSVDEGIMTMEISRSLPEVGSGSSFYLTEK:345
Cambio de los aminoácidos leucina 322 y 324 por metionina
Ligación
Dominio C-terminal de la fibra de SnAd1 Quick change site-directed
mutagénesis kit (Agilent Technologies, Inc.)
Expresión, purificación y cristalización - Cepas de expresión: BL21(DE3) y BL834(DE3)
- Purificación en dos pasos:
columna de níquel cromatografía de intercambio iónico
14kDa
Proteína nativa
14kDa
Proteína mutada (SeMet)
Vista frontal Vista lateral SnAd1
hAd2
Estructura atómica
Myoviridae
Podoviridae
Siphoviridae
- Infectan bacterias - Genoma DNA de doble cadena - Cabeza icosaédrica - Cola especializada en la
inyección del DNA en la célula hospedadora
- Placa basal a la que se unen
una o más fibras responsables del primer reconocimiento celular Vessler D.,et al. MMBR 2011
Orden Caudovirales
Parte 2: Bacteriófagos
Escherichia coli fago T7
- Familia Podoviridae
- Lítico
- Cápsida icosaédrica , 40 kb DNA
- Cola corta no contráctil de 20-nm de longitud
- Seis fibras compuestas por la proteína gp17
Bo Hu, et al. Science 2011
Las fibras de T7 Dominio de
unión al virus Dominio proximal
Dominio distal
Dominio cabeza
Dominio pirámide
Cápsida
Fibra
Cola
Estudios estructurales de las fibras:
- Tipado de bacterias
- Terapia fágica
V482A F516A
S483A I517A
V484A A518L
N501A D520A
N502A S541A
S503A R542A
W504A S543A
Y515A
V544A
Todos los mutantes expresaron proteína soluble, lo que sugiere que debe plegarse correctamente
Mutaciones introducidas en gp17 usando el Quick change site-directed mutagénesis kit
(Agilent Technologies, Inc)
Identificación de aminoácidos implicados en la unión al receptor celular
Mutación amber (TAG)
• Introducción de un codón stop prematuro pérdida de la función de la proteína
• Virus con mutaciones amber infectan solo ciertas cepas bacterianas supresoras de amber
• Herramienta útil para la generación de fagos con proteínas recombinantes fácil aislamiento en cepas no supresoras
Introducción de la mutación amber en gp17
ATG GCT AAC GTA ATT AAA ACC GTT TTG ACT TAC CAG TTA GAT GGC TCC AAT CGT GAT TTT AAT ATC CCG M A N V I K T V L T Y Q L D G S N R D F N I P
T7 wild-type
T7_gp17 mutante amber ATG GCT AAC GTA ATT AAA ACC GTT TTG ACT TAC TAG TTA GAT GGC TCC AAT CGT GAT TTT AAT ATC CCG M A N V I K T V L T Y L D G S N R D F N I P
*
Construcción del mutante amber gp17 mediante recombinación homóloga
Transformación * su+ E. coli Cultivo de E. coli
recombinantes
Infección con wild-type T7
*
T7 DNA
*
Clonaje del gen mutado
Recombinación homóloga
108 cells/ml
Wild-type T7
Progenie
Amber T7
su+
su-
+ + + +
- + + +
Stock viral amber
Secuenciación
MOI=0.1
(1010 pfu/ml)
*
Generación de virus T7 con fibras mutadas mediante complementación
mRNA
Proteína de la fibra mutada
E. coli su-
T7 DNA
Complementación
* gp17Am
*
* *
* *
Transformación
Infección
Progenie
petDuet-1
108 cells/ml
Cultivo de E. coli recombinantes
E. coli su-
IPTG
Contaje de placas
16 fibras mutantes
Diluciones virus T7 amber Genotipo 10-7 10-8 10-9
Wt_exp+ 40 3 0
Null 0 0 0 V482A 47 6 0 S483A 0 0 0 V484A 0 0 0 N501A 0 0 0 N502A 44 5 0 S503A 39 0 0 W504A 0 0 0 W515A 0 0 0 F516A 0 0 0 I517A 0 0 0 A518L 0 0 0 D520A 0 0 0 S541A 0 0 0 R542A 48 6 0 S543A 0 0 0 V544A 0 0 0
Diluciones virus T7 amber
Genotipo 10-7 10-8 10-9
Wt_exp+ 68 6 2
Null 0 0 0 V482A 45 1 0
S483A 31 3 1
V484A 10 2 0
N501A 5 0 0
N502A 20 2 1
S503A 63 4 1
W504A 5 0 0
W515A 1 0 0 F516A 0 0 0 I517A 13 2 0
A518L 0 0 0 D520A 0 0 0 S541A 0 0 0 R542A 12 0 0 S543A 55 5 0 V544A 50 10 0
Infectividad de los mutantes en BLRDE3 and TOP10
BLRDE3 (E. coli B) TOP10 (E. coli K12)
Secuencia wild-typeT7 5’- CTGGCCCCGATGGAATCTACTTCATAGCCTCTGATGGTGGATGGTTACGA- 3’ Secuencia degenerada 5’- CTGGCCCCGATGGAATCTACTTCNNGNDNNWNNNRGGTGGATGGTTACGA- 3’
Mutaciones aleatorias en aminoácidos 517-520
Secuencia wild-typeT7 5’-TCGGATTCAAGAATATTGCAGACAGTCGTTCAGTACCTAATGCAATCATGG- 3’ Secuencia degenerada 5’- TCGGATTCAAGAATATTGCAGACNDNNHNNWNNVNCCTAATGCAATCATGG- 3’
R=AG , W=AT, D=AGT, H=ACT, V=ACG, N=ACGT
Mutaciones aleatorias en aminoácidos 541-544
Construcción de una librería de fagos T7 con mutaciones aleatorias en la fibra
PRIMERS DEGENERADOS
Construcción de una librería del gen gp17
Librería del gen gp17
* * * *
Transformación
wt gp17 wt gp17
Mutante 517-520
E. coli BL21
E. coli BL21
E. coli BL21
E. coli BL21
E. coli BL21
Mutante 541-543
Pool 517-520
Pool 540-544
Producción de virus mutantes mediante recombinación homóloga
Cultivo de bacterias recombinantes
Infección con el mutante amber gp17
*
T7 DNA
Recombinación homóloga
*
*
* * *
*
E. coli BL21
E. coli BL21
E. coli BL21
E. coli BL21
E. coli BL21
E. coli BL21
Acknowledgements
Mark van Raaij lab (CNB-CSIC) - Abhimanyu Kumar Singh - Marta Sanz - Carmela Garcia-Doval - Meritxell Granell - Thanh Hong Nguyen